白芨生肌膏對(duì)肛腸病術(shù)后創(chuàng)面HSP70基因表達(dá)的臨床觀察

楊斌

肛腸直腸病是指肛門直腸有關(guān)的一系列疾病[1]，常見的有痔、肛裂、肛瘺等臨床常見病、多發(fā)病，其治療方法主要以手術(shù)為主，但由于術(shù)野易受糞便污染，故手術(shù)創(chuàng)面完全開放，以二期愈合的方式愈合。手術(shù)創(chuàng)面部位比較特殊，創(chuàng)面愈合難度較大，愈合時(shí)間較普通手術(shù)切口更長(zhǎng)，嚴(yán)重影響了患者的生活。目前，對(duì)肛腸病術(shù)后創(chuàng)面愈合的認(rèn)識(shí)是一種理論的推斷，缺乏有力的研究證據(jù)。部分學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[2]熱休克蛋白70（HSP70）與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)。HSP70在創(chuàng)面愈合過程中，以綁定抗原肽和轉(zhuǎn)運(yùn)到抗原遞呈細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的方式，形成了免疫應(yīng)答，進(jìn)而激發(fā)創(chuàng)面皮膚愈合。本院肛腸科白芨生肌膏紗條換藥促進(jìn)肛腸病術(shù)后創(chuàng)面愈合療效顯著，但缺乏有力依據(jù)，本研究通過對(duì)術(shù)后創(chuàng)面組織HSP70表達(dá)量的觀察，客觀評(píng)價(jià)白芨生肌膏的臨床療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者主要來源于本院術(shù)后的住院患者，共收集40例。隨機(jī)分為治療組（n=20）和對(duì)照組（n=20）。治療組中男13例，女7例，年齡19～65歲，平均年齡（54.2±3.7）歲，病程3個(gè)月～2年，平均病程（12.6±4.8）個(gè)月。痔瘺類型：混合痔6例、肛瘺4例、外痔4例、內(nèi)痔3例、血栓痔2例、肛裂1例。對(duì)照組中男12例，女8例，年齡20～66歲，平均年齡（56.2±4.1）歲，病程3個(gè)月～2年，平均病程（13.7±3.6）個(gè)月。痔瘺類型：混合痔5例、肛瘺5例、外痔3例、內(nèi)痔4例、血栓痔2例、肛裂1例。所有患者參照[3]國(guó)家中醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)的《中醫(yī)肛腸病診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》及中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)肛腸外科學(xué)組制定的《痔診治暫行標(biāo)準(zhǔn)》得到確診。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。入選患者符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)切口分類屬于III類（污染）切口；②近5 d內(nèi)未用過相關(guān)外用藥物；③簽署知情同意書，接受研究治療方案。排除以下患者：①伴有糖尿病、惡性腫瘤、貧血、尿毒癥、黃疸及微量元素缺乏癥；②不能堅(jiān)持治療者，不能判斷療效者；③對(duì)藥物成分過敏者。

1.2 治療方法

1.2.1 白芨生肌膏的制作 按方（白芨50 g、生黃芪30 g、川芎10 g、生地榆30 g、五倍子30 g、丹參30 g、血竭10 g）將各藥均勻混合研成細(xì)粉。藥粉經(jīng)過100目篩篩選1次，浸泡在1 000 g芝麻油里放置3 d。將芝麻油用文火加熱，使藥粉呈棕褐色，雙層紗布過濾去除渣質(zhì)；待油溫降至50～60℃時(shí)，摻入蜂膠，全部攪拌均勻，完成白芨生肌膏的制作過程。

1.2.2 治療組 手術(shù)后第1天大便后使用白芨生肌膏創(chuàng)面換藥，每次換藥前均常規(guī)消毒，用白芨生肌膏制成的紗條填塞創(chuàng)面基底部，每天換藥1次至創(chuàng)面愈合。

1.2.3 對(duì)照組 手術(shù)后第1天大便后使用馬應(yīng)龍龍珠軟膏制成的紗條填塞創(chuàng)面基底，每天換藥1次至創(chuàng)面愈合。

1.3 療效指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 取材及病理學(xué)觀察 選取術(shù)后治療前第1天，治療后第3天及第7天的創(chuàng)面組織標(biāo)本。取患者術(shù)后治療前第1天、術(shù)后第3、7天創(chuàng)面口組織，盛入病理學(xué)檢測(cè)專用epp管中，迅速放入液氮罐內(nèi)以保持組織DNA內(nèi)的HSP70的性質(zhì)，供基因表達(dá)量檢測(cè)之用。

1.3.2 創(chuàng)面局部HSP70含量和檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)HSP70編碼基因的表達(dá)，HSP70及內(nèi)參（β-action）所用的引物序列由大連寶生物科技公司設(shè)計(jì)合成，HSP70上游引物：5’-CGC GAA TTC GAG GTG AAA GAC GTT CTG CTG C-3’；HSP70下游引物：5’-TAG TCG ACT CAA ATG CCG TTG GCG TCG-3’；從液氮中取出已準(zhǔn)備好的標(biāo)本，根據(jù)RT-PCR試劑盒、總RNA提取試劑盒說明提取組織中mRNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增HSP70。

1.3.3 臨床癥狀評(píng)價(jià) 對(duì)兩組術(shù)后創(chuàng)緣水腫消退時(shí)間和創(chuàng)面愈合時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 研究中采集的各項(xiàng)數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。其中HSP70定量結(jié)果作為計(jì)量資料內(nèi)以“x±s”表示，采用t檢驗(yàn)和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因相對(duì)定量表達(dá) 采用ΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量，來比較目的基因。HSP70目的基因Ct值由實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)曲線得到，見圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)曲線Figure 1 Real time fluorescence PCR reaction curve

2.2 兩組患者創(chuàng)面組織HSP70 mRNA表達(dá)量比較 肛腸病術(shù)后后患者第1天創(chuàng)面組織中HSP70 mRNA表達(dá)量?jī)山M比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；手術(shù)后第3天患者創(chuàng)面組織中HSP70 mRNA表達(dá)量比較，治療組比對(duì)照組有明顯增加（P＜0.05）；手術(shù)后第7天創(chuàng)面組織中HSP70 mRNA表達(dá)量比較，治療組比對(duì)照組有顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

3 討論

肛腸疾病手術(shù)屬于污染切口，一般主張創(chuàng)面二期愈合，術(shù)后創(chuàng)面愈合的時(shí)間長(zhǎng)短不一，受許多因素的影響，術(shù)前的準(zhǔn)備，手術(shù)中的操作，手術(shù)方式，術(shù)后的護(hù)理等都可以影響肛門創(chuàng)面愈合的時(shí)間[4-5]。由于肛門區(qū)處于軀體最低位，糞便通過的出口，肛周皮膚及皮下組織松弛具有彈性，術(shù)后創(chuàng)面難以在短時(shí)間內(nèi)愈合，而且疼痛感明顯。創(chuàng)面愈合的機(jī)制目前仍不明確，非常復(fù)雜，按愈合的時(shí)間段分為炎癥期、纖維增生期、重塑期。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展，研究者發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面愈合與HSP呈正相關(guān)性，HSP是一種應(yīng)激時(shí)新合成或合成增多的保護(hù)性蛋白，在細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化的生物活性，可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)損害的耐受程度，幫助線粒體恢復(fù)損傷，增加內(nèi)源性抗氧化劑的合成和釋放，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[6]。所以，我們應(yīng)該規(guī)范術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后的操作，盡量減少術(shù)后的疼痛、感染、水腫等并發(fā)癥，同時(shí)提高創(chuàng)面組織對(duì)熱休克蛋白的表達(dá)，更好地促進(jìn)創(chuàng)面愈合。油膏劑作為中醫(yī)的傳統(tǒng)藥膏劑型，能直接作用于創(chuàng)面，發(fā)揮局部的治療作用，尤其適合創(chuàng)面愈合的治療[7]。

從本研究結(jié)果表明本方白芨生肌膏能明顯提高創(chuàng)面組織HSP70的表達(dá)，對(duì)術(shù)后創(chuàng)面進(jìn)行白芨生肌膏局部換藥，檢測(cè)治療組第3、7天創(chuàng)面組織中HSP70 mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，這證實(shí)白芨生肌膏創(chuàng)面換藥能誘導(dǎo)機(jī)體合成HSP70，促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)面組織愈合。白芨生肌膏方中白芨、生地榆、五倍子具有收濕、斂瘡、生肌的功效，丹參、龍血竭具有活血化瘀，加之川芎、生黃芪能促進(jìn)機(jī)體在創(chuàng)傷后合成熱休克蛋白，諸藥合用，共奏活血化瘀、收斂生肌之功，同時(shí)油膏制劑對(duì)創(chuàng)面保護(hù)，創(chuàng)造濕潤(rùn)環(huán)境，促進(jìn)局部血液循環(huán)，誘導(dǎo)創(chuàng)面組織合成HSP70，加快創(chuàng)面修復(fù)時(shí)間，從而使創(chuàng)面又好、又快地愈合[8]。

綜上所述，白芨生肌膏具有活血化瘀、收斂生肌功效，能增強(qiáng)術(shù)后創(chuàng)面組織HSP70表達(dá)，加速肛腸疾病手術(shù)后創(chuàng)面的愈合。同時(shí)該方法安全有效、制作簡(jiǎn)單、容易操作、藥簡(jiǎn)價(jià)廉，在臨床中能更好地推廣。

[1] 陸德銘,陸金根.實(shí)用中醫(yī)外科學(xué)[M].2版.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2010:320.

[2] Li W,Li Y,Guan S,et al.Extracellular heat shock protein-90alpha:linking hypoxia to skin cell motility and wound healing[J].EMB0 J,2007,26(5):1221-1233.

[3] 丁志輝.熱休克蛋白70的胃腸黏膜分子伴侶保護(hù)作用及免疫調(diào)節(jié)功能[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,49(1):136-138.

[4] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)[M].南京.南京大學(xué)出版社,1994:132-133.

[5] 湯毅珊,王寧生.雄黃及雄黃復(fù)方對(duì)應(yīng)激蛋白HSP和H0-1的影響[J].中藥藥理與臨床雜志,2008,24(3):48-51.

[6] 楊娥,張恒術(shù).燒傷創(chuàng)面愈合后瘢痕組織成纖維細(xì)胞DNA甲基化初步研究[J].中國(guó)燒傷創(chuàng)瘍雜志,2015,27(3):219-223.

[7] 張曉芬,孫桂芳,陳亞峰,等.活血化瘀中藥促進(jìn)創(chuàng)面愈合的研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī),2015(8):1816-1820.

[8] 趙前思,王雄,吳金虎.外用中藥促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合機(jī)制的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2014,20(16):3003-3005.