不同放牧強度下土壤氨氧化和反硝化微生物的變化特征

孫翼飛,沈菊培,*,張翠景,韓國棟,紅 梅,趙巴音那木拉,賀紀正

1 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室,北京 100085 2 中國科學院大學,北京 100049 3 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生態(tài)環(huán)境學院,呼和浩特 010019

放牧是草地生態(tài)系統(tǒng)主要的土地利用方式之一,動物的采食、踐踏和排泄等行為直接或間接的影響草地植物群落組成。有研究表明,放牧顯著降低了植物地上生物量,進而影響植物對土壤氮素的吸收,降低生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力[1],且不同放牧強度下地上植物生產(chǎn)力及植物群落組成有顯著變化[2]。植物是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的紐帶,地上植物生物量、豐度及多樣性的變化勢必會影響地下生態(tài)系統(tǒng)功能及元素循環(huán)過程[3-4]。因此,放牧會直接或間接的影響土壤微生物代謝、生長和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等。Xie和Wittig研究發(fā)現(xiàn),隨著放牧強度的增加,土壤有機質(zhì)、有機氮含量顯著降低[5]。輕度放牧會增加土壤總氮含量,促進土壤氮素循環(huán),有利于提高土壤肥力,而重度放牧會降低土壤有效氮含量,從而影響植物氮吸收[6]。放牧對植物生產(chǎn)力、土壤環(huán)境及氮素循環(huán)的影響已有大量的研究[7-8],而參與氮循環(huán)的土壤微生物對放牧強度的響應機制還不十分明確[9]。

氨氧化作用是土壤硝化作用的限速步驟,是氮循環(huán)過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10];氨氧化過程的產(chǎn)物硝酸鹽通過反硝化作用還原為一系列氮氧化氣體和氮氣,進而導致土壤氮素的損失及溫室氣體排放增加[11-12],加劇全球氣候變化。土壤硝化及反硝化功能微生物在氮素可利用性、硝酸鹽淋溶和氮氧化氣體排放等方面起著關(guān)鍵作用。有研究表明,放牧顯著降低了荒漠草原氨氧化及反硝化微生物功能基因豐度,進而顯著影響土壤中可利用氮含量及生態(tài)系統(tǒng)氮素流失[11]。輕度放牧可顯著刺激地下微生物活性,而中度和重度放牧通過改變土壤異養(yǎng)呼吸、礦化和硝化過程,進而影響土壤氮庫[13- 15]。理解放牧對微生物介導的氨氧化過程和反硝化過程的影響及其反饋有助于認識草地生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)過程及其對人類活動及氣候變化的響應機制,為草地生態(tài)系統(tǒng)恢復及合理開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

北方溫帶草原是我國重要的生態(tài)屏障,在涵養(yǎng)水源、防風固沙、調(diào)節(jié)氣候、維持生物多樣性和提供畜牧產(chǎn)品等方面發(fā)揮著不可替代的作用。近幾十年來,我國草地不同程度地存在著過度放牧現(xiàn)象,草地退化嚴重。本研究依托于內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學院四子王旗試驗基地不同放牧強度的試驗,分析放牧強度對土壤理化性質(zhì)、氨氧化細菌(ammonia oxidizing bacteria, AOB)和氨氧化古菌(ammonia oxidizing archaea, AOA)微生物(amoA基因)及反硝化(如nosZ基因)功能微生物豐度、群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響,以探索草地生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物對放牧干擾的響應機制。

1 材料與方法

1.1 試驗樣地與設計

試驗樣地位于內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學院四子王旗試驗基地(41°47′17″ N,111°53′46″ E),年平均氣溫在3.4 ℃,年平均降水量在110—250 mm之間。試驗區(qū)植被屬短花針茅荒漠草原的地帶性植被,草場處于半干旱草原和干旱半荒漠草原地帶。草地植物群落類型為短花針茅+冷蒿+無芒隱子草[16]。

放牧試驗開始于2004年,整個試驗區(qū)分為12個小區(qū),劃分為3個區(qū)組,每個區(qū)組有對照區(qū)、輕度放牧區(qū)、中度放牧區(qū)和重度放牧區(qū)4種處理,每個處理3個重復。各小區(qū)位置完全隨機分布,面積為4.40 hm2。放牧載蓄率分別為對照0只/hm2、輕度放牧0.93只/hm2、中度放牧1.82只/hm2、重度放牧2.71只/hm2[17]。供試羊為當?shù)爻赡昝晒鹏裳?每年總放牧期為6個月,放牧從6月初開始,到11月末結(jié)束。試驗區(qū)綿羊每3年更換一次。

土壤采集于2014年5月底。每個小區(qū)以“S”形采集9個樣點,每個采樣點用直徑5 cm的土鉆取0—20 cm土壤,混合后作為該小區(qū)供試土樣。剔除土壤中可見的石塊和動植物殘體后,土樣帶回實驗室過2 mm篩后一部分保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于分子生物學分析;另一部分土樣自然風干,用于測定土壤基本化學性質(zhì)。

1.2 土壤基本理化性質(zhì)和微生物活性測定

硝化潛勢及反硝化酶活性的測定分別采用氯酸鹽抑制法[11]和乙炔抑制法[12],主要步驟同文獻[18]。土壤異養(yǎng)呼吸是指微生物分解土壤有機質(zhì)后釋放CO2的過程,其測定方法如下：稱量10 g新鮮土壤加入到120 mL血清瓶中,在25 ℃條件下培養(yǎng)24 h, 用氣相色譜儀(Agilent 7890A GC System)測定產(chǎn)生的CO2濃度[19]。

1.3 土壤DNA提取和實時定量PCR

稱取0.25 g凍干土,按照PowerSoilTMTotal DNA Isolation試劑盒(Mo Bio Laboratories, Inc., San Diego, CA, USA)所提供的方法提取土壤DNA。采用NanoDrop分光光度計(NanoDrop Technologies, USA)測定DNA的濃度和純度。DNA樣品存儲在-20 ℃,10倍稀釋后用作下游分子實驗的模板。

AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因的定量測定在iCycler iQ5儀器(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)上完成,使用的引物和擴增條件如表1所示。采用SYBR GREEN作為熒光標記,反應體系為25 μL,包含12.5 μL 2 x SYBR Premix Ex TaqTM(Takara Biotechnology, Japan),前后引物各0.5 μL(10 μmol/L),2 μL的DNA模板(1—10 ng),其余用滅菌水補足。用于標準曲線的質(zhì)粒制備和提取參照之前文獻中發(fā)表的方法[23],十倍連續(xù)稀釋的質(zhì)粒用于構(gòu)建定量PCR的標準曲線,所有基因的擴增效率均保證在85%—98%之間,R2為0.99。利用溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳確保擴增的特異性。

1.4 末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)

采用末端限制性片段長度多態(tài)性(Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)方法來評估放牧強度對AOA-amoA,AOB-amoA和nosZ基因群落結(jié)構(gòu)的影響。其原理是用熒光標記目標DNA片段的末端(5′端),酶切后產(chǎn)生長度不等的末端限制性長度片段(T-RFs),經(jīng)測序后輸出帶有T-RFs長度大小及熒光強度的圖譜,圖譜含有的波峰越多,表明微生物種類越豐富[24]。通過對不同樣品圖譜間波峰的比較,可得到各功能基因群落結(jié)構(gòu)和多樣性在處理間的差異。土壤DNA的PCR擴增采用表1所列引物,其中正向引物的5′末端用6-carboxyfluorescein(FAM)標記熒光用于T-RFLP研究。PCR產(chǎn)物用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒(Promega, USA)純化。選取適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切純化后的產(chǎn)物,即AOA-amoA和nosZ基因采用的內(nèi)切酶是HhaI(TaKaRa Biotechnology, Japan),AOB-amoA基因采用內(nèi)切酶MspI(Takara Biotechnology, Japan)。反應體系為20 μL,包括酶(4 U)和DNA樣品(約500 ng),在37 ℃下酶切3 h。反應產(chǎn)物送至測序公司(TSINGKE, Beijing),利用ABI PRISM 3700 DNA分析儀(Applied Biosystems, USA)進行毛細管電泳,檢測酶切片段。使用GeneMarker軟件(SoftGenetics, USA)分析得到的圖譜,合并長度相差1 bp的片段。T-RFs的相對豐度用每個片段的峰面積除以總的峰面積表示,相對豐度不到1%的片段未參與計算。

表1 PCR所用的引物序列和反應條件

(nosZ-F+nosZ2R) 用于nosZ基因的T-RFLP分析

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同放牧強度對土壤理化性質(zhì)和微生物活性的影響

不同放牧強度對土壤理化性質(zhì)和微生物活性的影響見表2。隨放牧強度的增加,土壤pH波動范圍為7.90—8.18,在中度放牧處理中顯著增加(P=0.03)。放牧處理顯著增加了土壤銨態(tài)氮含量(P=0.02),其含量變化范圍為6.37—35.92 mg/kg,且在重度放牧處理中最高。不同放牧強度土壤異養(yǎng)呼吸相比未放牧處理均顯著降低(P=0.02),波動范圍為1.54—4.70 μL CO2g-1d-1。隨放牧強度增加,土壤含水量、有機碳、硝態(tài)氮、硝化潛勢和反硝化酶活性無顯著影響。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),土壤pH與土壤呼吸顯著負相關(guān)(ρ=-0.66,P=0.02)。

2.2 不同放牧強度對氨氧化和反硝化功能基因豐度的影響

應用定量PCR技術(shù)測定土壤氨氧化菌AOA-amoA、AOB-amoA基因及反硝化細菌nosZ基因的豐度(圖1)。不同放牧強度下AOA-amoA基因豐度無顯著差異(P=0.26),基因豐度范圍為每克干土(4.94—7.60)×109個拷貝數(shù)。放牧強度對AOB-amoA(P=0.04)和nosZ(P=0.03)基因豐度有顯著影響。AOB-amoA基因豐度波動范圍為每克干土(0.68—3.75)×106個拷貝數(shù),且在中度放牧處理中最低,與未放牧處理相比降低了18.1%。nosZ基因豐度范圍為每克干土(2.49—5.78)×108個拷貝數(shù),且在輕度放牧處理中最低,與未放牧處理相比降低了57.6%。

表2 不同放牧強度下土壤理化性質(zhì)與微生物活性

同一行數(shù)據(jù)后不同字母表示同一測量指標在不同處理間差異顯著(Duncan檢驗),顯著性水平P< 0.05;表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n=3)

圖1 不同放牧強度下土壤AOA-amoA (a)、AOB-amoA (b)和nosZ (c)基因的豐度Fig.1 Abundance of AOA-amoA gene (a), AOB-amoA gene (b) and nosZ gene (c) across different grazing intensitiesCK：對照,control;LG：輕度放牧,low-level grazing;MG：中度放牧,middle-level grazing;HG：重度放牧,high-level grazing

Spearman相關(guān)分析表明,AOA-amoA基因豐度與土壤異養(yǎng)呼吸(Rh)顯著負相關(guān)(ρ=-0.69,P=0.01),AOB-amoA基因豐度與銨態(tài)氮含量顯著負相關(guān)(ρ=-0.60,P=0.04)。nosZ基因豐度與銨態(tài)氮含量顯著正相關(guān)(ρ=0.58,P=0.04),與土壤含水量(ρ=-0.78,P< 0.01)顯著負相關(guān)。

2.3 不同放牧強度對氨氧化和反硝化群落結(jié)構(gòu)的影響

不同放牧強度下AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因T-RFLP分析結(jié)果見圖2。使用HhaI酶對土壤AOA-amoA基因進行酶切,主要得到5個限制性末端片段(T-RFs),其中T-RFs 541 bp、265 bp和352 bp為優(yōu)勢片段,其平均相對豐度分別為59.5%、21.4%和9.3%。AOB-amoA基因獲得6個主要T-RFs片段,其中T-RFs 70 bp、130 bp、154 bp和141 bp是主要的片段,其平均相對豐度分別為25.3%、24.7%、22.2%和20.7%。反硝化nosZ基因主要獲得6個片段,其中T-RFs 109 bp、190 bp、75 bp和204 bp為優(yōu)勢片段,其平均相對豐度分別為40.7%、18.2%、12.3%和10.8%。

圖2 不同放牧強度下土壤AOA-amoA (a)、AOB-amoA (b) 和nosZ (c) 基因T-RFs相對豐度Fig.2 Relative abundance of T-RFs of AOA-amoA gene (a), AOB-amoA gene (b) and nosZ gene (c) across different grazing intensities

以各功能基因T-RFs的相對豐度為依據(jù),以香農(nóng)指數(shù)(Shannon Index)表征AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因群落多樣性。PerMANOVA結(jié)果表明,隨放牧強度的增加,AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因群落多樣性均呈顯著下降趨勢,且中度和重度放牧處理顯著低于輕度放牧處理(表3)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果表明,AOB-amoA和nosZ基因群落多樣性與Rh顯著正相關(guān)(ρ=0.52,P=0.02;ρ=0.55,P< 0.05),AOA-amoA基因群落多樣性與SOC顯著正相關(guān)(ρ=0.44,P< 0.05)。

表3 不同放牧強度下AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因香農(nóng)指數(shù)

不同小寫字母表示同一測量指標在不同處理間差異顯著(Duncan檢驗),顯著性水平P<0.05;表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n=3)

不同放牧強度對AOA-amoA基因群落結(jié)構(gòu)有顯著影響(P=0.04),而對AOB-amoA和nosZ基因群落結(jié)構(gòu)無顯著性影響。應用冗余分析(RDA)來評估微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系(圖3)。結(jié)果表明：前兩軸對AOA-amoA基因群落的解釋量分別為40.1%和10.4%,且土壤SOC (P=0.03)、銨態(tài)氮(P=0.02)及硝態(tài)氮(P=0.02)含量對AOA-amoA基因群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。前兩軸共同解釋了AOB-amoA基因群落結(jié)構(gòu)變異程度的45.7%,土壤pH(P=0.08)是顯著影響AOB-amoA基因群落變化的環(huán)境因子。前兩軸對nosZ基因群落結(jié)構(gòu)變異的解釋度為35.3%,且群落結(jié)構(gòu)變化與硝態(tài)氮含量(P< 0.05)顯著相關(guān)。

圖3 土壤AOA-amoA (a)、AOB-amoA (b) 和nosZ (c) 基因群落組成和環(huán)境變量的冗余分析Fig.3 Biplot of redundancy analysis (RDA) of relationship between soil properties and communities of AOA-amoA gene (a), AOB-amoA (b) and nosZ gene (c)pH：土壤pH,potential of hydrogen;soil moisture：土壤含水量,soil moisture;SOC：土壤有機碳,soil organic 銨態(tài)氮含量,ammonia 硝態(tài)氮含量,nitrate content

3 討論

3.1 不同放牧強度對土壤理化性質(zhì)和微生物活性的影響

放牧對土壤理化性質(zhì)的影響隨著放牧強度的不同而變化。本研究中土壤pH隨放牧強度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,與未放牧處理相比,盡管中度放牧顯著增加了土壤pH(P=0.03),但二者僅相差0.2個單位。有研究表明,放牧會顯著增加土壤pH[25-26],但本研究中土壤pH變化幅度較小,不足以作為評估放牧強度對土壤功能微生物影響的主要指標。放牧顯著增加了土壤銨態(tài)氮的含量,這與其他學者的研究相一致[27-28]。隨放牧強度的增加,進入土壤中的牲畜排泄物增加,進而增加土壤的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。土壤異養(yǎng)呼吸是土壤微生物活性的重要指標,反映了微生物對土壤有機質(zhì)分解的速度和強度。本研究中放牧強度顯著降低了土壤異養(yǎng)呼吸。米智勇在研究不同放牧強度對該試驗樣地土壤理化性質(zhì)的影響時發(fā)現(xiàn),隨放牧強度的增加,土壤碳氮比顯著下降,其波動范圍為9.56—10.26,波動幅度為0.67[29],說明微生物碳源含量的降低是土壤異氧呼吸顯著降低的原因之一。

3.2 不同放牧強度對土壤氨氧化和反硝化微生物的影響

氨氧化和反硝化微生物是土壤中重要的氮素轉(zhuǎn)化功能微生物,是土壤氨氧化和反硝化過程的主要參與者,其數(shù)量和活性與土壤生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)密切相關(guān)。有研究表明,放牧會顯著增加AOA-amoA和AOB-amoA基因豐度[30]。但本研究中,隨放牧強度的增加,AOA-amoA基因豐度無顯著變化,AOB-amoA基因豐度顯著下降。造成這一結(jié)果的原因可能是：1)不同放牧處理顯著影響了土壤pH,但其值變異很小,始終在pH為8的范圍波動,而土壤AOA的基因豐度無顯著變化,這和我們前期的研究結(jié)果一致[31],即AOA盡管在土壤中保持很高的水平,但在堿性土壤中對氮的響應比AOB更為不靈敏;2)有學者認為,氨氧化功能微生物豐度更易受土壤理化性質(zhì)的影響,而非放牧處理的影響[32],土壤可利用性底物含量是影響土壤氨氧化微生物的重要因素[33]。隨著放牧強度增加,土壤銨態(tài)氮含量也顯著增加,而硝態(tài)氮在不同處理間無顯著差異,可能是采樣時間離放牧處理的時間較近,由于放牧強度增大致使銨態(tài)氮大量累積;而氨氧化微生物主要以土壤中NH3為底物[34],重度放牧處理后短時間內(nèi)土壤可利用的NH3含量有限,進而顯著影響AOB的數(shù)量和群落多樣性,而隨著時間的推移,AOB微生物可利用的底物也會逐漸增加,達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)。此外,放牧強度對AOA基因群落結(jié)構(gòu)有顯著影響,AOB基因群落結(jié)構(gòu)無顯著變化。RDA結(jié)果顯示土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量對AOA群落具有顯著影響,說明由放牧所導致的以牲畜排泄物形式進入土壤中的可利用氮含量增加是導致AOA群落結(jié)構(gòu)變化的主要原因之一。

本研究中nosZ基因豐度與土壤銨態(tài)氮含量顯著正相關(guān)。有研究表明,nosZ基因參與了反硝化作用的最后一步,其豐度主要受底物含量、土壤通氣狀況及土壤pH等環(huán)境條件的影響[35]。放牧顯著降低了AOB基因豐度,即降低了反硝化底物硝態(tài)氮的含量,且硝態(tài)氮含量在輕度放牧處理中最低,進而輕度放牧處理顯著降低了nosZ基因豐度,但隨放牧強度的增加,土壤緊實度增加,通氣性降低,促進反硝化細菌的生長,進而增加了nosZ基因豐度。有研究指出nosZ基因豐度隨放牧強度的增加無顯著變化[36],這主要與研究區(qū)域的地理位置、植物群落、土壤類型等因素有關(guān)[37],同時,目前關(guān)于放牧強度界定(輕度、中度和重度)的差異也是造成上述結(jié)果不一致性的重要原因。此外,RDA結(jié)果表明土壤硝態(tài)氮含量對nosZ基因群落結(jié)構(gòu)有顯著影響,說明隨著放牧強度的增加,由牲畜采食踐踏所導致的土壤有機質(zhì)礦化加劇,顯著影響土壤中可利用氮含量,進而影響土壤nosZ基因群落結(jié)構(gòu)[38-39]。

4 結(jié)論

(1)土壤pH和銨態(tài)氮含量分別在7.90—8.18和6.37—35.92 mg/kg之間,中度放牧處理顯著增加了土壤pH(P=0.03),而銨態(tài)氮含量在重度放牧處理中最高(P=0.02)。不同放牧強度下土壤異養(yǎng)呼吸相比未放牧處理均顯著降低(P=0.02)。

(2)AOA-amoA和AOB-amoA基因豐度范圍分別為每克干土(4.94—7.60)×109個拷貝數(shù)和(0.68—3.75)×106個拷貝數(shù),放牧處理對AOA-amoA基因豐度無顯著影響,中度放牧處理顯著降低了AOB-amoA基因豐度(P=0.04);反硝化微生物nosZ基因豐度范圍為每克干土(2.49—5.78)×108個拷貝數(shù),且在輕度放牧處理中最低(P=0.03)。土壤銨態(tài)氮含量是影響AOA和AOB功能基因amoA豐度的主要因子,而nosZ基因豐度主要受反硝化底物含量及土壤通氣狀況影響。

(3)放牧顯著影響了AOA-amoA基因群落結(jié)構(gòu),而AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ基因群落多樣性均隨放牧強度的增加而降低,且中度和重度放牧顯著低于輕度放牧。由放牧所引起的可利用氮素含量的變化是導致氨氧化和反硝化微生物群落顯著變化的主要因素。

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