• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    地衣芽孢桿菌抗菌肽萃取條件的研究

    2018-06-07 02:34:19俊,湯斌,李
    關(guān)鍵詞:超純水有機(jī)溶劑抗菌肽

    胡 俊,湯 斌,李 松

    (安徽工程大學(xué) 微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心,安徽 蕪湖 241000)

    抗菌肽是一種常見的生物拮抗劑,主要表現(xiàn)為對(duì)一些G+細(xì)菌(特別是一些致病菌,如金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等)具有一定的拮抗作用[1],因而在環(huán)境保護(hù)、醫(yī)療衛(wèi)生和食品加工等眾多領(lǐng)域都有著較為重要的應(yīng)用.利用微生物生產(chǎn)抗菌肽具有生產(chǎn)周期短,產(chǎn)物易分離純化等優(yōu)點(diǎn)[2],是工業(yè)上抗菌肽的主要獲得途徑.

    抗菌肽純化方法主要包括膜分離、電泳分離、層析技術(shù)以及高效液相色譜分離等[3].在利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)發(fā)酵液中的抗菌肽組分進(jìn)行分離時(shí),需要先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理,以降低分離體系中的蛋白豐度、分離難度以及避免造成儀器損壞.從目前的研究現(xiàn)狀來看,預(yù)處理方式主要包括鹽析、色譜柱粗分離、分級(jí)沉淀和有機(jī)萃取等[4].胡瑞萍[5]等采用鹽酸沉淀和Sephadex G-50 凝膠柱分離對(duì)枯草芽孢桿菌BSD-2抗菌肽進(jìn)行了粗提?。粍㈧o[6]等在枯草芽孢桿菌抗菌肽分離純化過程中,采用陰離子交換柱DEAE-Sepharose FF等方式對(duì)發(fā)酵粗提液進(jìn)行預(yù)處理;劉穎[7]等在分離抗真菌肽的過程中,通過調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度以及利用丙酮分級(jí)沉淀等方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行了粗提.由于抗菌肽具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性較高且在有機(jī)溶劑和水中都具有一定的溶解性等特點(diǎn)[8],所以,利用合適的有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)酵液中的抗菌肽進(jìn)行萃取可使其中大多數(shù)雜蛋白變性沉淀,而分子量較小的多肽類物質(zhì)可部分轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中.相比其他的預(yù)處理方式,此方法操作簡(jiǎn)單且能取得較好的預(yù)處理效果,使后續(xù)HPLC分離過程簡(jiǎn)化,因而以此作為發(fā)酵液的預(yù)處理方法.

    研究以地衣芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株時(shí),發(fā)酵液預(yù)處理操作過程中的各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)抗菌肽的萃取效果和相對(duì)應(yīng)的反萃取效果的影響,以及最佳萃取試劑、萃取和反萃取條件的確定,最終通過蛋白豐度檢測(cè)對(duì)預(yù)處理效果進(jìn)行了評(píng)估.相比其他預(yù)處理方式,此方法操作簡(jiǎn)單且能較好地達(dá)到預(yù)處理效果,使后續(xù)HPLC分離過程簡(jiǎn)化,因而選擇此方法作為發(fā)酵液的預(yù)處理方法.

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    (1)菌種.地衣芽孢桿菌BL32、金黃色葡萄球菌AS1.2465(以上菌株均為安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵工程研究中心實(shí)驗(yàn)室篩選保藏).

    (2)試劑與儀器.試劑:氨芐青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)品(160 萬U/g,純度≥99.9%)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、95%乙醇、氯仿(AR)、正丁醇(AR)、異戊醇(AR)、硫酸鎂(AR)、碳酸鈣(AR)、可溶性淀粉、胰蛋白胨、酵母粉(以上藥品均購自國(guó)藥集團(tuán)公司)以及市售豆粕.

    儀器:NS4201二元分析液相色譜系統(tǒng)、RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FD8-3冷凍干燥機(jī)、電熱鼓風(fēng)式干燥箱.

    (3)培養(yǎng)基.LB固體培養(yǎng)基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl 1%,瓊脂粉1.5%;種子培養(yǎng)基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl 1%;發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉1%,豆粕2%,硫酸鎂0.02%,碳酸鈣0.05%.

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 發(fā)酵液的獲得

    (1)種子液制備.用接種環(huán)從斜面菌種保藏管中挑取菌體接種于20 mL種子培養(yǎng)基中,于37 ℃環(huán)境中200 r/min震蕩培養(yǎng)18 h備用.

    (2)發(fā)酵液的獲取.配制上述發(fā)酵培養(yǎng)基并加入10 L發(fā)酵罐(BIOTECH-10JS-9000C,上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中進(jìn)行實(shí)罐滅菌,待培養(yǎng)基冷卻至室溫時(shí)接入2%的地衣芽孢桿菌種子液.控制發(fā)酵條件為37 ℃、溶氧30%(串聯(lián)轉(zhuǎn)速),發(fā)酵過程中恒定pH 6.5(10% 氨水調(diào)節(jié)),發(fā)酵時(shí)間為30 h.發(fā)酵結(jié)束后[9],將發(fā)酵液進(jìn)行8 000 r/min離心10 min,取上清液備用.

    2.2 抗菌效價(jià)與抗菌肽相對(duì)含量計(jì)算方法

    (1)抗菌實(shí)驗(yàn)方法.抗菌實(shí)驗(yàn)方法采取瓊脂表面擴(kuò)散法[10].在LB平板表面涂布指示菌,同時(shí)在培養(yǎng)基表面放置牛津杯(規(guī)格:內(nèi)徑φ=8 mm).向牛津杯中加入100 μL待測(cè)液,平板置于一定的條件下培養(yǎng),后測(cè)定牛津杯周圍的抑菌圈直徑大?。?/p>

    (2)抗菌效價(jià)計(jì)算方法.準(zhǔn)確稱取氨芐青霉素鈉1.000 g,利用超純水配制濃度為1.000 g/mL(160 萬抗菌單位)的氨芐青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[11],對(duì)此標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行梯度稀釋分別配制2~20 U/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用.取一定量的樣液置入無菌EP管中用無菌水梯度稀釋5~15倍,經(jīng)0.22 μm的無菌過濾器過濾后按2.2(1)的方法進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn).樣液抑菌效價(jià)的測(cè)定采用國(guó)際上通用的抗生素效價(jià)測(cè)定方法“杯碟法”中的二計(jì)量法[12].即根據(jù)下列公式和抑菌圈的大小得出相應(yīng)的抗菌效價(jià).

    (3)抗菌肽相對(duì)含量的測(cè)定方法.根據(jù)樣液中抗菌物質(zhì)的含量與其抗菌效價(jià)成正比的關(guān)系,樣液中抗菌肽的相對(duì)含量主要是通過測(cè)定抑菌效價(jià)的方式體現(xiàn)的.發(fā)酵液中抗菌肽相對(duì)含量直接通過原發(fā)酵液的抗菌效價(jià)判斷,萃取操作后溶于有機(jī)溶劑和超純水中的抗菌肽相對(duì)含量測(cè)定方法如下:10 000 r/min離心5 min,收集有機(jī)相或水相,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后60 ℃烘干,溶質(zhì)利用5 mL超純水重新溶解后經(jīng)0.22 μm水膜過濾.按2.2(2)所述方法測(cè)定溶解液抗菌效價(jià).

    2.3 發(fā)酵液中抗菌肽萃取條件的研究

    (1)不同有機(jī)溶劑對(duì)萃取效率的影響.分別以氯仿、四氯化碳、正丁醇、異戊醇和混合醇(正丁醇∶異戊醇=1∶1)為萃取用的有機(jī)萃取劑.將有機(jī)溶劑與原發(fā)酵液上清液按體積比1∶1混合進(jìn)行萃取操作.分別收集有機(jī)相和發(fā)酵液并對(duì)其中抗菌肽的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定.每種有機(jī)溶劑設(shè)3個(gè)平行組,抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值.

    (2)萃取機(jī)溶劑/發(fā)酵清液的體積比對(duì)萃取效率的影響.控制有機(jī)溶劑與發(fā)酵清液的體積比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1進(jìn)行萃取,測(cè)定有機(jī)相和水相中的抗菌肽相對(duì)含量.各體積比設(shè)3個(gè)平行組,抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值.

    (3)萃取溫度對(duì)萃取效率的影響.取適量的有機(jī)溶劑和發(fā)酵上清液分別置入水浴鍋中保溫30 min,水浴鍋的溫度分別設(shè)置為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃和65 ℃.后迅速將有機(jī)溶劑與培養(yǎng)液清液按合適的體積比混合,分別收集有機(jī)相和發(fā)酵液,對(duì)兩者溶解的抗菌肽相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定.各溫度條件下設(shè)3個(gè)平行組,抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值.

    2.4 反萃取條件的研究

    反萃取是指在萃取操作以后,將溶解有抗菌肽的有機(jī)溶劑與超純水混合,使得有機(jī)溶劑中部分抗菌肽轉(zhuǎn)移至水相的實(shí)驗(yàn)過程,目的是為了進(jìn)一步降低待分離體系中的蛋白豐度.

    (1)有機(jī)相/超純水體積比對(duì)反萃取效果的影響.分別設(shè)置反萃取過程中 V有機(jī)相/V超純水比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,在常溫下充分震蕩混合均勻,按2.2(2)方法對(duì)各組有機(jī)相以及水相中的抗菌肽相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定.各體積比設(shè)3個(gè)平行組,抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值.

    (2)溫度對(duì)反萃取效果的影響.取適量的有機(jī)溶劑和超純水分別置于溫度設(shè)置為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃水浴鍋中保溫30 min后迅速將有機(jī)溶劑與超純水按合適的體積比混合,測(cè)定各組有機(jī)溶劑和水相中抗菌肽的相對(duì)含量.各溫度條件下設(shè)3個(gè)平行組,抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值.

    (3)反萃取操作次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果的影響.在最適操作溫度條件下,按最適體積比將含有抗菌肽的有機(jī)溶劑與超純水進(jìn)行混合,充分震蕩后離心.收集上層有機(jī)相再一次按體積比加入超純水重復(fù)上述操作2至5次,分別對(duì)每次有機(jī)相中剩余的抗菌肽相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定.各操作次數(shù)設(shè)3個(gè)平行組,抑菌性效價(jià)取相對(duì)應(yīng)的平均值.

    2.5 蛋白豐度的檢測(cè)

    分別取發(fā)酵濃縮液、萃取操作后溶有抗菌肽的有機(jī)溶劑以及反萃取后溶有抗菌肽的水溶液經(jīng)0.45 μm膜過濾后進(jìn)行高效液相色譜分析.色譜檢測(cè)條件分別為柱型C18柱(規(guī)格:250×8 mm),操作溫度25 ℃;有機(jī)相(A相)為乙腈(色譜純);非有機(jī)相(B相)為超純水;A相由起始濃度30%上升至結(jié)束濃度60%;檢測(cè)光波長(zhǎng)254 nm;分離時(shí)間30 min;進(jìn)液量20 μL.

    3 結(jié)果與分析

    3.1 萃取實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

    不同有機(jī)溶劑萃取液的萃取效率和抑菌效果如圖1、圖2所示.由圖2可知,以正丁醇為萃取溶劑時(shí)形成的抑菌圈的直徑較大即以正丁醇為有機(jī)溶劑時(shí),發(fā)酵液中的抗菌肽可較多的轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中,其萃取率為33.14%.其次為混合醇,萃取效果最差的為四氯化碳,其對(duì)抗菌肽的萃取率僅有8.28%.

    V有機(jī)溶劑/V發(fā)酵液對(duì)萃取效果的影響如圖3所示.溫度對(duì)萃取效果的影響如圖4所示.由圖3可知,萃取過程中,不同的有機(jī)相與發(fā)酵液的體積比對(duì)萃取效果有一定的影響,其中設(shè)定V有機(jī)相/V發(fā)酵液為2∶1時(shí),抗菌肽的萃取相比于V有機(jī)相/V發(fā)酵液為1∶1提高了8.53%.但之后有機(jī)溶劑量繼續(xù)增加時(shí),萃取率上升并不明顯.同時(shí)由圖4可得操作溫度大于45 ℃時(shí),萃取率趨于穩(wěn)定,但相對(duì)于室溫條件下提高了4.5%左右.

    由以上優(yōu)化的數(shù)據(jù)分析可得出,在發(fā)酵液的萃取預(yù)處理的過程中,以正丁醇為萃取試劑,最佳效益的萃取條件V有機(jī)相/V發(fā)酵液為2∶1,萃取溫度為45 ℃.

    圖1 有機(jī)溶劑對(duì)抗菌肽的萃取效率圖2 不同有機(jī)溶劑萃取液的抑菌效果

    圖3 V有機(jī)溶劑/V發(fā)酵液對(duì)萃取效果的影響圖4 溫度對(duì)萃取效果的影響

    3.2 反萃取條件優(yōu)化

    不同的V有機(jī)相/V超純水對(duì)反萃取效果的影響如圖5所示.不同溫度對(duì)反萃取效果的影響如圖6所示.有機(jī)相中殘留抗菌效價(jià)與反萃取次數(shù)的關(guān)系如圖7所示.由圖5、圖6、圖7可知,在實(shí)驗(yàn)操作中不同的V有機(jī)相/V超純水對(duì)反萃取的效果沒有較為顯著影響;相對(duì)于室溫環(huán)境,設(shè)定反萃取操作溫度為45 ℃時(shí),單次反萃取率有所提高.而在最適反萃取條件下進(jìn)行重復(fù)操作,進(jìn)行2次反萃取時(shí),反萃取率相對(duì)于單次操作提高了7.84%.因此,在反萃取操作中,設(shè)定V有機(jī)相/V超純水為1∶1、操作溫度為45 ℃、操作次數(shù)為2次時(shí)可獲得較好的反萃取效益,反萃取率接近61.28%.

    圖5 不同的V有機(jī)相/V超純水對(duì)反萃取效果的影響圖6 不同溫度對(duì)反萃取效果的影響

    圖7 有機(jī)相中殘留抗菌效價(jià)與反萃取次數(shù)的關(guān)系

    圖8 原發(fā)酵液蛋白豐度檢測(cè)結(jié)果

    3.3 蛋白豐度的檢測(cè)結(jié)果分析

    原發(fā)酵液樣品色譜檢測(cè)結(jié)果如圖8所示.由高效液相色譜檢測(cè)數(shù)據(jù)可以看出,在原發(fā)酵液樣品圖譜中出現(xiàn)峰數(shù)目較多,可見原發(fā)酵液中蛋白豐度較大,在此基礎(chǔ)上很難直接對(duì)抗菌肽進(jìn)行分離收集.但經(jīng)過有機(jī)萃取操作后,對(duì)比原發(fā)酵液的檢測(cè)結(jié)果后發(fā)現(xiàn),圖譜中峰數(shù)目明顯下降及大部分的雜蛋白組分可在正丁醇的作用下變性沉淀,繼而被除去(見圖9).進(jìn)一步經(jīng)過反萃取操作,對(duì)比圖9可知,分離時(shí)間大于6.5 min出現(xiàn)的蛋白組分在水相中溶解度較小并被截留在有機(jī)相中,水相的蛋白組分明顯下降(見圖10).因此通過以上兩步的操作,使得最終待分離體系中的蛋白組成相對(duì)簡(jiǎn)單,從而達(dá)到了較為理想的處理效果.

    圖9 萃取操作后溶于有機(jī)相蛋白豐度檢測(cè)結(jié)果

    圖10 反萃取操作后溶于水相蛋白豐度檢測(cè)結(jié)果

    4 結(jié)論

    有機(jī)萃取是抗菌肽純化工藝中發(fā)酵液的預(yù)處理方法,相比與其他方法具有高效簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn).以正丁醇為有機(jī)萃取劑,在合適的V有機(jī)相/V發(fā)酵液和操作溫度條件下,可使地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中抗菌肽最大限度地轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中,然后進(jìn)一步進(jìn)行反萃取操作,對(duì)影響其效果的操作溫度和反萃取操作次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化.在45 ℃條件下,二次反萃取率接近61.28%,萃取操作可使發(fā)酵液中大多數(shù)雜蛋白組分被除去,使得后期高效液相色譜的分離工作難度大大降低,從而起到了相應(yīng)的預(yù)處理效果.

    [1] 全艷玲.地衣芽孢桿菌對(duì)有害微生物的拮抗作用[J].食品科學(xué),2002,8(22):68-69.

    [2] 喻鋼,田萬紅,董思國(guó),等.枯草芽孢桿菌抗菌肽的分離純化及質(zhì)譜檢測(cè)[J].藥物分析雜志,2014,34(10):1 902-1 906.

    [3] 張亞,蘇品,廖曉蘭,等.多肽的分離純化技術(shù)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志,2013,33(5):87-91.

    [4] 龐秀枰,馬裕欽.小分子肽分離技術(shù)研究進(jìn)展[J].廣東化工,2015,2(42):89-90.

    [5] 胡瑞萍,張鐸,張麗萍,等.枯草芽孢桿菌BSD-2一種抗菌肽的分離純化與鑒定[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2011,26(6):201-206.

    [6] 劉靜,王軍,姚建銘,等.枯草芽孢桿菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分離純化[J].微生物學(xué)報(bào),2004,44(4):511-514.

    [7] 劉穎,徐慶,陳章良.抗真菌肽LP-1的分離純化及特性分析[J].微生物學(xué)報(bào),1999,30(5):441-449.

    [8] T WANG,Y F LIANG,M B WU,et al.Natural products from bacillus subtilis with antimicrobial properties[J].Chinese Journal of Chemical Engineering,2015(23):744-754.

    [9] 溫小娟,閆淑珍,劉維紅,等.拮杭性類芽孢桿菌F53菌株的固體發(fā)酵條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(2):461-463.

    [10] 沈萍,范秀榮,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社,2006.

    [11] 曾東方,陳玢,桓嬌,等.塑料管碟法測(cè)定抗生素的抗菌活性[J].生物學(xué)通報(bào),2011,46(8):48.

    [12] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典附錄Ⅵ[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2005.

    猜你喜歡
    超純水有機(jī)溶劑抗菌肽
    Synthesis of new non-fluorous 2,2'-bipyridine-4,4'-dicarboxylic acid esters and their applications for metal ions extraction in supercritical carbon dioxide
    小水量超純水制備系統(tǒng)的最佳工藝選擇
    抗菌肽的生物學(xué)特性及在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用
    新型抗菌肽菌絲霉素純化工藝研究
    廣東飼料(2016年5期)2016-12-01 03:43:21
    同種異體骨產(chǎn)品中有機(jī)溶劑殘留分析
    抗菌肽修飾方法與抗菌機(jī)制的研究進(jìn)展
    雜銅冶煉廠超純水管路系統(tǒng)的設(shè)計(jì)
    MSL抗菌肽對(duì)鼠傷寒沙門氏菌感染的預(yù)防作用
    葉黃素在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性
    Sartorius arium pro 超純水系統(tǒng)
    岛国在线免费视频观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久人人精品亚洲av| 波多野结衣高清作品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 少妇的逼好多水| 久久亚洲真实| 99久久成人亚洲精品观看| 日韩精品中文字幕看吧| 精品国产三级普通话版| 69av精品久久久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人综合一区亚洲| 永久网站在线| 久久中文看片网| 国模一区二区三区四区视频| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲图色成人| 久久国产精品人妻蜜桃| 直男gayav资源| 免费黄网站久久成人精品| 国产亚洲精品av在线| ponron亚洲| 国产精品人妻久久久影院| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 成人国产麻豆网| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲成a人片在线一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久精品影院6| 日本欧美国产在线视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久香蕉精品热| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 热99re8久久精品国产| 成人综合一区亚洲| 久久久午夜欧美精品| 男女边吃奶边做爰视频| 久久精品国产亚洲网站| 色综合婷婷激情| 日本免费一区二区三区高清不卡| 麻豆国产97在线/欧美| 好男人在线观看高清免费视频| 久久人妻av系列| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧美3d第一页| 亚洲国产精品合色在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜福利在线观看吧| 亚洲不卡免费看| 少妇高潮的动态图| 久久久成人免费电影| 亚洲精华国产精华精| 欧美高清性xxxxhd video| 国产精品亚洲美女久久久| 老司机深夜福利视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| x7x7x7水蜜桃| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日本a在线网址| 国产淫片久久久久久久久| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产高潮美女av| 五月伊人婷婷丁香| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美激情在线99| 少妇人妻精品综合一区二区 | 婷婷亚洲欧美| 1000部很黄的大片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 1024手机看黄色片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 人人妻人人看人人澡| 中文字幕高清在线视频| 欧美日本视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 午夜福利在线观看吧| 精品人妻熟女av久视频| 男女那种视频在线观看| 免费看光身美女| 亚洲av中文av极速乱 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 看片在线看免费视频| 999久久久精品免费观看国产| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲无线在线观看| 69人妻影院| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av女优亚洲男人天堂| 国产视频内射| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 可以在线观看毛片的网站| 国产老妇女一区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 哪里可以看免费的av片| 亚洲五月天丁香| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美3d第一页| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲经典国产精华液单| 午夜福利在线在线| 精华霜和精华液先用哪个| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美在线一区亚洲| 国产中年淑女户外野战色| 直男gayav资源| 日韩精品中文字幕看吧| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产一区二区三区视频了| 久久久午夜欧美精品| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品乱码久久久久久99久播| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 在线免费十八禁| 最近最新中文字幕大全电影3| 99热精品在线国产| av在线亚洲专区| 日本成人三级电影网站| 日日啪夜夜撸| 长腿黑丝高跟| 久久久色成人| 亚洲avbb在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 特级一级黄色大片| 搞女人的毛片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 草草在线视频免费看| 免费观看人在逋| 麻豆成人午夜福利视频| 美女高潮的动态| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99久久九九国产精品国产免费| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产三级在线视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 男女视频在线观看网站免费| 简卡轻食公司| 婷婷丁香在线五月| 免费观看精品视频网站| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 88av欧美| 色播亚洲综合网| 欧美色视频一区免费| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产精品野战在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产亚洲91精品色在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产麻豆成人av免费视频| 免费观看的影片在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 老女人水多毛片| 免费无遮挡裸体视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 91av网一区二区| 两个人视频免费观看高清| 国产人妻一区二区三区在| 中文在线观看免费www的网站| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 黄色日韩在线| 国产高潮美女av| 欧美精品国产亚洲| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩亚洲欧美综合| 精品日产1卡2卡| 国产精品野战在线观看| 午夜福利高清视频| 精品一区二区免费观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 韩国av在线不卡| 国产精品人妻久久久久久| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲乱码一区二区免费版| 男女之事视频高清在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 最近最新中文字幕大全电影3| 免费看光身美女| 亚洲乱码一区二区免费版| 中文字幕熟女人妻在线| 久久国内精品自在自线图片| 观看免费一级毛片| 成人永久免费在线观看视频| 国产高清视频在线播放一区| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美性感艳星| 国产日本99.免费观看| 国产成人一区二区在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲18禁久久av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲真实伦在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲第一电影网av| 成人国产综合亚洲| av国产免费在线观看| av在线天堂中文字幕| 欧美色欧美亚洲另类二区| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲成人久久性| 欧美黑人欧美精品刺激| 春色校园在线视频观看| 久久精品国产亚洲av天美| 精品福利观看| 精品国产三级普通话版| 成人午夜高清在线视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日本熟妇午夜| 五月伊人婷婷丁香| 69av精品久久久久久| 成人亚洲精品av一区二区| 成人永久免费在线观看视频| av天堂在线播放| 淫秽高清视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 内射极品少妇av片p| 色哟哟哟哟哟哟| 他把我摸到了高潮在线观看| 天美传媒精品一区二区| 午夜激情欧美在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| a级毛片免费高清观看在线播放| 三级毛片av免费| 日韩一区二区视频免费看| 永久网站在线| 麻豆国产97在线/欧美| 性欧美人与动物交配| 麻豆一二三区av精品| 22中文网久久字幕| 成年女人永久免费观看视频| 在线看三级毛片| 天天一区二区日本电影三级| avwww免费| 九九热线精品视视频播放| 在线免费十八禁| 黄色欧美视频在线观看| 麻豆成人av在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 日日干狠狠操夜夜爽| 99热6这里只有精品| 在线播放无遮挡| 午夜福利高清视频| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 成人国产麻豆网| 日本欧美国产在线视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 麻豆久久精品国产亚洲av| 97超视频在线观看视频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 免费人成视频x8x8入口观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 全区人妻精品视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久亚洲真实| 久久久久精品国产欧美久久久| 小说图片视频综合网站| 精华霜和精华液先用哪个| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲av二区三区四区| 五月玫瑰六月丁香| 禁无遮挡网站| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩精品青青久久久久久| 九九热线精品视视频播放| 男人狂女人下面高潮的视频| 网址你懂的国产日韩在线| 国产主播在线观看一区二区| 午夜激情欧美在线| 免费av观看视频| 亚洲成人久久性| 亚洲最大成人av| 婷婷丁香在线五月| 亚洲午夜理论影院| 1000部很黄的大片| 长腿黑丝高跟| 美女 人体艺术 gogo| 人人妻人人看人人澡| 国产真实伦视频高清在线观看 | 欧美激情国产日韩精品一区| 村上凉子中文字幕在线| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品,欧美在线| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品国产高清国产av| 成年女人永久免费观看视频| 99热这里只有是精品在线观看| 少妇高潮的动态图| 色哟哟·www| 成年免费大片在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲av免费在线观看| 亚洲四区av| 搞女人的毛片| 亚洲精品色激情综合| 1024手机看黄色片| av在线亚洲专区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲成人久久爱视频| 人人妻人人看人人澡| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久久久国内视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日本一二三区视频观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲无线观看免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲av成人精品一区久久| 男女啪啪激烈高潮av片| 两个人视频免费观看高清| 国产精品伦人一区二区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美一区二区亚洲| 国产精品久久电影中文字幕| 一区二区三区激情视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 偷拍熟女少妇极品色| 观看免费一级毛片| 一进一出抽搐gif免费好疼| av在线天堂中文字幕| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产一区二区三区视频了| av在线天堂中文字幕| 成人美女网站在线观看视频| 免费看a级黄色片| 欧美成人a在线观看| 日韩欧美在线乱码| 高清日韩中文字幕在线| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲色图av天堂| 床上黄色一级片| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久香蕉精品热| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品永久免费网站| 又粗又爽又猛毛片免费看| 中亚洲国语对白在线视频| 国产成人一区二区在线| 免费电影在线观看免费观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美最新免费一区二区三区| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品日韩av在线免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 少妇人妻精品综合一区二区 | АⅤ资源中文在线天堂| 欧美色视频一区免费| 国产探花极品一区二区| 十八禁网站免费在线| 免费黄网站久久成人精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 精品国产三级普通话版| 中文字幕免费在线视频6| www日本黄色视频网| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产探花在线观看一区二区| 精品久久久久久久久av| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久久国产成人精品二区| 色在线成人网| 色av中文字幕| 99热网站在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| a级一级毛片免费在线观看| 日韩强制内射视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 一区二区三区高清视频在线| 韩国av在线不卡| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲最大成人手机在线| 成人av一区二区三区在线看| 在线看三级毛片| 国产 一区精品| 亚洲人成网站在线播| 丰满的人妻完整版| 亚洲在线自拍视频| a级毛片a级免费在线| 国产伦在线观看视频一区| 制服丝袜大香蕉在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日韩欧美精品免费久久| 国产高潮美女av| 99热6这里只有精品| 日韩欧美精品v在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 美女黄网站色视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 男女之事视频高清在线观看| av福利片在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 22中文网久久字幕| 免费看日本二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产 一区 欧美 日韩| 天堂√8在线中文| 国产精品人妻久久久久久| 一个人免费在线观看电影| 国产黄片美女视频| 1024手机看黄色片| 欧美又色又爽又黄视频| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久久久久久大av| 中文字幕久久专区| 亚洲最大成人av| 欧美精品啪啪一区二区三区| 一本久久中文字幕| 亚洲 国产 在线| 成人二区视频| 99热这里只有精品一区| 亚洲av.av天堂| 啦啦啦韩国在线观看视频| 我要看日韩黄色一级片| 精品福利观看| 国产淫片久久久久久久久| 日本五十路高清| 老司机福利观看| 国产精品,欧美在线| 国产精品野战在线观看| 级片在线观看| 少妇的逼好多水| 搡老熟女国产l中国老女人| 狠狠狠狠99中文字幕| 在线a可以看的网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品伦人一区二区| 免费电影在线观看免费观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲电影在线观看av| 午夜激情福利司机影院| 一区福利在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲国产精品合色在线| 午夜精品在线福利| 亚洲美女黄片视频| 午夜久久久久精精品| 哪里可以看免费的av片| 国产探花极品一区二区| 免费观看的影片在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美高清性xxxxhd video| 国产亚洲91精品色在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| a在线观看视频网站| 22中文网久久字幕| 成人亚洲精品av一区二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 色5月婷婷丁香| 久久亚洲真实| ponron亚洲| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 天天一区二区日本电影三级| 国产亚洲av嫩草精品影院| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲美女搞黄在线观看 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产综合懂色| 美女xxoo啪啪120秒动态图| h日本视频在线播放| 成人av在线播放网站| 国产一区二区三区av在线 | 内地一区二区视频在线| 亚洲熟妇熟女久久| 日韩精品中文字幕看吧| 国产真实乱freesex| 亚洲自拍偷在线| 国产 一区 欧美 日韩| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品98久久久久久宅男小说| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一a级毛片在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一夜夜www| 亚洲国产高清在线一区二区三| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品精品国产色婷婷| 国产老妇女一区| 成人性生交大片免费视频hd| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜久久久久精精品| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美激情久久久久久爽电影| 午夜免费激情av| 国产三级在线视频| av在线老鸭窝| 男女之事视频高清在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 如何舔出高潮| 床上黄色一级片| 色综合色国产| 51国产日韩欧美| 国内揄拍国产精品人妻在线| 波多野结衣巨乳人妻| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲第一电影网av| 乱人视频在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 麻豆av噜噜一区二区三区| 久久久久久久久大av| 中国美白少妇内射xxxbb| 男人的好看免费观看在线视频| 午夜免费成人在线视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 免费看日本二区| 天堂√8在线中文| 白带黄色成豆腐渣| bbb黄色大片| 搡女人真爽免费视频火全软件 | h日本视频在线播放| 午夜激情福利司机影院| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产亚洲欧美98| 亚洲18禁久久av| 国产毛片a区久久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲性久久影院| 精品欧美国产一区二区三| av中文乱码字幕在线| 99热这里只有精品一区| 在线免费观看的www视频| x7x7x7水蜜桃| 看片在线看免费视频| or卡值多少钱| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲七黄色美女视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 最近在线观看免费完整版| 欧美又色又爽又黄视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 成人国产麻豆网| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| 看片在线看免费视频| 午夜亚洲福利在线播放| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 特大巨黑吊av在线直播| 99久久中文字幕三级久久日本| 99久久精品一区二区三区| 乱人视频在线观看| 国产黄片美女视频| 欧美色视频一区免费| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲国产精品久久男人天堂| 十八禁网站免费在线| av在线亚洲专区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 身体一侧抽搐| 韩国av在线不卡| 热99在线观看视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 我要看日韩黄色一级片| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜福利成人在线免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 麻豆久久精品国产亚洲av| 在线播放国产精品三级| 69人妻影院|