羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液的生物相容性研究

韓穎 徐玉茵 周靜 田林奇 柳小軍 張嬌嬌 河南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測工程研究中心 （河南 鄭州 450000）

手術(shù)性粘連現(xiàn)象普遍存在于外科手術(shù)后，不僅給患者帶來了一定的軀體痛苦而且加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。研究表明，殼聚糖作為一種生物材料，具有止血、抗炎、抑制成纖維細(xì)胞生長等作用，是預(yù)防傷口粘連的理想材質(zhì)[2]。羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液屬于殼聚糖類衍生物，為無色透明或微黃色澄清液體，常用于術(shù)后傷口沖洗，具有防止創(chuàng)面粘連，促進(jìn)傷口愈合的作用[3]。為了保障其臨床應(yīng)用的安全性，本研究按照GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》的要求，對(duì)羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液進(jìn)行生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)。

1.資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)材料：小鼠成纖維細(xì)胞L-929（ATCC），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），MTT（Sigma），MEM（Gibco），完全弗氏佐劑（Sigma），成年新西蘭兔（華蘭生物疫苗有限公司，合格證號(hào)：41001700005019），質(zhì)量2.2～2.7kg，健康初成年白化豚鼠（華蘭生物疫苗有限公司，合格證號(hào)：41001700005096），質(zhì)量300～500g。

1.2 方法

1.2.1 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[4]

無菌條件下取樣品，按照0.1g/mL的浸提比例制備樣品浸提液。將處于對(duì)數(shù)生長期的L-929細(xì)胞用胰酶消化后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL。將配置好的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL。置5%CO2培養(yǎng)箱37?C，培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液?？瞻讓?duì)照組加入新鮮MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，供試品組加入樣品浸提液，陰性對(duì)照組加入高密度聚乙烯浸提液，陽性對(duì)照組加入含5%二甲基亞砜的培養(yǎng)液，每孔100μL，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。更換培養(yǎng)液72h后，將上述各組置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并在每孔加入5g/L的MTT溶液20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)液體，加入150μL的DMSO，振蕩10min后，在570nm和630nm波長下用酶標(biāo)儀測定吸光度，并計(jì)算相對(duì)增值率（試驗(yàn)組吸光值/空白對(duì)照組吸光值×100%）。按表1進(jìn)行分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定。

表1.細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)(%)

表2.試驗(yàn)樣品的細(xì)胞相對(duì)增值率

1.2.2 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)[5]

取新西蘭兔3只，于試驗(yàn)前12h，剃除家兔背部脊柱兩側(cè)被毛。在每只兔脊柱一側(cè)的5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL生理鹽水制備的樣品浸提液，脊柱同一側(cè)后5個(gè)點(diǎn)注射生理鹽水對(duì)照液。在每只兔的脊柱另一側(cè)注射植物油制備的樣品浸提液和植物油對(duì)照液，操作步驟同上。注射后即刻并在24h、48h、72h觀察記錄各注射部位狀況，按標(biāo)準(zhǔn)給出的記分系統(tǒng)對(duì)每一觀察期各注射部位的紅斑和水腫的組織反應(yīng)評(píng)分，并記錄試驗(yàn)結(jié)果。在72h評(píng)分后，分別將每一試驗(yàn)樣品和溶劑對(duì)照的全部紅斑與水腫記分相加，再除以18 [3（動(dòng)物數(shù)）×3（觀察期）×2（記分類型）]，計(jì)算出每一試驗(yàn)樣品和每一對(duì)應(yīng)溶劑對(duì)照的綜合平均記分。

1.2.3 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)[5]

取豚鼠15只，分為試驗(yàn)組10只，對(duì)照組5只，分別剃除動(dòng)物肩胛骨后側(cè)被毛。試驗(yàn)組在去毛區(qū)域的上、中、下部位分別注射A液（弗氏完全佐劑與生理鹽水1:1混合乳化劑）、樣品浸提液、樣品浸提液與A液（1:1）的混合液，左右對(duì)稱各2點(diǎn)。陰性對(duì)照組使用同批號(hào)生理鹽水，操作同試驗(yàn)組。皮內(nèi)誘導(dǎo)7d后，用用浸透樣品浸提液和陰性對(duì)照液的濾紙片覆蓋誘導(dǎo)注射點(diǎn)。用封閉式繃帶固定濾紙片，并于48h后去除包扎。局部誘導(dǎo)后14d后，剃除豚鼠上腹部被毛，將浸透樣品浸提液和陰性對(duì)照液的濾紙片敷貼于去毛部位，封閉固定24h。解除包扎后24h和48h觀察兩組動(dòng)物激發(fā)部位的皮膚反應(yīng)情況。按標(biāo)準(zhǔn)中的分級(jí)對(duì)每一激發(fā)部位和每一觀察時(shí)間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行描述并分級(jí)。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

倒置顯微鏡下觀察可見，陽性組細(xì)胞數(shù)量少，形態(tài)呈球形?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞呈梭形。試驗(yàn)樣品組可見少量圓形細(xì)胞，MTT檢測結(jié)果為細(xì)胞的相對(duì)增值率為80%。說明羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液為極輕的細(xì)胞毒性。詳細(xì)結(jié)果見表2。

2.2 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品的兩組浸提液與其相應(yīng)溶劑對(duì)照液的平均記分之差均為0，所以在本試驗(yàn)條件下，試驗(yàn)樣品無皮內(nèi)刺激反應(yīng)。

2.3 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物的皮膚均未出現(xiàn)紅斑和水腫現(xiàn)象。因而，試驗(yàn)樣品等級(jí)評(píng)分為0，即在本試驗(yàn)條件下，樣品無致敏反應(yīng)。

3.討論

在外科手術(shù)后發(fā)生組織粘連是臨床上一種常見的現(xiàn)象，特別是在腹部手術(shù)后的粘連常帶來嚴(yán)重的并發(fā)癥，如腸梗阻、盆腔炎等，這種現(xiàn)象給患者的身心帶來極大傷害，使患者的生活質(zhì)量下降，因此降低術(shù)后粘連的發(fā)生率顯得至關(guān)重要。理想的防粘連材料應(yīng)具有良好的生物相容性、自動(dòng)黏附性、促進(jìn)傷口愈合并將纖維組織增生降至最低程度等特性。

本研究按照GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》的要求，采用細(xì)胞毒性、皮內(nèi)反應(yīng)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)對(duì)羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液進(jìn)行生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液具有良好的生物相容性。

[1]Moris D, Chakedis J, Rahnemai-Azar AA, et al.Postoperative Abdominal Adhesions: Clinical Significance and Advances in Prevention and Management[J].J Gastrointest Surg.2017,21(10):1713-1722.

[2]Zhu L, Peng L, Zhang YQ.The processing of chitosan and its derivatives and their application for postoperative anti-adhesion[J].Mini Rev Med Chem,2015,15(4):330-337.

[3]蘇朝暉,譚潔銀.羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液在婦產(chǎn)科腹盆腔手術(shù)后的應(yīng)用效果[J].北方藥學(xué),2016,13(4):10-11.

[4]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.10-2005《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分:體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

[5]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.10-2005《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第10部分:刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)》[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2005.