阿魏酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)肝星狀細(xì)胞凋亡的影響研究*

許希燕，王巧稚，羅 茂，余 鴻，劉廣益△

(西南醫(yī)科大學(xué)：1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.藥物研究中心，四川瀘州 646000)

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix,ECM)過(guò)度沉淀的一個(gè)病理過(guò)程，是肝臟對(duì)各種慢性損傷產(chǎn)生的一種修復(fù)反應(yīng)，是多種肝病的必經(jīng)階段。肝纖維化的核心機(jī)制是肝星狀細(xì)胞(hepatic satellite cells,HSCs)的活化[1-2]，所以治療肝纖維化的關(guān)鍵是抑制HSCs增殖或促進(jìn)其凋亡,從而抑制其分泌ECM或促進(jìn)ECM降解。而在HSCs活化眾多路徑中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)是促肝臟纖維發(fā)生的最強(qiáng)有力細(xì)胞因子。TGF-β1主要通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)通路在體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，Smad蛋白介導(dǎo)了TGF-β1的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植是治療肝纖維化的新方法，除了通過(guò)分化為肝細(xì)胞對(duì)肝臟進(jìn)行直接修復(fù)外，還可經(jīng)旁分泌途徑誘導(dǎo)HSC凋亡。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)為間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，具有和BMSCs相似的分化傾向和功能[4-6]。阿魏酸(Ferulic acid,FA)屬酚酸類化合物，是中藥川芍、當(dāng)歸等的主要成分之一，具有抗血小板聚集、抑制炎性反應(yīng)、抗氧化等作用。有研究證實(shí)，F(xiàn)A可有效降低肝硬化患者門靜脈壓力，改善肝纖維化指標(biāo)[7-9]。本研究探討大鼠ADMSCs和FA通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路對(duì)HSCs凋亡的影響，以期為肝纖維化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠肝星狀細(xì)胞系(HSC-T6，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；SD大鼠ADMSCs[賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司]；阿魏酸鈉(標(biāo)準(zhǔn)品，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；DMEM/F-12培養(yǎng)基(上海Gibco公司)；胎牛血清(杭州天杭生物科技股份有限公司)；MTT粉劑(北京Solarbio公司)；DMSO(美國(guó)Sigma公司)；6孔Transwell培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)；Annexin-V/PI凋亡染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京TOYOBO公司)；熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)；兔抗大鼠TGF-β1、Smad2/3、Smad7、p-Smad2/3抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；ELISA試劑盒(北京誠(chéng)林生物公司)； PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HSCs、 ADMSCs復(fù)蘇后，接種于10%FBS含雙抗的DMEM/F-12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ADMSCs和HSCs，以1∶5的比例分別接種于0.4 μm Tanswell半透膜、6孔板中，用10%FBS DMEM/F-12培養(yǎng)，待兩種細(xì)胞密度達(dá)到約70%后均換為無(wú)血清培養(yǎng)基。將HSCs分為4組：空白組，HSCs單獨(dú)培養(yǎng)，不加FA和ADMSCs；FA組，加FA處理HSCs；ADMSCs組加入ADMSCs，用Tanswell建立上下雙層細(xì)胞共培養(yǎng)體系；FA+ADMSCs組，在ADMSCs與HSCs共培養(yǎng)體系中加入FA共同作用(實(shí)驗(yàn)前期用MTT法檢測(cè)得FA的最適藥物處理濃度為200 μg/mL)；以上4組均用無(wú)血清DMEM/F-12培養(yǎng)24 h。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSCs的凋亡率 收集細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加入500 μL Binding Buffer重懸，用5 μL FITC Annexin V和 5 μL PI進(jìn)行染色，室溫、避光反應(yīng)15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡率，重復(fù)3次。凋亡率=早期凋亡+晚期凋亡。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表達(dá) 收集細(xì)胞，用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，核酸蛋白儀測(cè)定總RNA的濃度及純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。以反應(yīng)所得cDNA在Myi Q實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。每個(gè)標(biāo)本設(shè)3復(fù)孔，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.5Western blot 檢測(cè)HSCs的TGF-β1、Smad7蛋白及p-Smad2/3表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后用 PBS 清洗 3 遍，收集細(xì)胞提取蛋白。加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，取總蛋白5 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)PVDF 膜轉(zhuǎn)移，加入一抗4 ℃中孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3次后再加入二抗孵育1 h。顯影拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)帶進(jìn)行分析。內(nèi)參采用β-actin進(jìn)行目的蛋白TGF-β1、p-Smad2/3和Smad7的表達(dá)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組HSCs凋亡率 與空白組(7.46±1.26)%比較，ADMSCs組中HSCs凋亡率(9.84±1.64)%變化不明顯(P>0.05)，F(xiàn)A組、FA+ADMSCs中HSCs的凋亡率[(16.81±1.57)、(22.22±2.31)%]均明顯升高(P<0.05)。與FA組、ADMSCs組比較，F(xiàn)A+ADMSCs組中HSCs的凋亡率均明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2各組HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表達(dá) 與其他3組比較， FA+ADMSCs組HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，Smad7 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3各組HSCs的TGF-β1、Smad7蛋白及p-Smad2/3表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，與其他3組比較，F(xiàn)A+ADMSCs組HSCs的TGF-β1蛋白表達(dá)、p-Smad2/3表達(dá)明顯下降，Smad7蛋白表達(dá)呈明顯升高趨勢(shì)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

A:空白組；B:FA組；C:ADMSCs組；D:FA+ADMSCs組

圖1各組HSCs流式細(xì)胞儀凋亡散點(diǎn)圖

圖2 各組HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表達(dá)

圖3 各組HSCs的TGF-β1、Smad7蛋白及p-Smad2/3表達(dá)

3 討 論

HSCs的激活與凋亡在肝纖維化的發(fā)生與逆轉(zhuǎn)中起關(guān)鍵作用[1-3]。TGF-β1主要來(lái)源于HSCs，在抑制肝細(xì)胞再生的同時(shí)激活更多的HSCs，參與和促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，其主要通過(guò)TGF-β/smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)肝纖維化進(jìn)行調(diào)控[10]。TGF-β1與胞膜表面特異受體結(jié)合后，可激活下游的Smads 蛋白信號(hào)通路，其中被激活的p-Smad2/3與胞漿的Smad4 結(jié)合形成復(fù)合體，轉(zhuǎn)入胞核調(diào)節(jié)HSCs的基因表達(dá)[11-13]。

FA在腎臟和心臟疾病中具有抗纖維化作用，通過(guò)減少活性氧(ROS)和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化而具有有效的抗氧化活性，能減輕四氯化碳造成的肝纖維化損傷[14]，但是對(duì)HSC是否具有促其凋亡的作用，且通過(guò)什么路徑調(diào)控仍有待探討。本研究顯示，在無(wú)血清條件下，F(xiàn)A能促進(jìn)HSCs的凋亡及在一定程度上降低TGF-β1的表達(dá)水平，且明顯抑制HSCs內(nèi)Smad3 mRNA、p-Smad2/3的表達(dá)，Smad7表達(dá)水平明顯升高。提示FA促HSCs凋亡、抗肝纖維化的機(jī)制在于下調(diào)TGF-β1及下游p-Smad2/3表達(dá)的同時(shí)，Smad7的表達(dá)可能以負(fù)反饋的方式上調(diào)，從而拮抗由Smad3介導(dǎo)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。

間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增殖、炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程,這些活性因子可能通過(guò)旁分泌效應(yīng)抑制HSCs的增殖或誘導(dǎo)其凋亡[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，人來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)TGF-β1/Smad2抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，減輕纖維沉積，從而緩解肝纖維化[15]。也有學(xué)者報(bào)道， BMSCs與HSCs共培養(yǎng)，能明顯降低HSCs的TGF-β1基因及蛋白表達(dá)，上調(diào)Smad7基因及蛋白水平[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，ADMSCs與HSCs以1∶5的比例共培養(yǎng)24 h，HSCs的凋亡率、TGF-β1及各種Smad表達(dá)無(wú)明顯改變，可能原因在于ADMSCs的細(xì)胞數(shù)量較少或培養(yǎng)時(shí)間較短，不足以抑制TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。但當(dāng)在共培養(yǎng)組中同時(shí)加入FA聯(lián)合作用時(shí)，HSCs的p-Smad2/3、Smad3 mRNA表達(dá)均下調(diào)，Smad7表達(dá)上調(diào)。

有研究證明，F(xiàn)A可通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)的表達(dá)來(lái)抑制HSCs的活化[17]，ERK1/2激活可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[18-19]。這可以解釋將FA加入ADMSCs與HSCs的共培養(yǎng)體系后，HSCs各指標(biāo)變化明顯。FA或能通過(guò)激活ERK1/2而促進(jìn)ADMSCs增殖，甚至促進(jìn)AMDSCs的旁分泌作用，進(jìn)一步增強(qiáng)HSCs內(nèi)Smad7 mRNA的負(fù)反饋性表達(dá)增加并抑制下游p-Smad2/3的表達(dá)，從而增強(qiáng)了AMDSCs對(duì)HSCs的促凋亡作用。這與本研究項(xiàng)目中的前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，脂肪干細(xì)胞聯(lián)合FA移植治療肝纖維化較單一治療效果更好的結(jié)果相一致[20]。至于FA是通過(guò)影響AMDSCs的何種旁分泌途徑來(lái)抑制TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)對(duì)HSCs凋亡的，還需在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，F(xiàn)A聯(lián)合AMDSCs對(duì)HSCs凋亡有協(xié)同促進(jìn)作用，提示二者聯(lián)合使用可能為臨床上控制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供新的治療方向。

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