嗜水氣單胞菌bamA、bamB、bamD突變株的構(gòu)建及其對(duì)外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

黃放 林向民

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

細(xì)菌的外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）是一類位于革蘭氏陰性細(xì)菌外膜上的蛋白質(zhì)，可協(xié)助細(xì)菌攝取所需的營(yíng)養(yǎng)物，促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)，并在細(xì)菌的生理與病理機(jī)制中扮演著重要作用［1-4］。外膜蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與正確折疊需要經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，先在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成具有N-末端信號(hào)的前體，經(jīng)由SEC系統(tǒng)介導(dǎo)穿過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜，并在分子伴侶（Skp，SurA）的作用下經(jīng)過(guò)周質(zhì)空間，最終在BAM（β-barrel assembly machinery）復(fù)合物的協(xié)助下正確地折疊并整合到外膜中形成β-桶狀結(jié)構(gòu)［5-7］。BAM復(fù)合物一般由一個(gè)外膜蛋白BamA和4個(gè)脂蛋白 BamB、BamC、BamD 與 BamE組 成［8-10］。 前 期研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的BamA屬于Omp85家族蛋白，它與BamD是BAM系統(tǒng)中必不可少的組成部分，在外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用［7，11］。BamB、BamC、BamD的同源物僅存在于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)突變bamB、bamC和bamE基因，可引起少數(shù)外膜蛋白的錯(cuò)誤裝配。而三個(gè)重要性相對(duì)較弱的脂蛋白BamB、C、E對(duì)外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響也各不相同，bamB的缺失對(duì)外膜蛋白的合成產(chǎn)生較大的影響［11-14］。此外，大腸桿菌BamA∶B∶C∶D∶E形成核心復(fù)合物，并在表面活性劑的作用下，可以分解為BamA∶B、BamC∶D和BamC∶D∶E三種復(fù)合物形式，而bamC的缺失會(huì)導(dǎo)致這些復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，并導(dǎo)致BamB與BamD對(duì)蛋白酶的敏感性增加［16］。同時(shí)在野生株中BamA易受外源的蛋白酶K的影響，bamE的缺失在一定程度可以降低其影響［17］。但在不同細(xì)菌中，BAM系統(tǒng)的復(fù)合物組成及其功能也存在一定差異。

目前對(duì)于BAM系統(tǒng)的研究大都集中于大腸桿菌及腦膜炎雙球菌等少數(shù)幾種細(xì)菌中，在其他細(xì)菌中的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。嗜水氣單胞菌ATCC 7966是一株屬于O∶1血清型且具有一定毒性的模式菌株［18］，BAM系統(tǒng)在該菌株中如何發(fā)揮調(diào)控作用尚不明確。本研究利用同源重組交換的方法成功構(gòu)建嗜水氣單胞菌bamA、bamB和bamD突變株，并結(jié)合質(zhì)譜及Western blotting技術(shù)，研究這3個(gè)重要的蛋白對(duì)多個(gè)外膜蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，從而深化對(duì)BAM復(fù)合物在嗜水氣單胞菌外膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中作用的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、引物 嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrohilaATCC 7966由實(shí)驗(yàn)室保存，感受態(tài)細(xì)胞E.coliS17-1λpir與自殺載體pUTKm1均由福建農(nóng)林大學(xué)張燎原老師惠贈(zèng)。根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中bamA、bamB、bamD的基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物（表1）。

表1 嗜水氣單胞菌ATCC7966 bamA、bamB、bamD基因突變株構(gòu)建的引物

1.1.2 生化試劑 限制性內(nèi)切酶KpnI、SacI、ScaI和T4 DNA連接酶購(gòu)自賽默飛世科技有限公司；DNA聚合酶和DNA marker為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；基因組小量制備試劑盒購(gòu)自天根生物科技公司；瓊脂糖購(gòu)自生工生物工程有限公司；卡那霉素（Kan）氨芐青霉素（Amp）均購(gòu)自生工生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 以提取的嗜水氣單胞菌ATCC 7966基因組DNA 為模板，利用相關(guān)引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)后將獲得的特異性DNA條帶用膠回收試劑盒回收。

1.2.2 基因突變株的構(gòu)建 根據(jù)BamA、B、D基因序列分別設(shè)計(jì)引物（引物序列詳見(jiàn)表1），以嗜水氣單胞菌為模板，PCR擴(kuò)增片段，擴(kuò)增后的片段進(jìn)行雙酶切（SacI、ScaI），經(jīng)再次回收后與酶切后的自殺載體pUTKm1連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliS17-1λpir，從而完成同源重組載體的構(gòu)建。雙親本雜交參考張燎原方法進(jìn)行操作［18］。

雙親本雜交利用的原理為同源重組單交換，目的是將同源重組載體整合進(jìn)入嗜水氣單胞菌的基因組中，具體操作如下：分別過(guò)夜培養(yǎng)嗜水氣單胞菌 ATCC 7966 和E.coliS17-1λpir/pUT-bamA、bamB、bamD，以1∶20（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，OD600nm至0.8（約3 h），取100 μL 嗜水氣單胞菌培養(yǎng)液和 400 μLE.coliS17-1λpir/pUT-bamA、bamB、bamD培養(yǎng)液至離心管中進(jìn)行混合，在4℃條件下進(jìn)行離心（4 000 r/min），加入100 μL新鮮LB液體培養(yǎng)基重懸浮菌體，取50 μL重懸浮菌液點(diǎn)至預(yù)先準(zhǔn)備好的放有0.22 μm膜的平板上，正置培養(yǎng)12 h后，用1 mL LB液體培養(yǎng)基將膜上培養(yǎng)的菌體洗滌下來(lái)，取100 μL洗滌下的菌液涂布在含終濃度100 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，長(zhǎng)出的菌落經(jīng)特異性引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.3 膜蛋白的提取 分別挑取嗜水氣單胞菌ATCC 7966野生株與突變株的單克隆菌落于5 mL的LB培養(yǎng)基，30℃震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，以1∶100（V/V）轉(zhuǎn)接到100 mL LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)至OD600nm為1.0，8 000 ×g離心10 min收集菌體，超聲破碎菌體，離心收集上清。將所得上清經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液于超速離心機(jī)中以29 300 r/min離心60 min，沉淀用適量的PBS緩沖液溶解，-20℃保存。

1.2.4 差異蛋白的SDS-PAGE分析與質(zhì)譜鑒定 取經(jīng)超速離心法得到野生株與突變株的膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，分析條件為恒壓90 V，分離膠濃度為10%，上樣量為20 μL電泳至溴酚藍(lán)行至電泳槽下端為止，電泳后用考馬斯亮藍(lán)R250染色。將蛋白膠上所選擇的差異條帶切下，先用100 μL Milli-Q水震蕩洗滌兩次，再加入脫色液（50 mmol/L碳酸氫銨/乙腈=1∶1）至膠粒藍(lán)色褪去；加入150 μL純乙腈脫水至膠粒完全變白，真空干燥；加入100 μL的10 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT），56℃水浴60 min；冷卻到室溫后，吸干，快速加入100 μL的55 mmol/L碘乙酰胺（IAA），置于暗室45 min；后依次用25 mmol/L碳酸氫銨、50%乙腈和100%乙腈，脫水到膠粒完全變白為止，真空抽干；后用Trypsin酶液消化過(guò)夜，加入2%三氟乙酸（TFA）終止反應(yīng)，使TFA終濃度為0.1%，振蕩混勻，離心，酶解的肽段用LC-LTQ XL質(zhì)譜儀鑒定蛋白。

1.2.5 突變株bamA、B、D的Western blot分析 將敲除菌中提取的膜蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，進(jìn)行印記雜交，將凝膠、濾紙、PVDF膜置于盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的容器中，浸泡5 min，恒流1.3 mA，轉(zhuǎn)膜30 min，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉60 min，加入相應(yīng)外膜蛋白抗體（1∶2 000稀釋）4℃孵育過(guò)夜，洗滌。后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體，室溫孵育60 min，洗滌，顯色。

2 結(jié)果

2.1 bamA（AHA_1181）、bamB（AHA_1762）、bamD（AHA_4074）基因片段的擴(kuò)增

如圖1所示，利用DNA聚合酶從嗜水氣單胞菌ATCC 7966基因組DNA中PCR擴(kuò)增約1 060 bp、750 bp、580 bp的目的基因片段。對(duì)照Marker可以看出 PCR擴(kuò)增出bamA（1 060 bp）、bamB（750 bp）、bamD（580 bp）的特異性條帶，確定PCR擴(kuò)增出的條帶為所需的基因片段。

圖1 bamA、bamB、bamD基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 自殺載體pUTKm-bamA、bamB、bamD的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶完全消化后，與載體酶切后回收的片段連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coliS17-1λpir，在50 μg/mL卡那霉素 LB 平板上挑選克隆。通過(guò)酶切（圖2）和測(cè)序鑒定，獲得正確重組子自殺載體pUTKm-bamA-D，再通過(guò)雙親本接合轉(zhuǎn)移，在100 μg/mL氨芐青霉素和100 μg/mL卡那霉素抗性LB平板上篩選，得到接合轉(zhuǎn)移子。

圖2 pUT-bamA-D雙酶切電泳圖

2.3 bamA、B、D突變體的PCR驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)抗性平板的初步篩選，篩選到bamA、bamB、bamD突變菌株。為了進(jìn)一步確定bamA、B、D基因是否已經(jīng)被插入突變，分別在BamA、B、D的上游設(shè)計(jì)一條引物（PbamA1、PbamB1、PbamD1），在自殺載體上設(shè)計(jì)一條引物（P4）。以野生株和突變株的嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)可以分別擴(kuò)增出特定長(zhǎng)度的片斷，而對(duì)照為陰性圖3。同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示正確。綜上結(jié)果證實(shí)pUT-bamA、pUT-bamB、pUT-bamD載體已經(jīng)插入嗜水氣單胞菌ATCC 7966基因組中。

圖3 突變株bamA、B、D的PCR驗(yàn)證

2.4 突變株差異蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果

同野生株嗜水氣單胞菌外膜蛋白進(jìn)行比較，突變菌株bamA、bamB、bamD存在差異表達(dá)蛋白（圖4），對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，共鑒定到7個(gè)差異蛋白，其中5個(gè)為外膜蛋白，2個(gè)為位于內(nèi)膜上的蛋白酶（表2）。

圖4 嗜水氣單胞菌野生株與突變株膜蛋白的SDS-PAGE圖譜

2.5 bamA、B、D突變后對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

為了研究bamA、B、D突變后的變化，選取實(shí)驗(yàn)室已有的 Ferrichome receptor（A0KQZ1）、Maltoporin（A0KHF6）、Colicin I receptor（A0KQ46）、TonB-dependent copper receptor（A0KFG8） 外膜蛋白抗體，研究突變菌株bamA、B、D在胞漿和膜蛋白水平上，對(duì)蛋白的表達(dá)與轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生株嗜水氣單胞菌相比較，bamA、bamD突變后所有的相關(guān)蛋白都處于下調(diào)的狀態(tài)，特別對(duì) Colicin I receptor與 Maltoporin、TonB-dependent copper receptor三種外膜蛋白的影響最大。通過(guò)對(duì)細(xì)菌胞漿組分的western blotting結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)所有的檢測(cè)蛋白也都下調(diào)，而且基因的缺失對(duì)Ferrichome receptor與 Colicin I receptor、TonB-dependent copper receptor的表達(dá)影響較大，對(duì)Maltoporin的表達(dá)影響較小。但不同突變株對(duì)不同外膜蛋白的影響有差別，例如Colicin I receptor在bamD突變菌中胞漿中的表達(dá)明顯降低，而Maltoporin則在bamB突變菌中顯著下調(diào)（圖5）。

表2 LC-MS鑒定SDS-PAGE分離嗜水氣單胞菌與突變株bamA、bamB、bamD外膜蛋白組的差異蛋白

圖5 野生株（CK）與bamA、bamB、bamD突變株在膜蛋白水平與胞漿蛋白水平上多個(gè)相關(guān)蛋白的Western blotting

3 討論

細(xì)菌的外膜蛋白位于細(xì)胞與外界環(huán)境的交界處，在信號(hào)傳導(dǎo)、毒力侵染、細(xì)菌耐藥、抗逆性等多個(gè)生物學(xué)功能中起重要作用。因此，BAM系統(tǒng)復(fù)合物的正常運(yùn)轉(zhuǎn)可確保外膜蛋白的正確折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)維持細(xì)菌的正常生長(zhǎng)至關(guān)重要。Charlson等［13-14，19］在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)BamA 和BamD是細(xì)菌外膜蛋白折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)的必須蛋白，bamB基因的突變，可以使BAM復(fù)合物受到損傷，部分外膜蛋白的分泌減少；而Fardini 等［12］則認(rèn)為沙門(mén)氏菌中的BamB并不是一個(gè)重要蛋白，當(dāng)敲除bamB基因后，僅對(duì)BAM復(fù)合物系統(tǒng)造成輕微損傷。此外，研究發(fā)現(xiàn)腦膜炎雙球菌中bamC和bamE的突變，對(duì)BAM復(fù)合物系統(tǒng)影響并不大，并不是細(xì)菌生存所需的關(guān)鍵蛋白［20］。

鑒于以往未見(jiàn)嗜水氣單胞菌中BAM系統(tǒng)對(duì)外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)影響的報(bào)道，本研究利用分子生物學(xué)方法敲除該菌BAM系統(tǒng)中的重要組成亞基bamA，bamB和bamD。首先比較這些敲除菌株對(duì)細(xì)菌膜蛋白的表達(dá)影響，SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)7條差異條帶，質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示至少有5個(gè)外膜蛋白，并利用Western blotting驗(yàn)證部分蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌bamA、bamB和bamD的缺失突變均引起本研究中選取的4個(gè)外膜蛋白在細(xì)胞膜水平上的表達(dá)下降，除了BamD在Ferrichrome receptor的轉(zhuǎn)運(yùn)中起較為重要的作用以外，BamA、BamB和BamD對(duì)其他外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)均起重要的作用；研究還發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌胞漿組分中，不同BAM復(fù)合物亞基似乎對(duì)特定外膜蛋白表達(dá)的影響也有所不同，例如BamB蛋白在外膜蛋白Maltoporin的表達(dá)中起決定性作用，BamA次之；Colicin I receptor和 Ferrichrome receptor的表達(dá)，則主要取決于BamD蛋白；而B(niǎo)amA，BamB和BamD在TonB-dependent copper receptor與BamD的表達(dá)中起相近的貢獻(xiàn)，提示BAM系統(tǒng)的變化不僅影響外膜蛋白在膜蛋白組分上的轉(zhuǎn)運(yùn)，還可能通過(guò)某種途徑影響外膜蛋白的調(diào)控表達(dá)。值得提出的是，在大腸桿菌中敲除bamA或者bamD基因以后，均導(dǎo)致細(xì)菌外膜蛋白不能正確折疊進(jìn)入外膜而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，而本研究中敲除嗜水氣單胞菌的相應(yīng)基因后只引起細(xì)菌生長(zhǎng)略緩慢（數(shù)據(jù)未顯示），并未造成細(xì)菌的致死，這可能與試驗(yàn)中pUTKm載體介導(dǎo)的突變并未完全無(wú)痕敲除目的基因有關(guān)，也有可能由這兩個(gè)蛋白在BAM系統(tǒng)中的作用與大腸桿菌等細(xì)菌的差異導(dǎo)致。以上研究與在大腸桿菌中相應(yīng)復(fù)合物功能的結(jié)論有略微不同，提示嗜水氣單胞菌BAM轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可能還具有特定的外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)與折疊特性。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了bamA、bamB、bamD缺失突變株，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)7條差異條帶，質(zhì)譜技術(shù)鑒定獲得至少5個(gè)差異外膜蛋白，進(jìn)一步的Western blot分析發(fā)現(xiàn)bamA、bamB和bamD的缺失均能不同程度地影響嗜水氣單胞菌外膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。

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