αB-Crystallin在非小細(xì)胞肺癌增殖遷移中 的作用及其臨床意義

古 杰 胥豐愷 祝巧良 王 琳 葛 棣 盧春來

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科 上海 200032)

肺癌是全球發(fā)病率、死亡率雙第一的惡性腫瘤[1]。據(jù)我國國家癌癥中心的最新數(shù)據(jù)顯示,肺癌仍然穩(wěn)居我國腫瘤排行榜單第1位,肺癌的死亡率在40%以上,遠(yuǎn)超其他腫瘤[2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)包括肺鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌等,占據(jù)肺癌每年新增病例的2/3以上,其中近70%確診病例為晚期患者,并伴有腫瘤轉(zhuǎn)移,5年生存率低于5%[3]。鑒于NSCLC已然成為威脅全民生存健康的共同問題。目前肺癌的治療手段包括化療、放療、靶向藥物、手術(shù)及免疫治療,然而總體治療效果并不理想,患者最終死于肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此,深入研究肺癌發(fā)生、發(fā)展及其侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制,進(jìn)一步尋找新的治療靶點(diǎn),以期在早期階段有效控制肺癌生長,同時牽制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移,可能為緩解我國居高不下的肺癌發(fā)病及死亡率,提高患者的生存率,提供新的思路。

αB-Crystallin屬于小熱休克蛋白家族,最早在脊椎動物晶狀體內(nèi)發(fā)現(xiàn),后發(fā)現(xiàn)在多種組織內(nèi)均有表達(dá)[4-6]。αB-Crystallin功能廣泛,具有分子伴侶作用,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和血管新生等多種生命活動發(fā)揮重要作用[7-8]。已報道αB-Crystallin在多種腫瘤內(nèi)表達(dá)異常,如喉癌、腎透明細(xì)胞癌、乳腺癌等,其表達(dá)異常與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)[9-11]。本文通過細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究其在NSCLC增殖遷移中的作用,進(jìn)一步通過免疫組化技術(shù),探討其與NSCLC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

材 料 和 方 法

細(xì)胞培養(yǎng)人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549 (中國科學(xué)院細(xì)胞庫),培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、2 μmol/L 谷氨酰胺、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,放置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

RNA干擾A549細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時,將細(xì)胞消化后鋪板,待細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%時,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法給予細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染以下調(diào)胞內(nèi)αB-Crystallin的水平,轉(zhuǎn)染方法按照Lipo2000說明書,針對αB-Crystallin的mRNA不同靶點(diǎn)設(shè)計siRNA,其中si-αB-Crystallin-1的靶序列為:5’-TTGCCATTAATAGAGACCTCAAA-3’,si-αB-Crystallin-2的靶序列為:5’-GCCATTAA-TAGAGACCTCAAACA-3’。siRNA-NC為非特異性非相關(guān)的RNA片段,作為對照組。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞,按照5 × 104個/孔的密度將A549細(xì)胞置于24孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h后經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA,轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。 具體如下:將細(xì)胞重懸并用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗去除血清,之后將細(xì)胞重懸于200 μL無血清DMEM培養(yǎng)液,并接種于Transwell上室(8 μm 聚碳酸酯膜,6.5 mm 小室,美國Costar公司),下室內(nèi)加入600 μL含20%血清的DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后取出上室,用棉簽擦去上室培養(yǎng)液與未穿透的細(xì)胞,并用4%多聚甲醛室溫固定20 min,之后以0.4% 結(jié)晶紫染色15 min,清洗去除多余染液后,放置于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野統(tǒng)計細(xì)胞遷移數(shù)量。

CCK-8檢測細(xì)胞活力按照5×103個/孔的密度,將A549細(xì)胞置于96孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h,轉(zhuǎn)染siRNA,分別在轉(zhuǎn)染后0、24、48、72、96 h進(jìn)行細(xì)胞活力檢測,具體步驟按照CCK-8說明書進(jìn)行:將CCK-8試劑與無血清培養(yǎng)液進(jìn)行1∶9混合,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,分別于對應(yīng)孔中加入100 μL CCK-8混合液,37 ℃孵育1～2 h,采用酶標(biāo)儀檢測450 nm的吸光值(D),計算并統(tǒng)計細(xì)胞相對增殖活力。

細(xì)胞總蛋白提取與Westernblot檢測siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞總蛋白。具體如下:將細(xì)胞培養(yǎng)液去除,加入遇冷的PBS清洗2遍,加入含有蛋白酶抑制劑(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)的裂解液,放置于冰上裂解細(xì)胞10 min。用細(xì)胞刮刀刮下裂解的細(xì)胞,將其轉(zhuǎn)移至離心管中,4 ℃ (13.8×g)離心10 min后取上清液,獲得總蛋白。在總蛋白溶液中加入SDS加樣緩沖液,100 ℃煮沸10 min,以使蛋白變性,獲得用于Western blot檢測的總蛋白樣品。將5～10 μg樣品加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上樣孔,電泳分離蛋白樣品,蛋白分離后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。 轉(zhuǎn)印后使用TBST(Tris-Hcl,NaCl,Tween-20)溶液配制的5%脫脂牛奶封閉液于室溫下封閉PVDF膜2 h,不洗直接加入對應(yīng)一抗,并放置于4 ℃孵育過夜。過夜后以TBST洗滌PVDF膜4次,每次10 min,之后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1.5 h,以TBST洗滌4次后,采用ECL試劑顯色。應(yīng)用抗體如下:β-actin (1∶5 000,HRP-60008,美國Proteintech公司);αB-Crystallin (1∶1 000,ab13497,美國Abcam公司)。

組織標(biāo)本選取2005年在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科行根治性手術(shù)的208例肺癌患者石蠟標(biāo)本,收集患者臨床病理資料,包括病理類型、年齡、性別、是否吸煙(連續(xù)或累計吸煙6個月或以上),腫瘤大小、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)。將208例患者癌及癌旁組織制作組織芯片[12]。

免疫組化組織芯片經(jīng)加熱及二甲苯常規(guī)脫蠟后經(jīng)梯度乙醇及蒸餾水水化,之后使用檸檬酸抗原修復(fù)液對其進(jìn)行微波修復(fù),修復(fù)后經(jīng)PBS漂洗4次,每次5 min,去除修復(fù)液。 滴加3% H2O2,室溫孵育15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶,經(jīng)4次PBS漂洗后滴加山羊血清封閉液,室溫孵育1 h。之后加入經(jīng)山羊血清封閉液稀釋的αB-Crystallin一抗 (1∶100,ab13497,美國Abcam公司),4 ℃孵育過夜,過夜后PBS漂洗4次,每次5 min,漂洗后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,經(jīng)PBS漂洗4次,每次5 min,漂洗后滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色液,于顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)程度,之后進(jìn)行蘇木精復(fù)染,并經(jīng)梯度酒精脫水,二甲苯透明后,使用中性樹膠封片,以備后續(xù)閱片及存儲。

染色結(jié)果判定免疫組化染色后由2名醫(yī)師獨(dú)立閱片,閱片方法采取隨機(jī)選取5個高倍視野(×400),結(jié)果判定方法參照既往文獻(xiàn)進(jìn)行[13],即根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評判。染色強(qiáng)度:全陰性計0分,輕度染色計1分,中度染色計2分,強(qiáng)染色計3分;陽性比例:全陰性計0分;陽性比例1%～29%,計1分;陽性比例30%～59%,計2分;陽性比例≥60%,計3 分。按陽性細(xì)胞比例×染色強(qiáng)度評分,≤3分計為低表達(dá),>3分計為高表達(dá)。

統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計軟件為SPSS 13.0。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)每項(xiàng)重復(fù)3次,采用t檢驗(yàn)比較差異有無統(tǒng)計學(xué)意義。不同分組間比較用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。多因素分析采用Cox多因素回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

下調(diào)αB-Crystallin表達(dá)水平抑制NSCLC增殖和遷移能力轉(zhuǎn)染SiRNA-αB-Crystallin后,A549細(xì)胞系中αB-Crystallin的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖1A);CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:干擾αB-Crystallin后48 h起增殖能力顯著低于對照組(P<0.05,圖1B)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:干擾αB-Crystallin后,A549細(xì)胞系的遷移能力較對照組顯著下降(P<0.05,圖1C)。

NSCLC組織中αB-Crystallin表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系分析208例NSCLC組織標(biāo)本中αB-Crystallin表達(dá)的表達(dá)情況,αB-Crystallin表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖2),根據(jù)上述評分標(biāo)準(zhǔn)判斷:高表達(dá)106例(51.0%),低表達(dá)102例(49.0%)。癌旁組織中僅22例為高表達(dá)(10.5%),腫瘤組織中的αB-Crystallin表達(dá)明顯高于正常癌旁組織。αB-Crystallin表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05,表1),而與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、腫瘤分化程度及分期無明顯相關(guān)性。

αB-Crystallin表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier曲線(圖3)顯示,αB-Crystallin高表達(dá)組患者術(shù)后總生存時間明顯低于αB-Crystallin低表達(dá)組,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。單因素分析結(jié)果顯示腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期 和αB-Crystallin表達(dá)水平為NSCLC不良預(yù)后因素(P<0.01)。多因素分析結(jié)果顯示腫瘤的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和αB-Crystallin表達(dá)水平為NSCLC獨(dú)立不良預(yù)后因素(P<0.05,表2)。

A:The effect of the knockdown was validated through Western blot analyses.B:The proliferation ability was assessed with CCK-8 assay at 24,48,72,and 96 hours after transfection.C:The migration ability was assessed with Transwell (original magnification,×100).(1)P<0.01,(2)P<0.001.

圖1下調(diào)αB-crystallin后A549細(xì)胞系遷移與增殖能力下降
Fig1InterferenceofαB-crystallinexpressionimpairedthemigrationandproliferationofA549cells

A and B:The HE staining of normal lung tissues.C-F:The HE staining of lung cancer tissues.G and H:Negative expression of αB-crystallin in normal lung tissues.I and J:High αB-crystallin expression.K and L:Low αB-crystallin expression (A,C,E,G,I and K:×100; B,D,F,H,J and L:×400).

圖2 αB-crystallin在NSCLC組織及癌旁組織內(nèi)的表達(dá)Fig 2 Immunohistochemical staining for αB-crystallin in NSCLC tissues and normal lung tissues

aPvalue was analyzed by squamous cell carcinomavs.adenocarcinomas;bOther including adenosquamous carcinoma,large-cell carcinoma,mucoepidermoid carcinoma and carcinosarcoma.

圖3 αB-crystallin表達(dá)與患者總生存期關(guān)系Fig 3 Prognostic signicance assessed by Kaplan-Meier survival estimates and log-rank tests

討 論

肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,盡管多種因素被報道可以誘導(dǎo)肺癌的發(fā)生發(fā)展,但是遺傳基因的異常仍然被認(rèn)為是誘導(dǎo)肺癌產(chǎn)生的根本原因[14]。目前已發(fā)現(xiàn)肺癌中存在多種基因突變或過表達(dá),由此驅(qū)動了肺癌的研究進(jìn)展,其中最著名的是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的突變。在我國非吸煙女性患者中約有50%～60%的病例攜帶有EGFR突變位點(diǎn)[15]。針對EGFR基因突變的靶向藥物,也已成功用于肺癌的臨床治療。然而,患者耐藥的不斷產(chǎn)生以及非突變患者無靶向藥物的臨床現(xiàn)狀,提示肺癌發(fā)病的機(jī)制還需要更深層的解析,也迫使我們?nèi)で蟾鼮橛行У闹委煵呗院桶悬c(diǎn)。在本研究中,我們 發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中顯著上調(diào)的αB-Crystallin與患者的生存具有顯著負(fù)相關(guān)性,通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)了下調(diào)αB-Crystallin,可抑制肺癌細(xì)胞的增值和遷移,提示其可能在肺癌臨床治療中具有潛在的應(yīng)用價值。

表2 NSCLC患者預(yù)后的單因素及多因素分析Tab 2 Univariate and Multivariate analysis of factors associated with OS in NSCLC patients

OS:Overall survival.

αB-Crystallin可被氧化應(yīng)激、缺氧等外界刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生。其相對分子質(zhì)量(Mr)為20 000,可輔助蛋白質(zhì)正確折疊、移位,抑制蛋白的變性降解,進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡、細(xì)胞衰老等多種病理生理過程,在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要保護(hù)性作用[6]。以往研究顯示,αB-Crystallin的表達(dá)在多種腫瘤中存在異常,并與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,患者生存密切相關(guān)。Mao等[16]通過免疫組化檢測109例喉癌組織內(nèi)αB-Crystallin的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)αB-Crystallin的表達(dá)與喉癌患者腫瘤分化及不良預(yù)后密切相關(guān)。Malin等[17]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者αB-Crystallin高表達(dá)與患者腦轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Shi等[18]發(fā)現(xiàn)αB-Crystallin通過促進(jìn)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換促進(jìn)了結(jié)腸癌的進(jìn)展。我們通過對208例NSCLC患者癌組織及癌旁組織中的αB-Crystallin蛋白的表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn),αB-Crystallin在癌組織內(nèi)的表達(dá)顯著高于癌旁組織,并可作為NSCLC的獨(dú)立不良預(yù)后指標(biāo),與前述研究相一致。同時我們發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中有較高的αB-Crystallin表達(dá)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是肺癌轉(zhuǎn)移的一個重要途徑,也是影響患者術(shù)后生存的重要因素。雖然患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可經(jīng)術(shù)后輔助化療、放療等手段得到明顯控制,但后期復(fù)發(fā)率依然很高。我們的結(jié)果提示αB-Crystallin可能參與了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程,因此,抑制αB-Crystallin的表達(dá)有可能成為抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新途徑。

增殖和遷移是腫瘤細(xì)胞的兩個重要生物學(xué)特征。Goplen等[19]發(fā)現(xiàn)αB-Crystallin抑制膠質(zhì)細(xì)胞瘤的凋亡,促進(jìn)了腫瘤的增殖。Huang等[11]發(fā)現(xiàn)αB-Crystallin在肝癌內(nèi)表達(dá)升高,αB-Crystallin與14-3-3ζ結(jié)合,抑制了后者的降解,通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)了腫瘤遷移。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)降低αB-Crystallin表達(dá)水平,NSCLC細(xì)胞系的增殖活力下降,遷移能力均降低,結(jié)果表明αB-Crystallin調(diào)控肺癌進(jìn)展的機(jī)制,可能主要是影響了肺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

因此,鑒于αB-Crystallin對NSCLC生長及細(xì)胞遷移的顯著調(diào)控作用,可作為潛在干預(yù)靶點(diǎn),通過調(diào)節(jié)αB-Crystallin的表達(dá),可能有效控制肺癌進(jìn)展。αB-Crystallin在208例腫瘤患者中均表現(xiàn)為不同程度的表達(dá)上調(diào),而且并不依賴于吸煙這一導(dǎo)致EGFR等多基因突變的關(guān)鍵因素,提示其調(diào)節(jié)腫瘤生長的作用可能具有個體廣泛性和獨(dú)立于其他靶點(diǎn)的特性,這對于無EGFR突變的肺癌患者的靶向治療帶來了希望,并可能改善目前靶向藥耐藥的臨床現(xiàn)狀。通過開發(fā)針對αB-Crystallin的靶向抑制劑,聯(lián)合已有的靶向藥治療,可能成為提高NSCLC整體療效、緩解肺癌惡化的新策略。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] TORRE LA,BRAY F,SIEGEL RL,etal.Global cancer statistics,2012[J].CACancerJClin,2015 ,65(2):87-108.

[2] ZHENG R,ZENG H,ZHANG S,etal.Estimates of cancer incidence and mortality in China,2013[J].ChinJCancer,2017,36(1):66.

[3] FERLAY J,SHIN HR,BRAY F,etal.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].IntJCancer,2010,127(12):2893-2917.

[4] DUBIN RA,WAWROUSEK EF,PIATIGORSKY J.Expression of the murine alpha B-crystallin gene is not restricted to the lens[J].MolCellBiol,1989 ,9(3):1083-1091.

[5] MALIN D,PETROVIC V,STREKALOVA E,etal.αB-crystallin:Portrait of a malignant chaperone as a cancer therapeutic target[J].PharmacolTher,2016,160:1-10.

[6] CARVER JA,GROSAS AB,ECROYD H,etal. The functional roles of the unstructured N- and C-terminal regions in αB-crystallin and other mammalian small heat-shock proteins[J].CellStressChaperones,2017,22(4):627-638.

[7] ITO H,KAMEI K,IWAMOTO I,etal.Regulation of the levels of small heat-shock proteins during differentiation of C2C12 cells[J].ExpCellRes,2001,266(2):213-221.

[8] DIETERICH LC,HUANG H,MASSENA S,etal.αB-crystallin/HspB5 regulates endothelial-leukocyte interactions by enhancing NF-κB-induced up-regulation of adhesion molecules ICAM-1,VCAM-1 and E-selectin[J].Angiogenesis,2013,16(4):975-983.

[9] HO PY,CHUEH SC,CHIOU SH,etal.alphaB-Crystallin in clear cell renal cell carcinoma:Tumor progression and prognostic significance[J].UrolOncol,2013,31(7):1367-1377.

[10] MOYANO JV,EVANS JR,CHEN F,etal. AlphaB-crystallin is a novel oncoprotein that predicts poor clinical outcome in breast cancer[J].JClinInvest,2006,116(1):261-270.

[11] HUANG XY,KE AW,SHI GM,etal.αB-crystallin complexes with 14-3-3ζ to induce epithelial-mesenchymal transition and resistance to sorafenib in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2013,57(6):2235-2247.

[12] 古杰.C5aR在非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制研究[D].復(fù)旦大學(xué),2013:36-37.

[13] 盧春來,紀(jì)元,葛棣.CXCR4在食管鱗形細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J].復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2008,35(2):224-227.

[14] POPPER HH.Progression and metastasis of lung cancer[J].CancerMetastasisRev,2016 ,35(1):75-91.

[15] XIA N,AN J,JIANG QQ,etal.Analysis of EGFR,EML4-ALK,KRAS,and c-MET mutations in Chinese lung adenocarcinoma patients[J].ExpLungRes,2013,39(8):328-335.

[16] MAO Y,ZHANG DW,LIN H,etal.Alpha B-crystallin is a new prognostic marker for laryngeal squamous cell carcinoma[J].JExpClinCancerRes,2012 ,31:101.

[17] MALIN D,STREKALOVA E,PETROVIC V,etal.αB-crystallin:a novel regulator of breast cancer metastasis to the brain[J].ClinCancerRes,2014 ,20(1):56-67.

[18] SHI C,YANG X,BU X,etal.Alpha B-crystallin promotes the invasion and metastasis of colorectal cancer via epithelial-mesenchymal transition[J].BiochemBiophysResCommun,2017 ,489(4):369-374.

[19] GOPLEN D,BOUGNAUD S,RAJCEVIC U,etal.αB-crystallin is elevated in highly infiltrative apoptosis-resistant glioblastoma cells[J].AmJPathol,2010 ,177(4):1618-1628.