植物油中甾醇含量快速測定方法

鄒燕娣 包李林 熊巍林 周青燕 林俞霞

(道道全糧油股份有限公司;國家油菜籽加工技術研發(fā)分中心，岳陽 414000)

植物甾醇是一種三萜醇類化合物，其化學結構與膽固醇非常相似，僅側鏈結構不同，是一種天然的活性成分，具有十分重要的生理功能，如降膽固醇濃度、抗癌作用、基體抗氧化、預防心腦血管、免疫調節(jié)等特點[1-5]，廣泛應用在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)。植物甾醇廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實和種子中[6]，在所有來源于植物種子的油脂中都含有甾醇，主要包括菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等，具有開發(fā)利用價值。植物油是人類膳食甾醇的主要來源，其提供的植物甾醇占膳食總攝入量40%。因此測定植物油中甾醇含量很有意義。目前植物油中甾醇含量的測定方法主要有薄層色譜法(TLC)[7]、氣相色譜法(GC)[8-10]和高效液相色譜法(HPLC)[11-13]等，其中氣相分析色譜法分離效果好、分析速度快、靈敏度高、操作簡便。本文借鑒GB/T 25223—2010《動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法》[14]進行植物油中甾醇含量測定，并對其進行改進，使得檢測方法更簡單，檢測線更低，結果更準確。

1 材料與方法

1.1 儀器

7890B型安捷倫氣相色譜儀，HP-5色譜柱；檢測器：FID；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋；玻璃層析柱：長47 cm，內徑1.0 cm；R201D旋轉蒸發(fā)儀：附真空泵和水浴鍋；10 cm×10 cm普通硅膠薄層板；碘單質；玻璃展開槽：合適10 cm×20 cm薄層板的使用；展開劑∶V(正己烷)∶V(乙醚)=50∶50。

1.2 試劑

甾醇標準品(膽甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇)：純度≥95%；膽固醇：純度≥99%；豆甾醇標準品：純度≥95%；正庚烷：色譜純；乙醇：分析純；乙醚：色譜純(重蒸)；氧化鋁：分析純(60～200目，層析專用)；Ⅰ級氧化鋁：氧化鋁置于450 ℃下煅燒12 h，室溫下黑暗靜止12 h；1.2 mol/L KOH-乙醇溶液；33.6 g KOH溶于100 mL超純水中，用乙醇定容至500 mL；1.0 mg/mL膽固醇內標溶液：準確稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)膽固醇于100 mL容量瓶中，加入正庚烷溶解并定容。豆甾醇標準溶液Ⅰ：稱取豆甾醇標準品0.021 4 g(精確至0.000 1 g)于燒瓶中，精確量取10 mL膽固醇內標溶液，加熱回流15 min，冷卻至常溫。0.471 8 mg/mL豆甾醇標準溶液Ⅱ:準確稱取一定量的豆甾醇(精確至0.000 1 g)于25 mL容量瓶中，用適量正庚烷溶解并定容，并準確量取1 mL豆甾醇標液和1 mL 1.0 mg/mL膽固醇內標溶液混勻，上機測定豆甾醇和膽固醇的峰面積，采用內標物的濃度來反測豆甾醇標準溶液Ⅱ的濃度，即得濃度為0.471 8 mg/mL。

1.3 儀器分析條件

色譜柱溫度：270 ℃；進樣口溫度：280 ℃；檢測器溫度：290 ℃；氮氣和流速：30 mL/min，分流比：20∶1。

1.4 實驗方法

本實驗方法參照 GB/T 25223—2010《動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法》。

1.4.1 皂化：稱取0.25 g(精確至0.00 01 g)的油樣于平底燒瓶中，加入1 mL 1 mg/L的膽固醇標準溶液，混勻，加入5 mL 1.2 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液，混勻，置于70 ℃水浴鍋中攪拌皂化至溶液澄清透明(約15 min)。

1.4.2 氧化鋁層析提取不皂化物：向層析柱倒入10 mL乙醇，并稱取10 gⅠ級氧化鋁分次倒入層析柱中，再用10 mL乙醇將層析柱中的氧化鋁洗入層析柱中。用5 mL乙醇稀釋皂化液，并移取5 mL皂化液，到裝好的層析柱中，用250 mL平底燒瓶收集流出液，流速為2 mL/min，待皂化液流完后，加入5 mL乙醇洗脫，待流盡，加入30 mL乙醚繼續(xù)洗脫。將收集的洗脫液旋轉濃縮至干，用少量乙醚溶解平底燒瓶的目標物。此樣品稱為層析樣品。

1.4.3 薄層色譜分離甾醇：將氧化鋁層析后提取的不皂化物乙醚溶液，用平頭微量注射器吸取溶液(共200 μL)點在薄層板下邊緣2 cm處，樣液點成圓點，但直徑不超過3 mm，圓點兩端距離邊緣至少留出3 cm間隙。吸取50 μL膽固醇標準溶液在距離邊緣1.5 cm處，左右各點一點。在展開槽中加入大約100 mL展開劑。將板放入展開槽中展開，直到溶劑到達上邊緣。取出薄層板，在通風廚中揮干溶劑，而后將薄層板放入含有碘單質的燒杯中，用蓋子蓋好，用吹風機加熱加快碘單質揮發(fā)，待薄層板中的物質完全顯色后，用鉛筆快速標記出所需要的甾醇范圍，用刀片刮下標記的硅膠層，并收集到已準備過濾的濾紙上，加入0.5 mL乙醇，5 mL乙醚對硅膠洗提3次，用旋轉蒸發(fā)器將乙醚提取物濃縮至干，用1～2 mL正庚烷溶解目標物。此樣品稱為薄層樣品。

1.5 結果計算

1.5.1 校正系數(shù)的測定

甾醇標準溶液進樣1 μL，確定各甾醇(膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇)出峰時間。豆甾醇標準品溶液Ⅰ進樣1 μL，重復進樣3～5針，得到內標物膽固醇和豆甾醇的峰面積。

校正系數(shù)f的計算公式：

式中：f為校正系數(shù)；A內為膽固醇內標物的峰面積；A標為豆甾醇標準品峰面積；C內為內標溶液膽固醇濃度/mg/mL；m標為配制標準品溶液時豆甾醇標準品的取用量/mg；0.99為內標物膽固醇的純度；0.95為標準品豆甾醇的純度。

1.5.2 甾醇含量計算

式中：P總為甾醇總量/mg/kg；f為校正系數(shù)；0.99為內標物膽固醇的純度；A甾醇酯為油樣中植物甾醇峰面積之和；m油樣為油樣的取用量/mg；1 000為單位換算系數(shù)。

2 結果處理與討論

2.1 前處理討論

本實驗在國標的基礎上進行了優(yōu)化，國標中使用價格較昂貴的膽甾烷醇或樺木醇做內標物，且沒有做內標物和主要甾醇的校正實驗，而本實驗因植物油中膽固醇含量很少且便宜而被選做內標物，并進行了校正實驗，使得結果更準確。國標前處理一個樣品大約需要7～8 h，而優(yōu)化后的方法處理一個樣品則只需要50 min，大大地縮短了時間，可進行大批量樣品處理。

2.2 色譜圖

甾醇標準樣出峰色譜圖如圖1所示。圖1為甾醇標準樣出峰色譜圖，樣品可根據(jù)其出峰時間確定甾醇種類，膽固醇和豆甾醇出峰色譜圖如圖2所示。圖2為內標物膽固醇和豆甾醇標準溶液Ⅰ的出峰色譜圖，根據(jù)膽固醇和豆甾醇各自的峰面積，利用2.1 中校正系數(shù)計算公式，得出f=1.106 9。

圖1 甾醇標準樣出峰色譜圖

圖3和圖4分別為玉米油氧化鋁層析后和硅膠薄層后的甾醇出峰色譜圖，很顯然，氧化鋁層析后玉米油中主要的甾醇峰面積明顯大于薄層后的，這跟進樣溶液中各甾醇含量有關，其余沒有什么不同。同時，國標中的樣品都加入了價格昂貴的硅烷化試劑，而在本實驗中則不加，不影響樣品中的甾醇含量測定，因為硅烷化試劑只是起到提高檢測靈敏度的作用。

圖2 膽固醇和豆甾醇出峰色譜圖

圖3 層析后玉米油甾醇色譜圖

圖4 薄層后玉米油甾醇色譜圖

2.3 重復性實驗

對同一菜籽油和玉米油分別按照氧化鋁層析法和硅膠薄層法平行進行3次實驗，方法重復性實驗見表1。

表1 方法重復性實驗

由表1可知，分別采用氧化鋁層析法和硅膠薄層法分別對菜籽油和玉米油平行進行3次實驗，RSD%都在0.012%～3.4%，說明兩種方法的重復性較好。由表1和“3.2色譜圖”中圖3和圖4圖可見，處理同一油樣，其氧化鋁層析后和硅膠薄層后的甾醇含量變化不大，圖譜中各甾醇分離效果好，除了主要甾醇峰面積大小有差異，其余沒什么不同。這說明樣品皂化液經氧化鋁層析后提取的不皂化物中，主要含甾醇，且甾醇種類主要為菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇，其他物質并不影響主要甾醇含量的測定。因此將植物油甾醇檢測方法進行簡化和優(yōu)化，其步驟為：皂化→氧化鋁層析提取不皂化物→濃縮→上機檢測。

2.4 準確性實驗

以菜籽油為本底，向其加入一定量的豆甾醇標準溶液Ⅱ，按照優(yōu)化后的方法進行實驗，方法加標回收率實驗見表2。

表2 方法加標回收率實驗

由表2可知，豆甾醇加標回收率在94.0 7%～104%。由此可證明，本實驗方法對測定植物油中甾醇含量具有較好的準確性。

3 結論

本研究通過參照GB/T 25223—2010方法進行植物油中甾醇含量的測定，通過比較氧化鋁層析后和硅膠薄層后的重復性實驗可知，同一樣品經氧化鋁層析后和硅膠薄層分離后的甾醇含量變化很小，其實驗重復性RSD為0.012%～3.4%。故將GB/T 25223—2010方法的前處理進行了簡化和優(yōu)化，不但大大縮短了時間，而且豆甾醇加標實驗回收率為94.07%～104%；說明優(yōu)化后的方法快速、準確。

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