實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)和尿液快速檢測法對孕前優(yōu)生健康檢查人群中淋球菌檢測的應(yīng)用比較△

張宏萍 包 杰

(河南省光山縣計劃生育服務(wù)站 光山 465450)

淋病主要通過性接觸傳播，由淋病奈瑟菌(NG) 引起的泌尿生殖道化膿性感染，對人體生殖系統(tǒng)的健康危害極大，孕齡女性一旦感染，容易引起輸卵管堵塞、不孕、宮頸炎、流產(chǎn)、新生兒膿漏眼病等，孕前及時進(jìn)行檢測、診斷和治療，是實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育、保證新生兒健康的重要手段[1]。

不典型癥狀淋病患者主要依靠實驗室檢查幫助診斷，目前實驗室常用的方法有直接涂片、分離培養(yǎng)、免疫熒光等，由于分析時間長短不一，檢出率高低不等，其存在的假陽性和假陰性是困惑各實驗室的普遍現(xiàn)象，且常用淋球菌檢測的都是患者的泌尿生殖道分泌物標(biāo)本，容易增加患者的痛苦、降低檢測的依從性，因此，尋找準(zhǔn)確、快速、實用的檢測方法有著重要的意義[2]。筆者聯(lián)合河南省人口和計劃生育科研院對孕前優(yōu)生健康檢查人群，以尿液作為樣本同時應(yīng)用快速檢測法和 SAT技術(shù)進(jìn)行NG的檢測，對這兩種方法的特異性、敏感性等指標(biāo)來綜合分析，以期為實驗室選擇正確的檢測方法，為臨床提供可靠的診斷依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

選擇2017年1～6月來本站進(jìn)行孕前優(yōu)生健康檢查人群中有尿道口紅腫、膿性分泌物明顯、尿急尿頻尿痛等癥狀的疑似病例100例，無癥狀100例，年齡20～35歲。 要求所有人員在標(biāo)本采集的前7～10d禁止采用抗生素藥物。

1.2 樣本采集

每個檢查對象取1份尿道(陰道) 分泌物拭子和2份尿液標(biāo)本。

1.2.1拭子標(biāo)本采集

用特制無菌棉拭子伸入女性宮頸口或男性尿道口1～2cm ，輕輕旋轉(zhuǎn)并停留10s后取出，立即保溫送檢。

1.2.2尿液標(biāo)本采集

1份初段尿標(biāo)本用于淋球菌快速檢測； 另1份初段尿1mL與1mL尿液保存液(SAT試劑盒提供)混合置于EP 管中-20℃冷凍儲存，用于SAT檢測。

1.3 試劑與方法

1.3.1試劑

尿液淋球菌快速檢測試劑盒由鄭州安圖綠科生物提供；SAT法恒溫擴增檢測試劑盒(NG-RNA)由上海仁度生物提供，TL 988 PCR儀由西安天隆科技提供；另購進(jìn)鄭州人福博賽生物生產(chǎn)的巧克力培養(yǎng)基做分泌物分離培養(yǎng)對照用。

1.3.2方法

(1)尿液淋球菌快速檢測按照試劑盒的說明進(jìn)行操作，要求1h內(nèi)完成。取2mL初段尿加入反應(yīng)試管內(nèi)，垂直滴加3滴試劑，塞緊管塞輕輕搖勻， 放置5min后再輕輕搖勻1次，觀察反應(yīng)管內(nèi)尿液上部形成氣泡情況。

文學(xué)作品還應(yīng)該注意體裁和題材的區(qū)分。題材指文學(xué)藝術(shù)作品的材料內(nèi)容，如描寫歷史、軍旅等題材。文學(xué)作品應(yīng)首先按其體裁而不是按其內(nèi)容題材歸類。如果是以文學(xué)的形式來傳播科學(xué)知識的作品，雖然有文學(xué)價值，但也應(yīng)該依其內(nèi)容歸類而不應(yīng)歸入文學(xué)類。但如果是以文學(xué)體裁形式著述的，并帶有科學(xué)性質(zhì)的兒童讀物、科學(xué)故事等，可以按文學(xué)體裁形式進(jìn)行分類。

(2)SAT預(yù)留標(biāo)本適時集中冷凍送往協(xié)作單位檢測，檢測按照試劑盒說明書操作，設(shè)置陰、陽性對照。

(3)分離培養(yǎng)法取分泌物立即接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基,置5%CO2環(huán)境中37℃培養(yǎng)24～48h，根據(jù)菌落形態(tài)進(jìn)行鑒定，取典型菌落涂片染色鏡檢為革蘭陰性雙球菌者為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

尿液淋球菌快速法和SAT 法檢測結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件中的配對χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以率表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)果判斷

(1)尿液淋球菌快速法是利用淋球菌侵入尿道上皮細(xì)胞,產(chǎn)生細(xì)菌生化酶, 加入試劑與含有此酶的尿液產(chǎn)生生化反應(yīng)， 若液面上部形成一層氣泡或液面上層管壁形成一圈細(xì)小的氣泡者判讀為陽性，20min后結(jié)果無效。

(2)SAT法檢測結(jié)果根據(jù)實時熒光信號的出現(xiàn)時間和強度，結(jié)合陰、陽性對照對檢驗結(jié)果進(jìn)行判定。dt ≤35的樣本為陽性；dt為40或無數(shù)值的樣本為陰性。

(3)以淋球菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，計算SAT檢測尿液樣本及拭子樣本的靈敏度及特異性。

2.2 尿液淋球菌快速法和SAT檢測結(jié)果比較

200例受檢者中尿液淋球菌快速法陽性率為28%，NG-SAT法陽性率為22%，其中100例疑似標(biāo)本尿液快速法與SAT法陽性率分別為44%、39%，100例無癥狀標(biāo)本尿液快速法與SAT陽性率分別為12%、5%，尿液快速法陽性率均高于SAT法(P<0.01)。

表1 2種方法檢測淋球菌與分離培養(yǎng)法陽性率對照統(tǒng)計表[n(%)]

標(biāo)本類型(n)分離培養(yǎng)法尿液淋球菌快速法NG-SAT 法陽性陰性陽性率(%)陽性陰性陽性率(%)陽性陰性陽性率(%)疑似標(biāo)本100376337445644396139無癥狀標(biāo)本10039731288125955合計200401602056144284415622

200例受檢者中，SAT法與分離培養(yǎng)法檢測NG時有8例結(jié)果不一致，其中5例培養(yǎng)陰性SAT陽性，3例培養(yǎng)陽性而SAT陰性；尿液快速法與分離培養(yǎng)法檢測NG時有16例結(jié)果不一致，其中10例培養(yǎng)陰性快速法陽性，6例培養(yǎng)陽性而尿液快速法陰性。世界衛(wèi)生組織推薦培養(yǎng)法為用于診斷 NG感染的 “金標(biāo)準(zhǔn)”，通過感染者真陰性、真陽性的比較得出尿液快速法的敏感性和特異性分別為100%、90%，SAT法的敏感性和特異性分別為100%、97.5%，SAT法的特異性高于尿液快速法7.5%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

兩種方法的敏感性和特異性，見表2。

表2 兩種方法檢測淋球菌的結(jié)果比較

方法陽性陰性真陽真陰敏感性特異性尿液淋球菌快速法5614440160100%90.0%NG-SAT4415640160100%97.5%

3 討論

淋病是目前發(fā)病率較高的性傳播疾病(STD) 之一，無癥狀淋病患者是傳播淋病奈瑟菌感染的重要原因， 廣泛開展性病的早期篩查、早期診斷以及早期治療極為重要。 傳統(tǒng)的NG檢測方法存在檢出率低、周期較長、特異性差等缺點，給診斷和治療帶來困難，建立高敏感、高特異、快速便捷的實驗室診斷方法對臨床診斷和治療有重要意義[3]。 本研究采用尿液快速檢測法和SAT技術(shù)對孕前優(yōu)生健康檢查對象的尿液樣本進(jìn)行NG檢測，以找到適合基層實驗室的方法學(xué)，并為其治療提供合理的依據(jù)。

尿液淋球菌快速檢測法是基層常用的方法之一, 其氣泡的產(chǎn)生與淋球菌數(shù)量的多少有關(guān), 隱性感染者泡沫產(chǎn)生速度相對較慢， 此項試驗檢測方法取材方便、操作簡單、經(jīng)濟方便、患者容易接受，也便于快速診斷。但快速法敏感性強，易造成假陽性結(jié)果，實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)(SAT)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到病原體檢測領(lǐng)域，該技術(shù)具有高靈敏性、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點[4]，將實時熒光檢測和核酸恒溫擴增相結(jié)合，特異性提取尿液或拭子樣本中的病原體RNA，交叉污染少，降低了假陽性、假陰性問題，有助于臨床療效監(jiān)測。 有研究表明，NG-SAT在尿液和拭子檢測中的結(jié)果無差異，標(biāo)本符合率高達(dá)98.5%，首段尿標(biāo)本與拭子的敏感性相當(dāng)[5]，做非侵入性的尿液樣本檢測更易于采集接受，避免拭子取樣的尷尬和痛苦，提高了患者取樣的依從性，簡化了收集流程，具有較大的臨床應(yīng)用價值。結(jié)果顯示，SAT法與國內(nèi)文獻(xiàn)報道的NG陽性率更相近 ，該方法檢測的假陽性率明顯低于快速法，100例無癥狀者的陽性率并不是很高，但仍有一定的隱性感染情況，不容忽視。兩種方法與培養(yǎng)法的符合率均高于90%，其中快速檢測法的陽性率最高，正常情況下分泌物或尿中的雜菌的酶活性很低不致產(chǎn)生陽性反應(yīng)，但當(dāng)雜菌數(shù)量大大增加時可引起假陽性反應(yīng)，同時嚴(yán)重蛋白尿和血尿也可影響結(jié)果，特別是女性分泌物標(biāo)本，增多時會干擾試驗產(chǎn)生假陽性[6]。 研究中發(fā)現(xiàn)分離培養(yǎng)和SAT檢測結(jié)果不一致情況，可能由于淋球菌培養(yǎng)標(biāo)本收集量太少，運送過程保溫不當(dāng)致菌體死亡等原因引起培養(yǎng)法的假陰性；也可能是受檢者正處于感染初期，樣本病原體DNA量少而RNA量，以RNA為檢測靶標(biāo)的SAT技術(shù)能夠檢測到病原體的存在[7]。由于SAT檢測的是病原體 RNA，RNA在環(huán)境中極易降解，SAT法假陰性的原因可能是尿液保存不當(dāng)或過度稀釋， 抑或尿液中存在較多的擴增抑制物如晶體和亞硝酸鹽等均可引起[8]。本研究結(jié)果顯示SAT法檢測疑似淋球菌感染患者尿液標(biāo)本具有較高的靈敏度和特異度， 通過SAT法與尿液快速法檢測NG的結(jié)果比較，應(yīng)用SAT法可以幫助辨別快速法造成的假陽性,對臨床癥狀不典型患者可以更好的檢測出，避免了漏檢，對于疑似病例的早期診斷具有重要臨床意義。

綜上所述，SAT技術(shù)既具備采樣方便、耗時短、低污染的實驗要求，又有敏感性高、特異性好、反應(yīng)穩(wěn)定、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，還可用于用療效觀察和判愈評估，并為淋球菌的實驗室診斷提供新的采樣方式和檢測方法，該技術(shù)更具有臨床實用性，優(yōu)于目前其他檢測方法[9]。尿液淋球菌快速檢測法具有操作簡單、 試劑便宜、 結(jié)果易判斷的優(yōu)點,可作為基層單位大批量體檢標(biāo)本的初篩手段，針對可疑標(biāo)本配合使用SAT技術(shù)可以互相彌補，以供臨床綜合診斷，提高淋球菌檢測的準(zhǔn)確率。

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