綠豆發(fā)芽富集GABA及產(chǎn)品開發(fā)研究進(jìn)展

馬玉玲 羅可大 佟立濤 王麗麗 周閑容 劉興訓(xùn) 周素梅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所1，北京 100193) (瀏陽河集團(tuán)股份有限公司2，長沙 410000)

綠豆是豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionoideae)菜豆族(Phaseoleae)豇豆屬(Vigna)中的一個(gè)栽培豆種，學(xué)名Vignaradiata(L.) Wilclzek，英文名Mung bean，Green bean，又叫植豆、菉豆、青小豆等。綠豆在中國已有2 000多年的栽培歷史，是我國主要食用豆類作物，主產(chǎn)區(qū)集中在華北及黃河、淮河流域的平原地區(qū)，以吉林、內(nèi)蒙古、河南等省最多，新疆、重慶、四川等地次之，常年種植面積約80萬公頃，總產(chǎn)量近100萬t[1-2]。據(jù)《本草綱目》等記載，綠豆甘、寒、無毒，具有清熱去暑、解毒、瀉火、明目等保健功效，是傳統(tǒng)的藥食同源作物之一。近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，綠豆不僅具有高蛋白、中淀粉、低脂肪、富含多種維生素和礦物質(zhì)等特性，還含有多酚、黃酮、GABA、D-手性肌醇(DCI)、牡荊素、異牡荊素、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)等功能性成分，具有解毒、改善腸道菌叢、降血脂、抗氧化、抗菌、抗腫瘤、提高免疫力等多種生理功能特性[3]。

GABA又稱氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)[4]，具有降血壓、促進(jìn)睡眠、增強(qiáng)記憶、抗焦慮、預(yù)防和治療癲癇、解毒等多種生理功能[5]。Takeshima等[6]通過動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)GABA作為一種潛在的功能性食品原料是安全的。我國衛(wèi)生部2009年第12號公告，根據(jù)《食品安全法》和《新資源食品管理辦法》的規(guī)定，批準(zhǔn)GABA為新資源食品[7]。盡管GABA對人體健康具有重要的作用，但隨著年齡的增長和壓力的增大，人體內(nèi)的GABA生成量日益降低。因此，從食物中補(bǔ)充GABA對人體健康具有重要意義。然而，高等植物組織中天然存在的GABA的水平較低(0.03～6 μmol/g)，再加上加工損失[8-9]等，其GABA含量不能滿足人體生理需要。

隨著科研工作者對GABA富集研究的深入，發(fā)現(xiàn)糙米[10]、大麥[11]、苦蕎[12]等經(jīng)發(fā)芽處理，能有效地富集功效成分GABA，富GABA食品開發(fā)一時(shí)成為功能食品研究的熱點(diǎn)，但目前市場上富含GABA產(chǎn)品主要來源于發(fā)芽糙米，不足以滿足廣大消費(fèi)者廣泛的需求。因此，有必要研究開發(fā)其他富含GABA的產(chǎn)品。研究顯示，綠豆含有豐富的蛋白質(zhì)，且產(chǎn)生GABA的底物谷氨酸含量很高[13]。因此，綠豆可作為富集GABA的良好來源[14]。然而，GABA的富集受富集條件，如溫度、濕度、金屬離子濃度、酶活性等因素影響很大[5, 11]。因此，加強(qiáng)對綠豆GABA富集條件的研究，對于成功開發(fā)具有特定生理功能特性的富GABA綠豆產(chǎn)品具有重要的意義。

本文通過對綠豆的基本營養(yǎng)功能物質(zhì)、GABA的產(chǎn)生機(jī)理與影響因素及富含GABA綠豆產(chǎn)品開發(fā)等的總結(jié)，希望能對綠豆功能性產(chǎn)品研究提供參考。

1 綠豆的營養(yǎng)及功能特性概況

綠豆不僅各營養(yǎng)素種類齊全，而且富含多種功能性成分，具有多種生理功能特性。

綠豆淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.60%～54.59%，淀粉顆粒呈圓形或橢圓，形粒徑大小范圍10.50～27.59 μm[15]。綠豆淀粉中直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.50%～39.80%，抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.10%～22.30%[16]?？剐缘矸鄄荒茉谛∧c中消化吸收，但能夠在大腸中被發(fā)酵，改善腸道微生物群組成，具有很好的益生作用[17]。綠豆蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)18.00%～33.10%[16]，比禾谷類高1～3倍，是良好的植物蛋白來源。綠豆蛋白所含氨基酸種類齊全，且賴氨酸豐富[18]，高于一般禾谷類糧食，但缺乏含硫氨基酸[19]，建議與含硫氨基酸豐富的食物同食。綠豆脂肪含量較低，在0.11%～1.90%之間，且棕櫚酸、亞油酸和亞麻酸是其主要脂肪酸，總不飽和脂肪酸相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.82%[16, 20]。綠豆中膳食纖維含量豐富，且主要來源于綠豆皮，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.40%～15.49%[21-22]。豐富的膳食纖維使得綠豆具有良好的潤腸通便、平衡腸道菌叢、抗癌、降血糖、降血膽固醇、預(yù)防心血管疾病等多種功能特性[23]。綠豆中也含有多種人體所需的維生素和礦物質(zhì)[24]。此外，綠豆中還含有多酚、黃酮[16]、GABA[25]等植物化學(xué)物質(zhì)[24, 26-27]，具有抗氧化、降血脂等多種生理功能特性，適當(dāng)食用，有助于改善人體健康。

2 GABA植物富集法產(chǎn)生機(jī)制

GABA是動(dòng)植物抑制性神經(jīng)傳達(dá)不可缺少的物質(zhì)，我國于2009年批準(zhǔn)GABA為新資源食品[7]。近些年來，隨著GABA及富含GABA產(chǎn)品降血壓、降血脂[28-29]、降膽固醇[30]、抗癌[31]、抗焦慮、改善睡眠、提高記憶等生理活性的發(fā)現(xiàn)[32-33]，越來越多的科研工作者對于如何提高植物GABA含量、開發(fā)富含GABA的產(chǎn)品產(chǎn)生了很大的興趣。

目前，產(chǎn)生GABA的方法主要有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和植物富集法?；瘜W(xué)合成法是指利用化學(xué)物質(zhì)直接反應(yīng)合成GABA；微生物發(fā)酵法是指利用一些體內(nèi)含有谷氨酸脫羧酶的微生物生產(chǎn)GABA；植物富集法是指利用逆境脅迫條件下植物的應(yīng)激反應(yīng)生成GABA。由于化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法均存在一定的安全隱患，所得產(chǎn)品難以在食品中應(yīng)用。因此，植物富集法產(chǎn)生GABA受到了國內(nèi)外食品研究者的高度關(guān)注。

高等植物富集產(chǎn)生GABA的機(jī)制主要是由GABA支路和多胺(Polyamines, PAS)降解途徑合成[32, 34-36, 37](圖1)。

圖1 高等植物GABA富集與代謝途徑[38]

Tokunage等[39]追蹤[14C]-GABA代謝路徑，最先發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了植物體內(nèi)存在GABA支路，并說明了GABA可通過TCA循環(huán)氧化分解[40-41]。此后，大量研究顯示[32, 34-35]，GABA支路為L-谷氨酸(L-Glutamic Acid,L-Glu)在限速酶谷氨酸脫羧酶(Glutamate Decarboxylase, GAD)的催化下脫羧形成GABA，再經(jīng)GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABA, Transaminase, GABA-T)可逆催化形成琥珀酸半醛(Succinic Semialdehyde, SSA)，隨后琥珀酸半醛脫氫酶(Succinic Semialdehyde Dehydrogenase, SSADH)將SSA不可逆氧化生成琥珀酸并進(jìn)入三羧酸(Tricarboxylic Acid, TCA)循環(huán)代謝。值得注意的是植物中的限速酶GAD存在鈣調(diào)素結(jié)合域，適量的Ca2+/CaM可激活GAD。當(dāng)植物受到冷激、熱激、滲透脅迫、機(jī)械損傷等，細(xì)胞中Ca2+濃度會(huì)急劇增加，從而增強(qiáng)GAD活性，積累GABA[42]。此外，研究證實(shí)磷酸吡多醛(PLP)不僅是GAD的輔酶，也是GABA-T的輔酶[34]。因此，GAD和GABA-T活性亦受到PLP的影響。

Yang等[36]和Xing等[37]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽蠶豆和發(fā)芽大豆中多胺降解途徑對于GABA富集的貢獻(xiàn)率分別高達(dá)30%和39%，多胺降解途徑積累GABA才逐漸被認(rèn)識并重視起來。此后，大量研究顯示，多胺降解途徑即為二胺(Put)或多胺(Spm和Spd)分別經(jīng)二胺氧化酶(Diamine Oxidases, DAO)和多胺氧化酶(Polyamine Oxidases, PAO)催化生成4-氨基丁醛，再經(jīng)氨基醛脫氫酶(Aminoaldehyde Dehydrogenase, AMADH)脫氫生成GABA，與GABA支路交會(huì)后在GABA-T及SSADH催化下進(jìn)入TCA循環(huán)氧化分解[43]。

表1 不同發(fā)芽條件對綠豆GABA含量的影響

通過對GABA產(chǎn)生機(jī)制的探究可知，GABA的產(chǎn)生與L-Glu、Put、Spd和Spm等底物濃度，GAD、GABA-T、SSADH、DAO、PAO、AMADH等酶活性密切相關(guān)，且不同植物GABA代謝相關(guān)酶的組成、特性等不同[44]。在實(shí)際生產(chǎn)加工富集過程中，特定植物會(huì)因加工條件如溫度、pH、金屬離子、鹽離子、氧濃度等不同而直接或者間接影響底物濃度和酶活性，從而影響GABA富集效果。因此，研究綠豆GABA的產(chǎn)生機(jī)制，探究不同加工條件對GABA富集的影響，對于指導(dǎo)植物GABA富集具有重要作用。

3 綠豆發(fā)芽富集GABA的影響因素

已報(bào)道的糧谷類通過發(fā)芽富集GABA的有糙米、大麥、小米、大豆、粟谷、綠豆、蠶豆、豇豆等[8, 11, 14, 36, 39]。綠豆作為一種糧食作物，本身非常安全，而且具備易儲存、發(fā)芽周期短、酶活力高等優(yōu)點(diǎn)，可用來富集生產(chǎn)GABA。然而，不同的植物富集法的條件對綠豆GABA的富集有很大影響，表1對不同處理?xiàng)l件對發(fā)芽綠豆GABA含量的影響進(jìn)行了總結(jié)。

綜合不同處理?xiàng)l件對發(fā)芽綠豆GABA含量的影響可以發(fā)現(xiàn)，綠豆發(fā)芽富集GABA量的高低與水分、溫度、時(shí)間、促生因子等密切相關(guān)。

3.1 水分

浸泡或者淋水都有助于增加綠豆水分含量，使綠豆水分保持在一定范圍內(nèi)，激活綠豆代謝酶系，增加GABA含量。但淋水時(shí)間間隔太短，供水充足，一方面會(huì)引起氧氣濃度下降，不利于發(fā)芽的正常進(jìn)行[50]；另一方面過多的水分會(huì)引起水溶性物質(zhì)的流失，營養(yǎng)品質(zhì)下降，也不利于發(fā)芽[51]。尹濤等[51]研究發(fā)現(xiàn)，隨著淋水間隔時(shí)間的增加(0～4 h/次)，GABA含量呈交替性變化，且淋水頻率為3 h/次時(shí)，每次噴淋1 min，GABA含量達(dá)到最大。

3.2 溫度

研究顯示，一般情況下，隨著浸泡溫度(20～40 ℃)、發(fā)芽溫度(20～35 ℃)的增加，綠豆芽中GABA含量均顯著增加，但浸泡溫度和發(fā)芽溫度太高或太低都不利于GABA的積累[46, 51]。這主要是因?yàn)殡S著發(fā)芽溫度在一定范圍內(nèi)的升高，芽體內(nèi)的酶活力增加，呼吸作用加強(qiáng)，物質(zhì)分解、轉(zhuǎn)換和運(yùn)輸速率快，有助于加快GABA的積累[52]。然而，也有研究顯示，經(jīng)歷低溫處理(0～-5 ℃處理2～4 h)，能引起細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度上升，激活GAD，從而引起GABA的積累[53]。陳振等[54]研究顯示，不同品種的芽用綠豆?fàn)C種處理后隨著萌發(fā)時(shí)間的增加，GAD活性不斷減小，GABA含量均較低(<18.300 mg/100 g)，且有持續(xù)減小的趨勢。而Jeon等[55]研究顯示，糙米發(fā)芽浸泡前經(jīng)歷熱處理(40和45 ℃)，有利于GABA的積累。這可能是因?yàn)殛愓竦萚54]實(shí)驗(yàn)所用芽用綠豆不適合富集GABA，或者綠豆經(jīng)燙溫度過高，GABA代謝酶被破壞所致。

3.3 時(shí)間

大量研究顯示，隨著綠豆浸泡時(shí)間/發(fā)芽時(shí)間的延長，GABA含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且不同文獻(xiàn)報(bào)道的最佳浸泡時(shí)間和發(fā)芽時(shí)間差別較大[8-9, 45-46, 57]。這是因?yàn)榻菸^程中，GABA合成相關(guān)酶被激活，胚內(nèi)干物質(zhì)從凝膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z物質(zhì)，胚乳中的干物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性物質(zhì)，綠豆的物質(zhì)代謝速率加快，有利于谷氨酸脫羧酶的合成[56]，并隨著發(fā)芽時(shí)間的增加，內(nèi)源酶被激活，蛋白質(zhì)水解使得作為底物的L-Glu含量增多，從而使GABA含量增加。但過長的浸泡時(shí)間會(huì)使得綠豆吸水過多，綠豆本身的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，代謝降低，使GABA的合成減少[45]；而且隨著綠豆發(fā)芽時(shí)間的延長，綠豆中GABA含量的升高，谷氨酸的脫羧反應(yīng)受到抑制，或由于GABA與α-酮戊二酸反應(yīng)生成谷氨酸，從而使GABA含量降低[57]。

3.4 促生因子

發(fā)芽過程中除了提供必要的水分、溫度、發(fā)芽時(shí)間，適當(dāng)添加單一或復(fù)合促生因子也直接或間接影響綠豆的發(fā)芽效果及GABA富集量。這些促生因子包括各類鹽離子，如CaCl2、NaCl；維生素，如VC、VB6；GABA代謝底物等，如MSG、L-Glu。左娜等[46]通過在發(fā)芽綠豆培養(yǎng)液中添加CaCl2發(fā)現(xiàn)，隨著鈣離子濃度(0～2.5 mmol/L)的升高，GABA含量增加，且當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到2.5 mmol/L時(shí)，GABA含量達(dá)到最大值0.139 8 mg/g。寧初光等[57]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)芽綠豆浸泡液中Ca2+濃度在0.3 mol/L以內(nèi)時(shí)，能促進(jìn)發(fā)芽綠豆GABA的積累，且當(dāng)Ca2+濃度為0.1 mmol/L，GABA的含量最高(282 mg/100 g)，比空白對照樣品高出13.2%，而過高的Ca2+濃度處理，綠豆芽中GABA含量反而下降。Yang等[58]研究顯示，蠶豆經(jīng)歷NaCl脅迫處理有助于GABA的富集。研究顯示[46, 57, 59]，隨著VC、L-Glu及MSG添加量的增加，溶液中H+濃度增加，有利于L-Glu脫羧，而不利于GABA轉(zhuǎn)氨，從而利于GABA的積累，但過高的濃度會(huì)使培養(yǎng)液中離子濃度升高，細(xì)胞外滲透壓高，引起物質(zhì)運(yùn)輸通道的堵塞，影響GAD活性，不利于GABA合成。

3.6 其他

此外，其他糧食及豆類，如發(fā)芽糙米、發(fā)芽豆類等富集GABA的例子還顯示，機(jī)械損傷、低氧脅迫[36, 60-61]、高靜水壓處理[62]、電解水處理[63]、醋酸鈉緩沖液處理[11]等有利于GABA的富集，但這些在綠豆中還沒相關(guān)研究。

4 富含GABA的綠豆產(chǎn)品開發(fā)現(xiàn)狀

目前市場上食品級的GABA產(chǎn)品主要來自發(fā)芽糙米、米胚芽、茶飲料、發(fā)酵豆制品，且國內(nèi)外多家公司已通過發(fā)酵谷物(糙米為主)開發(fā)出食品級GABA 及相關(guān)產(chǎn)品，其中以日本市場最豐富，種類涉及糧食、茶葉、乳制品、飲料、巧克力和補(bǔ)充劑等。

近些年來，對于通過發(fā)芽使綠豆富集GABA的研究逐漸成為熱點(diǎn)。蘇曉琴等[64]篩選菌株得到一株產(chǎn)GABA的布氏乳桿菌，對綠豆進(jìn)行發(fā)酵，最終制得消費(fèi)者可接受度較高的富含GABA(23.44 mg/100 g)的功能性綠豆酸面團(tuán)面包；郝文靜等[49]利用發(fā)芽綠豆經(jīng)打漿處理、通過外源添加谷氨酸鈉、Ca2+、VB6等步驟進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化法，獲得的綠豆產(chǎn)品中GABA含量為796.58 mg/100 g(干基)，為開發(fā)高GABA保健豆芽漿、豆芽粉等豆芽深加工產(chǎn)品提供了可能。吳小勇等[65]以L-Glu浸泡綠豆使綠豆萌發(fā)，并將此種萌發(fā)后的綠豆提取液加工成了富含GABA且具有降血壓功能的綠豆酸奶。鄔海雄等[66]研究發(fā)現(xiàn)，將綠豆胚發(fā)芽18 h，并以此作為風(fēng)味名食中山杏仁餅的原料具有較佳的品質(zhì)特性，且GABA含量高達(dá)95.2 mg/100 g。顧振新等[47]將正常發(fā)芽的豆類芽菜置于培養(yǎng)液中進(jìn)行低氧脅迫發(fā)芽(培養(yǎng)液中溶氧濃度為3.5～6.5 mg/L)，后經(jīng)冷凍干燥后獲得富含GABA(300 mg/100 g, DW)的凍干豆類芽菜。Park等[67]將富含GABA的發(fā)酵綠豆提取液應(yīng)用于化妝品種，此種化妝品由于富含GABA，能起到促進(jìn)膠原蛋白合成、減輕炎癥、保護(hù)皮膚的作用。此外，大量研究顯示[9, 25, 45-49]，綠豆發(fā)芽能夠富集GABA，這為富含GABA綠豆芽及綠豆深加工產(chǎn)品的開發(fā)提供了依據(jù)。

然而，相比發(fā)芽糙米富集GABA的研究與應(yīng)用，綠豆富集GABA的理論研究仍然缺乏，市場化產(chǎn)品非常有限，仍需加大科研投入，促進(jìn)綠豆深加工產(chǎn)品的開發(fā)，加大綠豆深加工產(chǎn)品的市場占有率。

5 展望

綠豆?fàn)I養(yǎng)豐富，且GABA代謝底物谷氨酸含量很高，是富集GABA的良好來源，已有大量研究表明綠豆發(fā)芽能夠富集GABA。但從綠豆品種資源方面看，綠豆屬于小宗作物，且綠豆品種與GABA富集之間的關(guān)系鮮見報(bào)道；從富集方面看，綠豆發(fā)芽富集GABA條件各異，外源添加物的引入也造成了安全隱患，且大多難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化；從加工損失方面看，綠豆經(jīng)歷發(fā)芽富集的GABA，又會(huì)因?yàn)槭秤们凹庸ぬ幚恚鐭崽幚淼?，造成GABA的顯著損失，使其營養(yǎng)功能得不到最終發(fā)揮。因此，目前國內(nèi)外市場上以綠豆為來源生產(chǎn)GABA或者富含GABA的綠豆相關(guān)功能性產(chǎn)品仍然十分匱乏。

總體來看，對于以綠豆為原料富集GABA及相應(yīng)產(chǎn)品的開發(fā)，建議注意以下幾個(gè)方面。第一，在原料選取方面，應(yīng)從綠豆品種選擇入手，關(guān)注綠豆品種與富集效果的關(guān)系，篩選出適宜于富集GABA的綠豆品種。第二，在GABA富集技術(shù)的改進(jìn)與突破上，應(yīng)簡化富集工藝，降低生產(chǎn)能耗，減少外源物的添加，增加GABA富集過程的安全性及可行性。第三，在減少加工后期損失方面，則應(yīng)選取適宜的加工工藝及產(chǎn)品類型，減小因高溫熟化、滅菌等加工所造成的GABA損失，如選取GABA損失較少的微波加工方式的微波類產(chǎn)品。第四，在功能定位與產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)方面，應(yīng)從消費(fèi)人群入手，開發(fā)針對特定人群的功能型產(chǎn)品，最終產(chǎn)品中GABA的含量以及產(chǎn)品的推薦食用量等均需給予標(biāo)識。

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