β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌敏感性分析*

李 輝， 張 振

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院新生兒科 430016；2.上海德濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200331)

β-內(nèi)酰胺類抗生素(β-lactam)是兒科常用治療細(xì)菌感染的一類抗生素，包括對(duì)不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)細(xì)菌有效的單一β-lactam抗生素和對(duì)產(chǎn)β-lactamase細(xì)菌有效的β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(β-lactam/β-lactamase inhibitors)。兒童腸道正常菌雙歧桿菌和乳酸桿菌為一類不產(chǎn)β-lactamase細(xì)菌，理論上β-lactam/β-lactamase inhibitors對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌的作用與單一β-lactam抗生素相同，然而有研究報(bào)道β-lactam/β-lactamase inhibitors比單一β-lactam抗生素導(dǎo)致患兒抗生素相關(guān)性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea,AAD)發(fā)病率高很多，而且是導(dǎo)致患兒AAD高發(fā)病率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-2]。本研究將兒童腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌對(duì)β-lactam/β-lactamase inhibitors藥敏情況進(jìn)行了分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基 改良的雙歧桿菌培養(yǎng)基BS(在MRS培養(yǎng)基中添加L-半脫氨酸、放線菌酮、硫酸新霉素、硫酸巴龍霉素、氯化鋰、X-Gal等)[3]，乳酸桿菌培養(yǎng)基為莫匹羅星鋰鹽改良的MRS，改良的BS和MRS液體培養(yǎng)基用于雙歧桿菌和乳酸桿菌的分離及純化，MRS固體培養(yǎng)基用于藥敏試驗(yàn)。

1.1.2質(zhì)控菌株 雙歧桿菌和乳酸桿菌培養(yǎng)及鑒定質(zhì)控菌株為鼠李糖乳桿菌ATCC 7469、嬰兒雙歧桿菌ATCC15697，藥敏質(zhì)控菌株為脆弱擬桿菌ATCC25285、多形擬桿菌ATCC29741，全部質(zhì)控菌株均購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司。

1.1.3試劑 生化鑒定管(淀粉、蔗糖、果糖、棉籽糖、阿拉伯糖、蜜二糖、纖維二糖、甘露醇、山梨醇、麥芽糖、甘露糖、木糖、乳糖、半乳糖、硫化氫、硝酸鹽還原等)購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司，API-50CH 和API-50CHL厭氧菌鑒定卡購(gòu)自法國(guó)BioMerieux公司，PCR試劑(蛋白酶K、PCR buffer、dNTP、TaKaRa Ex Taq酶、雙歧桿菌和乳酸桿菌擴(kuò)增引物等)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，E-test 藥敏試劑條(氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦)購(gòu)自法國(guó)BioMerieux公司。

1.1.4設(shè)備 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)有限公司)； MARKⅡ型厭氧微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)(荷蘭ANOXOMAT公司)；電熱恒溫干燥箱(上海一恒科技有限公司)；高壓滅菌鍋(北京醫(yī)療儀器有限公司)；GeneAmp PCR System 9700型PCR儀(美國(guó)ABI公司)；無(wú)菌操作臺(tái)、冰箱、離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)室所需的常用設(shè)備。

1.2方法

1.2.1樣品采集與處理 用滅菌棉簽取36例母乳喂養(yǎng)健康嬰幼兒(年齡1個(gè)月至1歲)糞便約1 g，快速放入滅菌裝有液態(tài)石蠟油和9 mL緩沖蛋白胨水溶液的試管中，充分振蕩搖勻，做成1∶10的均勻稀釋液，用緩沖蛋白胨水溶液作稀釋液，可以有效保護(hù)雙歧桿菌和乳酸桿菌的存活，避免受外界環(huán)境因素的影響。另取1 mL滅菌移液管吸取上述稀釋液注入滅菌的含有9 mL緩沖蛋白胨水溶液試管中，充分振蕩搖勻，做成1∶100的均勻稀釋液。按上述操作順序，依次做成1×10-7～1×10-3梯度的均勻稀釋液。

1.2.2分離培養(yǎng) 將1×10-5、1×10-6和1×10-73種梯度的糞便稀釋液各取1 mL分別注入無(wú)菌平皿中，每個(gè)梯度的稀釋液裝2塊平皿，并做空白對(duì)照。在加入樣品稀釋液的平皿中，分別注入冷卻至50 ℃左右的選擇性改良BS和MRS培養(yǎng)基適量，然后放入(37±1)℃的MARKⅡ型厭氧培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48～72 h。

1.2.3初步鑒定 分離培養(yǎng)的細(xì)菌先采用常規(guī)鑒定方法：革蘭染色鏡檢、H2O2試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、生化試驗(yàn)等，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第9版)初步鑒定細(xì)菌，然后使用法國(guó)BioMerieux公司生產(chǎn)的 API-50CH 檢測(cè)雙歧桿菌、API-50CHL 檢測(cè)乳酸桿菌。

1.2.416SrDNA序列測(cè)定 參考文獻(xiàn)[4]方法，采用液氮反復(fù)凍融的方法提取初步分離到的雙歧桿菌和乳酸桿菌DNA，將 DNA 原液稀釋到100 ng/μL，雙歧桿菌PCR引物為：上游5′-GAT FCT GGC TCA GGA TGA ACG C-3′，下游5′-CTG ATA GGA CGC GAC CCC AT-3′；乳酸桿菌PCR引物為：上游5′-CTG ATG AAA GCC CTC G-3′，下游：5′-GAG CCT CAG CGT CAG TG-3′。PCR反應(yīng)體系包括10×buffer 5.0 μL，4×dNTP 1.0 μL，上下游引物(25 mol/L)各0.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.4 μL，DNA模板5 μL，蒸餾水32.6 μL，共50.0 μL。使用GeneAmp PCR System9600型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min后，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后以72 ℃ 10 min延伸至結(jié)束。然后將擴(kuò)增成功的產(chǎn)物寄往上海美吉生物醫(yī)藥有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果上傳到NCBI使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)完成比對(duì)鑒定。

1.2.5藥敏試驗(yàn) 按照CLSI制定的方法及標(biāo)準(zhǔn)，使用法國(guó)BioMerieux公司E-test試紙條檢測(cè)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮、頭孢哌酮/舒巴坦的MIC值，試紙條的濃度為0.016～256.000 μg/mL。按照瓊脂擴(kuò)散法將菌液均勻涂布與整個(gè)MRS平皿表面，放置15～20 min，等水吸干后，用鑷子將E-test試紙條放置于平皿中央，放37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，孵育后圍繞著試條可形成一個(gè)卵圓形的抑菌圈，抑菌圈與試條的橫向相交處的讀數(shù)刻度，即是此抗生素的MIC。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1雙歧桿菌和乳酸桿菌分離培養(yǎng)結(jié)果 從36例母乳喂養(yǎng)健康嬰幼兒糞便中共分離出45株雙歧桿菌和39株乳酸桿菌。

表1 45株雙歧桿菌藥敏結(jié)果分析

-：此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)

2.2雙歧桿菌藥敏結(jié)果 45株雙歧桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮的敏感百分率分別為77.78%、95.56%、88.89%、73.33%、91.11%、68.89%、84.44%、82.22%，除頭孢哌酮/舒巴坦沒(méi)有CLSI藥敏MIC解釋標(biāo)準(zhǔn)而無(wú)法判斷外，其他β-lactam/β-lactamase inhibitor均較單一β-lactam抗生素敏感百分率升高，氨芐西林與阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林與哌拉西林/他唑巴坦的敏感數(shù)P值分別為0.01、0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3乳酸桿菌藥敏結(jié)果 39株乳酸桿菌對(duì)上述抗生素的敏感百分率分別為74.36%、94.87%、92.31%、71.79%、92.31%、69.23%、89.74%、79.49%，除頭孢哌酮/舒巴坦沒(méi)有CLSI藥敏MIC解釋標(biāo)準(zhǔn)而無(wú)法判斷外，其他β-lactam/β-lactamase inhibitor均比單一β-lactam抗生素敏感百分率升高，氨芐西林與阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林與氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林與哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林與替卡西林/克拉維酸的敏感數(shù)P值分別為0.01、0.03、0.02、0.03，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 39株乳酸桿菌藥敏結(jié)果分析

-：此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)

3 討 論

產(chǎn)β-lactamase細(xì)菌能夠水解β-lactam類抗生素，從而導(dǎo)致治療失敗，β-lactam/β-lactamase inhibitors是目前兒科治療產(chǎn)β-lactamase細(xì)菌感染的主要抗生素之一，主要有阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦，對(duì)于兒童患者而言上述5種復(fù)合抗生素與喹諾酮類、氨基糖苷類抗生素相比不良反應(yīng)較小，而且治療產(chǎn)β-lactamase細(xì)菌感染有較好的效果[5]。然而使用β-lactam/β-lactamase inhibitors也會(huì)導(dǎo)致患兒有較高的AAD發(fā)生率，有研究顯示細(xì)菌性重癥肺炎患兒使用阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦AAD發(fā)病率均高于其對(duì)應(yīng)的單一β-lactam類抗生素阿莫西林、哌拉西林、頭孢哌酮[2]。為了探究使用β-lactam/β-lactamase inhibitors導(dǎo)致患兒高AAD發(fā)病率的原因，研究β-lactam/β-lactamase inhibitors對(duì)兒童腸道正常菌群(雙歧桿菌和乳酸桿菌為主)的影響很有必要。有文獻(xiàn)報(bào)道阿莫西林/克拉維酸是導(dǎo)致細(xì)菌性重癥肺炎患兒高AAD發(fā)病率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。在本研究中，雙歧桿菌和乳酸桿菌對(duì)氨芐西林的敏感率分別為77.78%、74.36%，阿莫西林/克拉維酸分別為95.56%、94.87%，由于CLSI對(duì)厭氧菌阿莫西林的MIC藥敏解釋標(biāo)準(zhǔn)還未建立，但阿莫西林折點(diǎn)被認(rèn)為與氨芐西林相同，有限的體外數(shù)據(jù)表明這兩種藥物對(duì)厭氧菌的MIC 值接近，因此筆者用氨芐西林替代阿莫西林與阿莫西林/克拉維酸比較敏感數(shù)的差異，結(jié)果顯示雙歧桿菌和乳酸桿菌氨芐西林與阿莫西林/克拉維酸的敏感數(shù)P值都為0.01，說(shuō)明阿莫西林/克拉維酸對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用比阿莫西林(氨芐西林)更強(qiáng)。

YILMAZ等[6]研究顯示氨芐西林/舒巴坦是導(dǎo)致血性AAD的重要藥物誘因，在本研究中，雙歧桿菌和乳酸桿菌氨芐西林/舒巴坦的敏感數(shù)百分率分別為88.89%、92.31%，雙歧桿菌和乳酸桿菌氨芐西林與氨芐西林/舒巴坦的敏感數(shù)P值分別為0.16、0.03，說(shuō)明氨芐西林/舒巴坦對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用比氨芐西林強(qiáng)。

在本研究中，雙歧桿菌和乳酸桿菌哌拉西林的敏感數(shù)百分率分別為73.33%、71.79%，哌拉西林/他唑巴坦分別為91.11%、92.31%，雙歧桿菌和乳酸桿菌哌拉西林與哌拉西林/他唑巴坦的敏感數(shù)P值分別為0.03、0.02，說(shuō)明哌拉西林/他唑巴坦對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用比哌拉西林更強(qiáng)。使用替卡西林/克拉維酸導(dǎo)致患者發(fā)生AAD也有報(bào)道[7]，本研究顯示雙歧桿菌和乳酸桿菌替卡西林的敏感數(shù)百分率分別為68.89%、69.23%，替卡西林/克拉維酸分別為84.44%、89.74%，雙歧桿菌和乳酸桿菌替卡西林與替卡西林/克拉維酸的敏感數(shù)P值分別為0.08、0.03，說(shuō)明替卡西林/克拉維酸對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用比替卡西林強(qiáng)。

頭孢哌酮對(duì)β-lactamase的穩(wěn)定性較差，舒巴坦為廣譜酶抑制劑同時(shí)具有較弱的抗菌活性，二者聯(lián)合對(duì)革蘭陰性桿菌有協(xié)同抗菌活性，聯(lián)合后的復(fù)合物抗菌活性比單獨(dú)頭孢哌酮高很多[8]。本研究顯示雙歧桿菌和乳酸桿菌頭孢哌酮的敏感數(shù)百分率分別為82.22%、79.49%，由于目前用于藥敏標(biāo)準(zhǔn)指南的CLSI和歐洲抗生素管理委員會(huì)(EUCAST)均沒(méi)有頭孢哌酮/舒巴坦的藥敏分組與折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法判斷雙歧桿菌和乳酸桿菌頭孢哌酮/舒巴坦的MIC值，因而無(wú)法比較頭孢哌酮與頭孢哌酮/舒巴坦對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌生長(zhǎng)的影響大小。

雖然雙歧桿菌和乳酸桿菌不產(chǎn)β-lactamase，但本研究顯示β-lactam/β-lactamase inhibitor比單一β-lactam抗生素抑制雙歧桿菌和乳酸桿菌作用更強(qiáng)，可能的原因有：(1)對(duì)β-lactamase陰性感染菌使用β-lactam/β-lactamase inhibitors比β-lactamase陽(yáng)性感染菌更易導(dǎo)致患兒發(fā)生AAD，其原因是對(duì)β-lactamase陽(yáng)性感染菌使用β-lactam/β-lactamase inhibitors，大部分β-lactamase inhibitors會(huì)與感染菌的β-lactamase發(fā)生不可逆的結(jié)合，β-lactamase inhibitors在與β-lactamase作用的過(guò)程中本身會(huì)遭到破壞[9]，因此沒(méi)有或者只有較少剩余的β-lactamase inhibitors作用于人體正常菌群。而對(duì)β-lactamase陰性感染菌(例如雙歧桿菌和乳酸桿菌)使用β-lactam/β-lactamase inhibitors，β-lactamase inhibitors會(huì)作用于人體腸道產(chǎn)β-lactamase正常菌群(例如脆弱類桿菌等)，導(dǎo)致人體腸道黏膜生物屏障可能被破壞[10]；(2)不合理的使用β-lactamase inhibitors，可能會(huì)增加兒童腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌細(xì)胞膜的通透性，某些藥物或毒素就會(huì)進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致這類細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制[11]。

筆者的藥敏研究顯示β-lactam/β-lactamase inhibitor比單一β-lactam抗生素抑制兒童腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌效果更強(qiáng)，然而抗生素在人體內(nèi)會(huì)受到其他多種因素的影響，其吸收、運(yùn)載和代謝的過(guò)程非常復(fù)雜，今后需要進(jìn)一步研究β-lactam/β-lactamase inhibitors導(dǎo)致患者發(fā)生AAD的詳細(xì)機(jī)制，以便能合理規(guī)范使用β-lactam/β-lactamase inhibitor，盡量考慮治療產(chǎn)β-lactamase細(xì)菌感染療效的同時(shí)兼顧降低患兒AAD發(fā)病率。

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