脯氨酸緩解酸性土壤上小白菜鋁毒脅迫的效應(yīng)及其潛在機制

呂 波，王宇函，姜存?zhèn)}

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，微量元素研究中心，武漢 430070）

我國以酸性土壤為主，鋁（Al）毒是限制作物生長和減少產(chǎn)量的重要原因之一[1]。通常情況下，土壤中Al以難溶性或固定狀態(tài)存在于土壤固相中，對植物不產(chǎn)生毒害作用，當(dāng)土壤pH<5時，活性鋁含量就隨pH值降低而升高[2]，它們存在于土壤介質(zhì)中，直接對植物產(chǎn)生脅迫作用。植物在Al脅迫下，其根尖結(jié)構(gòu)遭破壞，根系伸長被抑制，根系活力降低[3]，Al脅迫阻礙植物對養(yǎng)分的吸收，降低其抵抗外界環(huán)境變化的能力，從而影響植物生長和作物產(chǎn)量[4]。脯氨酸（Pro）在植物體內(nèi)水溶性較強，可以被植物快速吸收[5]，是植物體內(nèi)最有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。有關(guān)研究表明，Pro可以提高油菜、水稻等作物產(chǎn)量[6]、抵御逆境脅迫過程[7]以及提高植物葉綠素的含量[8]；Pro還可促進植物對必需元素（如鈣、鎂等）的利用[9]，改善光合作用過程[10]，并提高代謝能力。植物在逆境條件下易產(chǎn)生活性氧，Pro可與活性氧結(jié)合，使植物免受傷害[11]。Pro還可作為重金屬、低溫、高溫等逆境脅迫條件下植物的保護劑，提高植物抗氧化酶活性，增強植物抗逆性[12]。在逆境脅迫條件下可通過施用外源Pro來提高植物抗逆能力[13]。目前關(guān)于外源Pro緩解鹽以及重金屬等脅迫的研究很多[14-15]，但是對于外源Pro緩解Al脅迫的研究卻鮮有報道。因此，本文研究了不同濃度外源Pro對Al脅迫下小白菜產(chǎn)量、生理特性的影響，為外源Pro對Al毒緩解的應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2017年3—5月在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)盆栽場進行，供試作物為小白菜“四月慢”。供試土壤為黃棕壤，取自校內(nèi)大田耕層。土壤經(jīng)自然風(fēng)干后，除去石塊及植物未腐爛殘體后研磨過2 mm篩，混勻后備用。其基本理化性質(zhì)：pH值5.2，有機質(zhì)13.3 g·kg-1，全氮 0.81 g·kg-1，堿解氮 38.9 mg·kg-1，速效磷 49.2 mg·kg-1，速效鉀 169.4 mg·kg-1，活性 Al 407.5 μg·g-1。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗以土培盆栽的方式進行，設(shè)置T1（0外源Al+0外源Pro）、T2（外源Al）、T3（外源Al+10 mmol·L-1外源Pro）、T4（外源Al+20 mmol·L-1外源Pro）、T5（外源Al+50 mmol·L-1外源 Pro）5個處理，每個處理 4次重復(fù)。外源 Al為 AlCl3·6H2O（分子量為 241.43），微量元素用Arnon營養(yǎng)液配方（pH值為6.0）。取過2 mm篩的風(fēng)干土樣1.5 kg于盆中，稱取底肥：NH4NO30.571 g·kg-1，KH2PO40.439 g·kg-1，KCl 0.141 g·kg-1，AlCl3·6H2O 0.242 g·kg-1。外源 Al和基肥按試驗處理分別施入土壤且均勻混合。種子晾曬后浸泡于純水中過夜（4℃），挑選飽滿一致的種子于塑料盆中，每盆播種約20顆，分散距離均勻，在溫室內(nèi)培養(yǎng)至發(fā)芽，發(fā)芽后間苗培養(yǎng)，用不同濃度外源Pro溶液進行灌根處理，于2月28日播種，3月14日第一次處理，每7 d進行1次，每次用量50 mL，總共3次，T3、T4和T5外源Pro總施用量分別為每盆0.17、0.34 g和0.86 g，4月14日收獲，期間每日澆水，運用重量差減法使水分維持約75%田間持水量，共培養(yǎng)45 d。

1.3 指標(biāo)測定與方法

1.3.1 樣品采集

收獲時，調(diào)查小白菜株高等農(nóng)藝性狀，稱取每盆產(chǎn)量（地上部可食部分鮮重），每盆隨機取1株樣品測定葉綠素、抗氧化酶以及丙二醛（MDA）等鮮樣指標(biāo)，所有樣品在105℃下殺青30 min，60℃烘干稱干重，把干樣磨碎后供分析測試用。樣品收獲后，將不同處理的土樣風(fēng)干磨細并分別過20目和100目的篩子，土樣用自封袋保存供分析測試用。

1.3.2 植物樣品測定

采用乙醇比色法[16]測定植物葉片葉綠素含量；采用愈創(chuàng)木酚法[16]測定過氧化物酶（POD）活性；采用NBT還原法[16]測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用紫外分光光度法[16]測定過氧化氫酶（CAT）活性；采用硫代巴比妥反應(yīng)法[16]測定MDA含量；采用濃H2SO4-H2O2消煮，蒸餾定氮法測定植株氮含量[17]，鉬銻抗比色法測定植株磷含量[17]、火焰光度法測定植株鉀含量[17]。采用硝酸和高氯酸混酸消解-石墨爐原子吸收分光光度法[18]測定植物葉片Al含量。

1.3.3 土壤基本理化性質(zhì)測定

土壤樣品用于測定收獲后土壤的基本理化性質(zhì)以及土壤的活性Al含量。土壤基本理化性質(zhì)參照鮑士旦[17]編制的《土壤農(nóng)化分析》測定：使用pH計測定土壤 pH 值（土水比 1∶2.5），10.0 g土+25.0 mL 水；堿解擴散法測定土壤堿解氮；NH4OAc浸提，火焰光度法測定土壤速效鉀；0.5 mol·L-1NaHCO3浸提，鉬銻抗比色法測定土壤有效磷；用龐叔薇等[19]提出的浸提方法測定土壤活性Al的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗公式[20]：

養(yǎng)分積累量=養(yǎng)分含量×植株干物質(zhì)積累量。

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行處理分析和作圖。用SAS進行單因素方差分析，t檢驗差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Pro對Al脅迫下小白菜產(chǎn)量的影響

從表1可知，相對于T1，單施Al使小白菜產(chǎn)量、干重和株高顯著降低，株高和產(chǎn)量分別減少了9.2%和10.6%，均達到顯著水平；Al脅迫下，不同濃度外源Pro使小白菜株高、產(chǎn)量和干重顯著增大，株高分別提高了17.8%、25.4%和14.4%，產(chǎn)量分別升高了28.4%、38.4%和65.2%。Al脅迫下，不同濃度外源Pro處理的產(chǎn)量相對于T1均增加，且有逐漸升高的趨勢，其中50 mmol·L-1外源Pro處理產(chǎn)量最高，提高了約37.1%。因此說明外源Pro具有緩解Al對小白菜生長脅迫和提高小白菜產(chǎn)量的作用。

2.2 外源Pro對Al脅迫下小白菜養(yǎng)分含量和積累量的影響

從表2得出，相對于T1，Al脅迫下小白菜的氮、磷、鉀含量明顯降低，分別減少了28.2%、40.9%和13.1%，養(yǎng)分總積累量分別降低了45.5%、55.2%和34.0%，均達到顯著水平，Al對小白菜養(yǎng)分吸收產(chǎn)生抑制作用。Al脅迫下施加不同濃度外源Pro，小白菜的氮、磷、鉀含量均明顯上升，且隨著Pro濃度的升高，養(yǎng)分含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，濃度為50 mmol·L-1時養(yǎng)分含量最高，相對于T2氮、磷、鉀含量分別增加了60.7%、50.0%和23.2%；此外，小白菜養(yǎng)分總積累量明顯增加，緩解Al對小白菜的抑制作用，其中50 mmol·L-1緩解效果最好，相對于 T2氮、磷、鉀總積累量分別增加了169.4%、151.6%和106.6%。因此，外源Pro可緩解Al對小白菜養(yǎng)分吸收的抑制，促進小白菜對養(yǎng)分的積累。

表1 外源Pro對Al脅迫下小白菜產(chǎn)量的影響Table 1 Exogenousproline effect on thegrowth of pakchoi under aluminumstress

2.3 外源Pro對Al脅迫下小白菜葉片Al含量的影響

從圖1得出，Al脅迫下小白菜葉片Al含量相對于T1顯著提高了24.3%，施加外源Pro后，小白菜葉片Al含量顯著降低，分別降低了20.4%、45.6%和49.8%，說明外源Pro可減少小白菜對Al的吸收，緩解Al脅迫作用。隨著外源Pro濃度升高，小白菜葉片Al含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，且均低于T1水平，其中50 mmol·L-1外源Pro緩解效果較好。

表2 外源Pro對Al脅迫下小白菜養(yǎng)分含量和積累量的影響Table 2 Exogenousproline effect on the nutrient content and accumulation of pakchoiunder aluminumstress

圖1 外源Pro對Al脅迫下小白菜葉片Al含量的影響Figure1 Exogenous proline effect on the content of aluminumin pakchoileaves under aluminumstress

2.4 外源Pro對Al脅迫下小白菜葉綠素的影響

如表3所示，Al會減少葉綠素含量，破壞小白菜葉片的葉綠素。相對于T1，T2處理的小白菜葉片葉綠素受到破壞，葉綠素a含量減少17.3%，葉綠素b減少27.2%，類胡蘿卜素含量減少29.0%，且均達到顯著水平；Al脅迫下施加不同濃度外源 Pro 后，T3、T4、T5處理葉綠素含量均相應(yīng)地增加，隨著外源Pro濃度升高，葉綠素含量呈現(xiàn)遞增趨勢，其中50 mmol·L-1外源Pro的緩解效果較好，葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量分別提高了29.1%、38.9%和36.4%。外源Pro對Al脅迫下小白菜葉片葉綠素含量產(chǎn)生了一定的影響，但并未顯著提高，只是緩解并逐漸恢復(fù)到T1水平。

表3 外源Pro對Al脅迫下小白菜葉片葉綠素的影響Table3 Exogenousprolineeffect on chlorophyll in leavesof pakchoiunder aluminumstress

2.5 外源Pro對Al脅迫下小白菜抗氧化酶活性和MDA含量的影響

從表 4 得知，相對于 T1，添加外源 Al，POD、SOD和 CAT活性分別降低了 13.7%、21.1%和 30.4%，MDA含量顯著升高了58.8%；Al脅迫下，不同濃度外源Pro使抗氧化酶活性顯著提高，MDA含量顯著降低，其中50 mmol·L-1效果最好，POD活性提高了24.3%，SOD活性升高了266.9%，CAT活性提高了142.6%，MDA含量降低了40.8%。隨著外源Pro濃度升高，POD、SOD和CAT活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，最終均比T1水平高，說明外源Pro可減弱Al對抗氧化酶活性的影響。因此，外源Pro可增強抗氧化酶活性來緩解Al脅迫。

2.6 外源Pro對Al脅迫下土壤pH值和活性Al含量的影響

圖2 外源Pro對Al脅迫下土壤pH值和活性Al含量的影響Figure 2 Exogenousproline effect on soil pH and available Al content under aluminumstress

表4 外源Pro對Al脅迫下小白菜抗氧化酶活性和MDA含量的影響Table 4 Exogenous proline effect on antioxidant enzyme activity and MDA content in pakchoiunder aluminumstress

從圖2可得出，相對于T1，外源Al使土壤pH值由5.65減少為4.90，降低了0.75個單位，達到顯著水平，施加不同濃度外源Pro后，土壤pH值并未明顯改善，未達到顯著水平，說明外源Pro對Al脅迫下土壤pH值的影響不大。T1土壤活性Al含量為456.02μg·g-1，T2土壤活性 Al含量為 525.86 μg·g-1，本試驗外源Al施加量為 27 μg·g-1，增加量為 69.84 μg·g-1，增加量大于施加量；施加外源Pro后，土壤活性Al含量分別降低了4.3%、24.5%和19.7%。外源Al使土壤pH值降低，活性Al含量升高，說明土壤pH值降低對活性Al含量升高有一定的影響；添加外源Pro后，土壤pH值未明顯變化，但土壤活性Al含量顯著降低，說明外源Pro對Al脅迫下土壤活性Al含量的影響并不是通過調(diào)節(jié)土壤pH值實現(xiàn)的。

3 討論

3.1 外源Pro對Al脅迫下小白菜生長及生理特性的影響

植物在生長過程中需要適宜的土壤環(huán)境，但實際上土壤環(huán)境中存在著很多限制作物生長的因素，如土壤pH值降低、活性Al含量過多導(dǎo)致的Al毒[4]等。Al毒對植物生長發(fā)育的影響主要表現(xiàn)為根系吸收養(yǎng)分受到阻礙、生長受到抑制、產(chǎn)量降低等[21]。本試驗發(fā)現(xiàn)，在黃棕壤中施加外源Al后，土壤pH值下降了0.75個單位，小白菜的氮、磷、鉀含量分別減少了28.2%、40.9%和13.1%，養(yǎng)分總積累量分別降低了45.5%、55.2%和34.0%，小白菜株高降低了9.2%，產(chǎn)量減少了10.6%，說明土壤pH值降低是Al脅迫下小白菜產(chǎn)量下降和生長發(fā)育受限制的重要原因之一。

有研究[22]表明，逆境脅迫下，植物易產(chǎn)生活性氧，直接對植物的生理特性產(chǎn)生影響。植物體內(nèi)與活性氧消除有關(guān)的酶活性在逆境脅迫下一般會增強，從而植物抗氧化能力得到提高。Okuma等[23]發(fā)現(xiàn)10 mmol·L-1Pro促進懸浮培養(yǎng)煙草細胞的生長；Hoque等[24]發(fā)現(xiàn)Pro可提高植物葉片抗氧化酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，外源Al使POD、SOD和CAT的活性顯著降低，分別降低了13.7%、21.1%和30.4%，使膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著升高，升高了58.8%，對小白菜的抗氧化酶系統(tǒng)造成損害，施加不同濃度外源Pro后，促進小白菜SOD、POD和CAT活性，減少MDA在體內(nèi)的積累，從而減輕膜脂過氧化程度和增強抗氧化能力。外源Pro緩解Al脅迫的原因可能在于作為活性氧消除劑，激發(fā)體內(nèi)POD、SOD以及CAT的活性，降低活性氧對植物的危害，增強小白菜抵抗逆境的能力，Anjum等[25]研究也證實了這一點。除此之外，Ashraf等[26]研究認為外源Pro緩解逆境脅迫效果取決于作物的類型以及Pro的濃度等，適宜Pro濃度可能在5~60 mmol·L-1之間[27-28]。本試驗設(shè)置3個濃度，綜合數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在提高產(chǎn)量、抗氧化酶活性、葉綠素含量和養(yǎng)分總積累量以及降低MDA含量、植物葉片Al含量和土壤活性Al含量等方面，濃度為50 mmol·L-1時緩解效果較好，此濃度在研究范圍之內(nèi)。

3.2 外源Pro及外源Al對小白菜和土壤Al含量的影響

本試驗中，外源Al的施入使得土壤活性Al含量增加，土壤活性Al含量從456.02μg·g-1增加到了525.86 μg·g-1，增加量為 69.84 μg·g-1，大于施加量 27 μg·g-1，說明外源Al可使土壤固定態(tài)Al轉(zhuǎn)化成活性Al，這與應(yīng)介官等[29]研究生物炭及外源Al對土壤Al含量試驗結(jié)果相似。除此之外，施加不同濃度外源Pro后，小白菜和土壤中的Al含量加上外源Al的施入量，T2~T54個處理Al總量呈現(xiàn)下降的趨勢。有研究[30-31]表明，土壤活性Al含量與土壤pH值有密切關(guān)系，當(dāng)土壤pH<5時，土壤活性Al含量隨pH值降低而升高，但在本實驗中，外源Pro并沒有顯著提高土壤pH值，因此降低土壤和植物中Al含量并不是通過提高土壤pH值來實現(xiàn)的，對此Bolan等[32]研究發(fā)現(xiàn)有機酸可以與活性Al形成對植物無害的穩(wěn)定物質(zhì)，宋敏等[21]的研究也證實外源Pro可與自由金屬離子形成無毒的金屬-Pro復(fù)合物，減輕金屬對植物抗氧化酶活性以及光合中心離子的毒害作用。因此本試驗主要原因可能在于外源Pro與土壤活性Al相結(jié)合使土壤活性Al轉(zhuǎn)化成Al-Pro穩(wěn)定復(fù)合物，外源Pro被植物吸入體內(nèi)直接轉(zhuǎn)化成內(nèi)源Pro與體內(nèi)Al形成某種穩(wěn)定物質(zhì)[21]，且這兩種物質(zhì)對植物沒有危害，從而同時降低了土壤和小白菜中Al含量，這也解釋了總體下降趨勢的問題。

3.3 外源Pro的應(yīng)用前景

Pro是一種可溶性的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，中性條件下不帶電，具有分子量低、水溶性高等特點[33-34]。Pro性質(zhì)穩(wěn)定，可在常溫和常壓條件下穩(wěn)定存在。Pro對植物具有兩方面積極作用，充當(dāng)逆境調(diào)節(jié)物質(zhì)和能量[35-36]：植物在逆境脅迫條件下，Pro可以與脅迫條件產(chǎn)生的氧自由基發(fā)生反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害物質(zhì)，消除活性氧危害；當(dāng)植物從脅迫條件恢復(fù)正常時，Pro降解產(chǎn)生能量，可作為氮、磷的快速補償能源。目前關(guān)于Pro的研究很多，主要傾向于其在植物體內(nèi)的抗逆機制[37]，多應(yīng)用于緩解干旱、高溫、鹽脅迫和重金屬等[38]逆境脅迫，但是目前有關(guān)Pro功能和植物抗逆性的研究都是在培養(yǎng)室中進行的，在野外條件下還沒得到成功的驗證[13]。Pro由于其高水溶性可作為水溶肥施用，成本較低，為新型肥料研究提供新的思路。

4 結(jié)論

（1）外源Al使土壤pH值降低，土壤活性Al含量增加，植物體內(nèi)Al含量升高，抗氧化酶活性減弱，膜脂過氧化程度增強，葉綠素破壞，養(yǎng)分總積累量減少，Al對小白菜生長產(chǎn)生脅迫作用。

（2）Al脅迫下施用不同濃度外源Pro未明顯提高土壤pH值，可使土壤活性Al含量下降，植物體內(nèi)Al含量下降，抗氧化酶活性提高，膜脂過氧化程度減弱，葉綠素恢復(fù)到正常水平，養(yǎng)分總積累量增加。外源Pro有效地緩解了Al對小白菜生長的抑制，且50 mmol·L-1外源Pro對Al脅迫緩解效果較好。

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