杉木木糖合成酶基因ClUAXS2的全長(zhǎng)克隆與分析

張 穎，蘇爍爍，陳婉婷，陳冉紅，李 明,2*，馬祥慶,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002；2.國(guó)家林業(yè)局 杉木工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

UDP-木糖(UDP-Xyl)是植物體內(nèi)由D-葡萄糖醛酸脫羧而成的一種尿苷二磷酸五碳糖，主要作為糖基供體合成植物半纖維素木聚糖[1]、木葡聚糖[2]等多糖物質(zhì)，與植物細(xì)胞壁生長(zhǎng)和木材的形成密切相關(guān)。UDP-木糖也可通過(guò)核苷糖之間的合成和轉(zhuǎn)化途徑參與形成一些植物天然小分子化合物的次生代謝過(guò)程，是合成糖蛋白或糖脂的主要成分[4-6]。UDP-芹菜糖(UDP-Api)是合成高等植物細(xì)胞壁中的果膠多糖物質(zhì)鼠李糖半乳聚糖Ⅱ(RG-Ⅱ)的一種支鏈五碳糖，通過(guò)在植物生長(zhǎng)發(fā)育中交聯(lián)細(xì)胞壁多糖和硼酸而起作用[7-8]，一般在植物體內(nèi)含量較少，對(duì)于富含芹菜苷的浮萍(Spirodelapolyrhiza)和歐芹(Petroselinumcrispum)，合成UDP-Api的研究早已存在[9-11]。UDP-木糖和UDP-芹菜糖是構(gòu)成植物細(xì)胞壁初生壁和次生壁多糖的主要組分，同時(shí)還參與了植物果膠聚糖的組成及相關(guān)糖蛋白中糖鏈的構(gòu)成。因此，用于合成UDP-木糖和UDP-芹菜糖的糖苷合成轉(zhuǎn)化酶的結(jié)構(gòu)和功能備受關(guān)注。植物體內(nèi)可用于同時(shí)合成UDP-木糖和UDP-芹菜糖的作用酶為UDP-木糖合成酶(UDP-D-Apiose/ UDP-D-Xylose synthase，UAXS)，其能夠催化UDP-葡萄糖醛酸形成UDP-木糖和UDP-芹菜糖2種糖基供體。

植物體內(nèi)第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)和鑒定的UDP-木糖合成酶(UDP-D-Xylose synthase，UXS)為擬南芥(Arabidopsisthaliana)的AtUXS1[12],隨后于2003年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)既能合成UDP-木糖，也能合成UDP-芹菜糖的雙功能酶AtAXS1[13]。其中，UXS在NAD+作為輔酶參與下通過(guò)不可逆的脫羧反應(yīng)將UDP-葡萄醛酸(UDP-D-GlcA)轉(zhuǎn)化成為UDP-Xyl[13]。采用病毒誘導(dǎo)基因沉默的方法對(duì)煙草(Nicotianabenthamiana)NbAXS1基因研究表明，NbAXS1蛋白酶定位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)NbAXS1基因沉默之后，植株生長(zhǎng)停滯，同時(shí)由于細(xì)胞壁中RG-Ⅱ缺乏致使煙草細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)異常[14]。UAXS還能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)UDP- Xyl和UDP-Api的合成，通常情況下植物細(xì)胞壁中木糖的含量遠(yuǎn)高于芹菜糖。對(duì)虎眼萬(wàn)年青(Ornithogalumcaudatum)的UXS與UAXS家族基因的克隆與功能分析發(fā)現(xiàn)，UXS與UAXS雖具有相似催化功能，但是兩者的活性條件有所不同，金屬離子的濃度與種類影響著UDP-木糖和UDP-芹菜糖最終的合成比例[15]。

植物木糖合成酶基因家族是催化植物UDP-糖基供體相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的研究不僅能夠?yàn)橹参锾烊划a(chǎn)物糖基化研究提供指導(dǎo)，而且有助于分析植物細(xì)胞壁的形成，各成分功能和人工改造細(xì)胞壁構(gòu)造。目前，對(duì)植物的木糖合成酶基因家族的研究除了模式植物擬南芥[12-13,16]和水稻(Oryzasativa)[17-18]外，對(duì)一些經(jīng)濟(jì)作物和藥用植物如大麥(Hordeumvulgare)[19]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[20]、虎眼萬(wàn)年青[15,21]等的木糖合成酶基因參與糖類代謝和糖基化產(chǎn)物合成的研究也較為深入。對(duì)木本植物木糖合成酶基因的研究?jī)H見毛白楊(Populustomentosa)[22]、桃(Prunuspersica)[23]等，但對(duì)杉科植物的UXS與UAXS家族成員并沒有報(bào)道。杉木(Cunninghamialanceolata)是我國(guó)南方林區(qū)主要的人工造林樹種，具有速生、豐產(chǎn)、材質(zhì)優(yōu)良的特點(diǎn)[24]。同時(shí)，杉木的根、節(jié)、皮中的一些天然小分子糖基產(chǎn)物還具有重要的藥用價(jià)值[25-27]。因此，對(duì)杉木木糖合成酶基因UXS/UAXS的克隆和表達(dá)研究，不僅有助于認(rèn)識(shí)細(xì)胞壁初生壁和次生壁多糖的主要組分UDP-木糖和UDP-芹菜糖的合成和轉(zhuǎn)化過(guò)程，也有助于了解杉木核苷糖基供體的合成和代謝途徑，為杉木木材形成和代謝機(jī)制研究提供參考。本試驗(yàn)從杉木轉(zhuǎn)錄組中獲取了木糖合成酶基因的中間片段，經(jīng)過(guò)RACE基因全長(zhǎng)克隆與qPCR表達(dá)分析，獲得了杉木ClUAXS2基因的全長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)情況，研究結(jié)果為認(rèn)識(shí)杉木ClUAXS2基因合成和轉(zhuǎn)化UDP-木糖和UDP-芹菜糖的過(guò)程和途徑提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

杉木4號(hào)、25號(hào)、32號(hào)無(wú)性系1年生幼苗均采集于國(guó)家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心。采用水培法培養(yǎng)杉木幼苗1周后，采集幼苗根、莖和葉進(jìn)行基因克隆和組織特異表達(dá)試驗(yàn)。采用RNAprep Pure Plant 植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司)提取試驗(yàn)材料的總RNA，并采用Fermentas公司RT-PCR試劑盒合成cDNA第1條鏈，用于后續(xù)的基因克隆和基因表達(dá)驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2 杉木ClUAXS2基因全長(zhǎng)的克隆

從前期獲得的杉木莖轉(zhuǎn)錄組SRX2586188中篩選獲得高表達(dá)豐度的Unigene 200084_g1的cDNA片段，在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋結(jié)果為推定的UDP-木糖/UDP-芹菜糖合成酶2(UDP-D-Apiose/ UDP-D-Xylose synthase 2)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中cDNA片段利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)序列驗(yàn)證引物A415F和A415R，對(duì)杉木莖cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(OMEGA)回收純化后，與pMD18T載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化得到陽(yáng)性克隆并測(cè)序，獲得目的基因核心片段。

目的基因的5′端與3′端序列克隆獲取方式參考文獻(xiàn)[28-29]。利用目的基因核心片段，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3條特異性5′RACE引物和2條特異性3′RACE引物(表2)。使用SUPERSCRIPT II RT 酶和引物5′RACE-1 合成目的基因第一鏈cDNA，純化經(jīng)RNAase處理過(guò)的cDNA后，使用TdT酶和dCTP對(duì)純化后的cDNA進(jìn)行末端加上dC尾。使用引物5′RACE-2和橋連鉚釘引物AAP對(duì)已經(jīng)加dC尾的純化cDNA進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增，然后再使用引物5′RACE-3和橋連通用擴(kuò)增引物AUAP進(jìn)行巢式PCR第2輪擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后獲得目的基因的5′端序列。使用試劑盒中的逆轉(zhuǎn)錄酶和引物3′CDS primer A對(duì)杉木總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA，使用特異性引物3′RACE-1和 UPM進(jìn)行3′端的第1輪PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行稀釋50倍處理，并使用引物3′RACE-2和 UPM對(duì)稀釋后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，收集第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得目的基因的3′端序列。

根據(jù)獲得的目的基因核心片段、5′RACE片段和3′RACE片段的序列信息，將3段序列通過(guò)軟件Vector NTI 10.3.0拼接后，獲得Unigene 200084_g1的全長(zhǎng)cDNA 序列。引物合成與陽(yáng)性結(jié)構(gòu)測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。

表1 PCR反應(yīng)程序Table 1 PCR reaction program

表2 全長(zhǎng)克隆引物序列Table 2 Full length cloned primer sequence

1.3 ClUAXS2基因生物信息學(xué)分析

采用NCBI提供的ORF finder程序分析基因的開放閱讀框ORF；采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析和編碼氨基酸翻譯；使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性質(zhì)與氨基酸組成；使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)蛋白疏水性；通過(guò)SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)編碼蛋白信號(hào)肽、采用NetPhos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)預(yù)測(cè)分析蛋白磷酸化位點(diǎn)、使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；利用PredictProtein(https://ppopen.informatik.tu-muenchen.de/)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)建模預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)NCBI的BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行氨基酸同源性分析；利用ClustalX2.0軟件進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)，使用MEGA5.0軟件中的鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[30-32]。

1.4 ClUAXS2基因表達(dá)分析

使用Promega公司的qPCR Master Mix試劑盒，在StepOnePlus Real-Time PCR System儀器上進(jìn)行熒光定量PCR，分析目的基因在杉木4號(hào)、25號(hào)、32號(hào)家系根、莖、葉中的表達(dá)情況，并設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)目的基因的非保守區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量引物為ClUAXS2-F：5′-TCCTCTGGTGGCAA- TTCTGT-3′和ClUAXS2-R：5′-GGAGCCCTGATGATGATCGA-3′。選擇β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，其引物為β-Actin-F：5′-TACATTGCCGGTGTATTGAACGTC-3′和β-Actin-R：5′-AGTTGCTCCAGAAGAACATCC-3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95℃預(yù)變性3 min； 95℃變性20 s， 60℃退火30 s， 72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，60℃ 30 s，逐漸升溫到95℃，速度為0.11℃·s-1；采用Q=E-△△CT法來(lái)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，E為使用默認(rèn)值2[28-29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ClUAXS2基因全長(zhǎng)的克隆

選取32號(hào)杉木莖的cDNA為模板，根據(jù)Unigenes c200084_g1基因核心序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)驗(yàn)證目的基因序列， PCR產(chǎn)物回收測(cè)序獲得了長(zhǎng)度為1 161 bp的目的基因保守cDNA序列(圖1a)。根據(jù)目的基因保守cDNA序列，進(jìn)行目的基因5′RACE和3′RACE擴(kuò)增測(cè)序，獲得223 bp的5′端片段(圖1b)，以及475 bp的3′端片段(圖1c)；將目的基因的中間序列、5′端片段和3′端片段通過(guò)軟件拼接后，獲得1條完整長(zhǎng)度為1 634 bp的cDNA序列。通過(guò)NCBI的blastx方法比對(duì)相似序列，發(fā)現(xiàn)杉木c200084_g1基因所編碼的蛋白與其他植被UDP-木糖基因的編碼蛋白UDP-D-Apiose/ UDP-D-Xylose synthase 2(UAXS2)的相似性均>80%，因此將目的基因命名為杉木木糖合成酶基因ClUAXS2。

2.2 ClUAXS2基因生物信息學(xué)分析

2.2.1ClUAXS2基因序列分析 利用ProtParam在線分析杉木ClUAXS2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明ClUAXS2基因總長(zhǎng)度1 643 bp，包含1 158 bp的開放閱讀框，編碼1個(gè)含386個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中49個(gè)為酸性氨基酸，39個(gè)為堿性荷氨基酸，其余中性氨基酸，且異亮氨酸(8.8%)和亮氨酸(8.5%)含量最多。ClUAXS2基因編碼蛋白理論分子量為43.50 ku，等電位點(diǎn)為5.60(表明酸性氨基酸多于堿性氨基酸)；分子式組成為C1936H3026N524O578S19，不穩(wěn)定系數(shù)為47.84，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為85.91，評(píng)價(jià)表明總平均親水性為-0.318。使用ProtScale軟件中的Hphob./Kyte&Doolittle方法分析預(yù)測(cè)ClUAXS2基因編碼蛋白的親/疏水性。結(jié)果顯示，ClUAXS2基因的編碼蛋白中親水區(qū)域多于疏水區(qū)域；同時(shí)，第16位氨基酸處為疏水區(qū)最大值2.222，親水區(qū)最小值為第333位氨基酸的-2.767，因此判斷該編碼蛋白為親水蛋白(圖2)。

圖1 杉木ClUAXS2基因瓊脂糖凝膠電泳圖(a：保守cDNA；b：5′RACE；c：3′RACE)Fig.1 Cunninghamia lanceolata ClUAXS2 gene′s agarose gel electrophoresis (a：conserved sequence cDNA；b：5′RACE；c：3′RACE)

2.2.2ClUAXS2基因編碼蛋白信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)分析 在線軟件SignalP4.1通過(guò)分析ClUAXS2基因編碼的氨基酸序列中各個(gè)氨基酸的信號(hào)肽分值，預(yù)測(cè)分析該氨基酸序列是否存在信號(hào)肽，結(jié)果顯示，主要有原始剪切點(diǎn)分值(Cscore)、綜合剪切點(diǎn)分值(Yscore)以及信號(hào)肽值(Sscore)，其中當(dāng)最大Y值>闕值0.45時(shí)，判定該編碼蛋白存在信號(hào)肽。結(jié)果表明第1～10位氨基酸的平均Sscore為0.156，第11位氨基酸Y值最大，為0.133，均<闕值0.45；且1～10位氨基酸平均信號(hào)肽和最大剪接位點(diǎn)分值的平均為0.145，同樣<闕值0.45，因而推測(cè)ClUAXS2基因編碼蛋白不具有信號(hào)肽，不是分泌型蛋白(圖3)。ClUAXS2基因具有明顯的UAXS基因家族共同的保守結(jié)構(gòu)域和保守的氨基酸位點(diǎn)，如“GxxGxxG”NAD+結(jié)合區(qū)，“YxxxK”保守區(qū)、絲氨酸、蘇氨酸位點(diǎn)等。使用在線軟件NetPhos2.0預(yù)測(cè)分析ClUAXS2基因編碼蛋白的氨基酸位點(diǎn)(圖4)。結(jié)果表明，ClUAXS2基因編碼蛋白具有9個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸修飾位點(diǎn)，4個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸修飾位點(diǎn)以及3個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸修飾位點(diǎn)。TMHMM Server在線軟件預(yù)測(cè)ClUAXS2基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)表明，該編碼蛋白僅具有1個(gè)疑似跨膜區(qū)域，位于第11～31位氨基酸殘基范圍內(nèi)(圖5)。

圖2 ClUAXS2基因親/疏水性曲線Fig.2 Hydrophilic / hydrophobic curves of ClUAXS2 gene

圖3 ClUAXS2基因信號(hào)肽分析與預(yù)測(cè)Fig.3 Analysis and prediction of signal peptide of ClUAXS2 gene

2.2.3ClUAXS2基因蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 使用PredictProtein工具預(yù)測(cè)ClUAXS2基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該編碼主要結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲Loop環(huán)，占該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)總體的50.26%，其次為34.97%的α-螺旋，以及14.77%的β-折疊。通過(guò)在線軟件SWISS-MODEL預(yù)測(cè)ClUAXS2基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)，發(fā)現(xiàn)構(gòu)成該蛋白質(zhì)的主要三級(jí)骨架是α-螺旋和Loop環(huán)。且ClUAXS2基因編碼蛋白總共有8個(gè)可能的二硫鍵形成位點(diǎn)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示位于細(xì)胞質(zhì)中。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，還顯示ClUAXS2基因編碼蛋白具有4個(gè)功能蛋白位點(diǎn)，分別為7個(gè)磷酸化位點(diǎn)，5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)和5個(gè)N?；稽c(diǎn)。

圖4 ClUAXS2基因磷酸化位點(diǎn)分析與預(yù)測(cè)Fig.4 Analysis and prediction of phosphorylation sites of ClUAXS2 gene

圖5 ClUAXS2基因跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)Fig.5 Transmembrane domain prediction of ClUAXS2 gene

圖6 ClUAXS2基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.6 Three level structure map of coding protein of ClUAXS2 gene

2.2.4ClUAXS2基因蛋白序列同源性分析 通過(guò)NCBI中的BLASTP工具對(duì)ClUAXS2基因蛋白序列進(jìn)行檢索與比對(duì)，結(jié)果顯示其屬于UAXS基因家族。使用軟件ClustalX2.0和MEGA5.0對(duì)ClUAXS2基因以及與其同源性較高的其他物種UAXS進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)。結(jié)果表明，ClUAXS2基因編碼氨基酸與其他物種相似性均在80%以上，其中與無(wú)油樟(Amborellatrichopoda)和可可樹(Theobromacacao)的相似度達(dá)到85%、86%，與擬南芥、葡萄(Vitisvinifera)、毛果楊(P.trichocarpa)的相似度均為84%。對(duì)比杉木與其他物種的木糖合成酶基因發(fā)現(xiàn)，其中有16個(gè)長(zhǎng)度超過(guò)5個(gè)氨基酸序列且序列完全一致的(深色陰影部分)，最長(zhǎng)為177～194共18個(gè)氨基酸(圖8)。

注：GenBank登錄號(hào)：琴葉擬南芥XP_020883807.1；擬南芥NP_563807.1；油菜XP_013657587.1；毛果楊XP_006384681.1；木薯XP_021611295.1；橡膠樹XP_021640429.1；芝麻XP_011088822.1；菠菜XP_021843735.1；番茄NP_001296729.1；馬鈴薯NP_001275341.1；可可樹EOY33604.1；甜櫻桃XP_021812132.1；桃XP_007205322.1；木豆XP_020230997.1；蔓花生XP_015935869.1；葡萄AEP17006.1；菠蘿XP_020110718.1；浮萍AOG75416.1；無(wú)油樟XP_006851788.1。

圖7ClUAXS2基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹
Fig.7 Phylogenetic tree ofClUAXS2 gene

2.3 ClUAXS2基因組織特異表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ClUAXS2基因在杉木4號(hào)、25號(hào)、32號(hào)無(wú)性系各個(gè)組織的表達(dá)情況，檢測(cè)顯示杉木ClUAXS2基因在其根、莖與葉中均有表達(dá)，其中ClUAXS2基因在莖中的相對(duì)表達(dá)量最高(圖9)。ClUAXS2基因在4號(hào)和32號(hào)杉木葉中的相對(duì)表達(dá)量要高于在根中的相對(duì)表達(dá)量；在25號(hào)杉木根中的相對(duì)表達(dá)量要高于在葉中的相對(duì)表達(dá)量。ClUAXS2基因在杉木4號(hào)、25號(hào)、32號(hào)無(wú)性系莖中的相對(duì)表達(dá)量不存在顯著差異(P>0.05)。ClUAXS2基因在杉木25號(hào)無(wú)性系根中的相對(duì)表達(dá)量與在杉木32號(hào)、4號(hào)無(wú)性系根中的相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)；ClUAXS2基因在杉木32號(hào)無(wú)性系葉中的相對(duì)表達(dá)量與在杉木25號(hào)、4號(hào)無(wú)性系葉中的相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)，這可能與杉木無(wú)性系間木糖、芹菜塘合成相關(guān)的代謝活性不同有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

UAXS是植物體內(nèi)可同時(shí)催化UDP-葡萄醛酸合成UDP-木糖和UDP-芹菜糖的雙功能酶，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)植物體內(nèi)木糖、芹菜糖的合成、分配和平衡都是非常重要的。以UDP-葡萄醛酸(UDP-D-GlcA)為底物，加之輔酶NAD+，UAXS可以將UDP-葡萄醛酸轉(zhuǎn)化成為UDP-木糖；同時(shí)，在UAXS作用下，通過(guò)脫羧反應(yīng)與碳骨架重新排列，底物UDP-葡萄醛酸轉(zhuǎn)化為UDP-木糖的反應(yīng)中同時(shí)有UDP-芹菜糖產(chǎn)生。植物體內(nèi)木糖的含量往往遠(yuǎn)超過(guò)芹菜糖，如樺木(Betula)中木糖的含量占全部核苷糖總量的30% 以上，而在一些松類植物上的含量卻<9% ；UDP-芹菜糖則是僅在高等植物細(xì)胞壁中存在的罕見支鏈五碳糖。本試驗(yàn)利用全長(zhǎng)克隆方法和PCR技術(shù)，從杉木中克隆獲得了1個(gè)編碼杉木木糖合成酶蛋白的基因ClUAXS2，包含1 643 bp全長(zhǎng)cDNA序列，其中包括1 158 bp的開放閱讀框。杉木ClUAXS2基因編碼的木糖合成酶蛋白分子量為43.5 ku，與已報(bào)道的虎眼萬(wàn)年青的OcUAXS1/2的44.1、43.9 ku相似，不同于早前擬南芥中的AtAXS1/2。ClUAXS2基因編碼的蛋白沒有跨膜區(qū)，無(wú)信號(hào)肽且存在于細(xì)胞質(zhì)中，均與AtAXS1/2、OcUAXS1/2相同，且同樣具有“GxxGxxG”NAD+結(jié)合區(qū)，“YxxxK”保守區(qū)，是植物細(xì)胞壁合成途徑中的重要糖苷蛋白。qPCR結(jié)果表明，ClUAXS2基因在杉木根、莖與葉中均有表達(dá)，在杉木莖中的相對(duì)表達(dá)量在各個(gè)組織中最高。ClUAXS2基因在不同無(wú)性系莖中的相對(duì)表達(dá)量不存在顯著差異，而在根與葉中的相對(duì)表達(dá)量存在一定的差異，這可能與杉木無(wú)性系間木糖、芹菜塘合成相關(guān)的代謝活性不同有關(guān)。

圖8 ClUAXS2基因編碼氨基酸序列Fig.8 Coded amino acid sequence of ClUAXS2 gene

注：相同組織部位比較中，不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)，相同字母表示不存在顯著差異(P>0.05)。

圖9ClUAXS2基因在不同杉木組織中的相對(duì)表達(dá)量
Fig.9 Expression analysis ofClUAXS2 genes in different tissues ofC.lanceolata

UAXS基因家族對(duì)于植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的正常合成和代謝具有重要意義，缺乏UAXS可以導(dǎo)致植物細(xì)胞與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)異?；蛩劳?。J.W.Ahn[14]等曾利用病毒誘導(dǎo)使煙草中的木糖合酶基因NbAXS1沉默，發(fā)現(xiàn)該基因亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)由于NbAXS1基因的沉默煙草的生長(zhǎng)有明顯的缺陷，大量細(xì)胞死亡[14]。因此，植物細(xì)胞UAXS基因功能的缺失會(huì)引起植物木糖代謝功能受阻，從而導(dǎo)致植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)育異常。同時(shí)，UDP-芹菜糖作為RG-Ⅱ與硼酸結(jié)合部位的附著點(diǎn)，缺失UAXS會(huì)導(dǎo)致植物缺少UDP-芹菜糖而減少與硼酸鹽交聯(lián)，則會(huì)引起細(xì)胞壁增厚，生長(zhǎng)受到抑制[14]。在虎眼萬(wàn)年青中發(fā)現(xiàn)OcUAXS1/2基因是虎眼萬(wàn)年青多糖代謝途徑中重要的一環(huán)，對(duì)于植物體內(nèi)木糖和芹菜糖的代謝平衡至關(guān)重要，進(jìn)而影響細(xì)胞壁合成和結(jié)構(gòu)的完整[15,21]。同時(shí)，UAXS編碼合成的UDP-木糖還可以作為重要的糖基供體，參與許多植物中生物活性物質(zhì)和藥用糖苷類物質(zhì)的合成。木薯(Manihotesculenta)的MeUAXS2可用于將合成淀粉的葡萄糖轉(zhuǎn)入合成其他代謝糖類[33]，虎眼萬(wàn)年青中的OcUAXS2參與虎眼萬(wàn)年青抗癌多糖的合成[21]。本研究從杉木中克隆獲得了一個(gè)在杉木各組織中穩(wěn)定表達(dá)的UAXS基因家族成員ClUAXS2，研究結(jié)果對(duì)于認(rèn)識(shí)和理解杉木UDP-木糖/芹菜糖的合成和代謝過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。目前，對(duì)于杉木UXS和UAXS基因的家族成員、合成過(guò)程和代謝機(jī)制研究還尚未深入，其研究結(jié)果不僅有助于認(rèn)識(shí)杉木細(xì)胞壁多糖的合成過(guò)程，也有助于發(fā)掘杉木功能性糖苷類物質(zhì)的代謝過(guò)程。

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