植物油中甾醇含量快速測定方法

鄒燕娣 包李林 熊巍林 周青燕 林俞霞

(道道全糧油股份有限公司;國家油菜籽加工技術(shù)研發(fā)分中心，岳陽 414000)

植物甾醇是一種三萜醇類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與膽固醇非常相似，僅側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同，是一種天然的活性成分，具有十分重要的生理功能，如降膽固醇濃度、抗癌作用、基體抗氧化、預(yù)防心腦血管、免疫調(diào)節(jié)等特點(diǎn)[1-5]，廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)。植物甾醇廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中[6]，在所有來源于植物種子的油脂中都含有甾醇，主要包括菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等，具有開發(fā)利用價值。植物油是人類膳食甾醇的主要來源，其提供的植物甾醇占膳食總攝入量40%。因此測定植物油中甾醇含量很有意義。目前植物油中甾醇含量的測定方法主要有薄層色譜法(TLC)[7]、氣相色譜法(GC)[8-10]和高效液相色譜法(HPLC)[11-13]等，其中氣相分析色譜法分離效果好、分析速度快、靈敏度高、操作簡便。本文借鑒GB/T 25223—2010《動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法》[14]進(jìn)行植物油中甾醇含量測定，并對其進(jìn)行改進(jìn)，使得檢測方法更簡單，檢測線更低，結(jié)果更準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 儀器

7890B型安捷倫氣相色譜儀，HP-5色譜柱；檢測器：FID；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋；玻璃層析柱：長47 cm，內(nèi)徑1.0 cm；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：附真空泵和水浴鍋；10 cm×10 cm普通硅膠薄層板；碘單質(zhì)；玻璃展開槽：合適10 cm×20 cm薄層板的使用；展開劑∶V(正己烷)∶V(乙醚)=50∶50。

1.2 試劑

甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(膽甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇)：純度≥95%；膽固醇：純度≥99%；豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥95%；正庚烷：色譜純；乙醇：分析純；乙醚：色譜純(重蒸)；氧化鋁：分析純(60～200目，層析專用)；Ⅰ級氧化鋁：氧化鋁置于450 ℃下煅燒12 h，室溫下黑暗靜止12 h；1.2 mol/L KOH-乙醇溶液；33.6 g KOH溶于100 mL超純水中，用乙醇定容至500 mL；1.0 mg/mL膽固醇內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)膽固醇于100 mL容量瓶中，加入正庚烷溶解并定容。豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ：稱取豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品0.021 4 g(精確至0.000 1 g)于燒瓶中，精確量取10 mL膽固醇內(nèi)標(biāo)溶液，加熱回流15 min，冷卻至常溫。0.471 8 mg/mL豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ:準(zhǔn)確稱取一定量的豆甾醇(精確至0.000 1 g)于25 mL容量瓶中，用適量正庚烷溶解并定容，并準(zhǔn)確量取1 mL豆甾醇標(biāo)液和1 mL 1.0 mg/mL膽固醇內(nèi)標(biāo)溶液混勻，上機(jī)測定豆甾醇和膽固醇的峰面積，采用內(nèi)標(biāo)物的濃度來反測豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ的濃度，即得濃度為0.471 8 mg/mL。

1.3 儀器分析條件

色譜柱溫度：270 ℃；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；檢測器溫度：290 ℃；氮?dú)夂土魉伲?0 mL/min，分流比：20∶1。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)方法參照 GB/T 25223—2010《動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法》。

1.4.1 皂化：稱取0.25 g(精確至0.00 01 g)的油樣于平底燒瓶中，加入1 mL 1 mg/L的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，加入5 mL 1.2 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液，混勻，置于70 ℃水浴鍋中攪拌皂化至溶液澄清透明(約15 min)。

1.4.2 氧化鋁層析提取不皂化物：向?qū)游鲋谷?0 mL乙醇，并稱取10 gⅠ級氧化鋁分次倒入層析柱中，再用10 mL乙醇將層析柱中的氧化鋁洗入層析柱中。用5 mL乙醇稀釋皂化液，并移取5 mL皂化液，到裝好的層析柱中，用250 mL平底燒瓶收集流出液，流速為2 mL/min，待皂化液流完后，加入5 mL乙醇洗脫，待流盡，加入30 mL乙醚繼續(xù)洗脫。將收集的洗脫液旋轉(zhuǎn)濃縮至干，用少量乙醚溶解平底燒瓶的目標(biāo)物。此樣品稱為層析樣品。

1.4.3 薄層色譜分離甾醇：將氧化鋁層析后提取的不皂化物乙醚溶液，用平頭微量注射器吸取溶液(共200 μL)點(diǎn)在薄層板下邊緣2 cm處，樣液點(diǎn)成圓點(diǎn)，但直徑不超過3 mm，圓點(diǎn)兩端距離邊緣至少留出3 cm間隙。吸取50 μL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在距離邊緣1.5 cm處，左右各點(diǎn)一點(diǎn)。在展開槽中加入大約100 mL展開劑。將板放入展開槽中展開，直到溶劑到達(dá)上邊緣。取出薄層板，在通風(fēng)廚中揮干溶劑，而后將薄層板放入含有碘單質(zhì)的燒杯中，用蓋子蓋好，用吹風(fēng)機(jī)加熱加快碘單質(zhì)揮發(fā)，待薄層板中的物質(zhì)完全顯色后，用鉛筆快速標(biāo)記出所需要的甾醇范圍，用刀片刮下標(biāo)記的硅膠層，并收集到已準(zhǔn)備過濾的濾紙上，加入0.5 mL乙醇，5 mL乙醚對硅膠洗提3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將乙醚提取物濃縮至干，用1～2 mL正庚烷溶解目標(biāo)物。此樣品稱為薄層樣品。

1.5 結(jié)果計算

1.5.1 校正系數(shù)的測定

甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣1 μL，確定各甾醇(膽固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇)出峰時間。豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液Ⅰ進(jìn)樣1 μL，重復(fù)進(jìn)樣3～5針，得到內(nèi)標(biāo)物膽固醇和豆甾醇的峰面積。

校正系數(shù)f的計算公式：

式中：f為校正系數(shù)；A內(nèi)為膽固醇內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A標(biāo)為豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；C內(nèi)為內(nèi)標(biāo)溶液膽固醇濃度/mg/mL；m標(biāo)為配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液時豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的取用量/mg；0.99為內(nèi)標(biāo)物膽固醇的純度；0.95為標(biāo)準(zhǔn)品豆甾醇的純度。

1.5.2 甾醇含量計算

式中：P總為甾醇總量/mg/kg；f為校正系數(shù)；0.99為內(nèi)標(biāo)物膽固醇的純度；A甾醇酯為油樣中植物甾醇峰面積之和；m油樣為油樣的取用量/mg；1 000為單位換算系數(shù)。

2 結(jié)果處理與討論

2.1 前處理討論

本實(shí)驗(yàn)在國標(biāo)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，國標(biāo)中使用價格較昂貴的膽甾烷醇或樺木醇做內(nèi)標(biāo)物，且沒有做內(nèi)標(biāo)物和主要甾醇的校正實(shí)驗(yàn)，而本實(shí)驗(yàn)因植物油中膽固醇含量很少且便宜而被選做內(nèi)標(biāo)物，并進(jìn)行了校正實(shí)驗(yàn)，使得結(jié)果更準(zhǔn)確。國標(biāo)前處理一個樣品大約需要7～8 h，而優(yōu)化后的方法處理一個樣品則只需要50 min，大大地縮短了時間，可進(jìn)行大批量樣品處理。

2.2 色譜圖

甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣出峰色譜圖如圖1所示。圖1為甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣出峰色譜圖，樣品可根據(jù)其出峰時間確定甾醇種類，膽固醇和豆甾醇出峰色譜圖如圖2所示。圖2為內(nèi)標(biāo)物膽固醇和豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ的出峰色譜圖，根據(jù)膽固醇和豆甾醇各自的峰面積，利用2.1 中校正系數(shù)計算公式，得出f=1.106 9。

圖1 甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣出峰色譜圖

圖3和圖4分別為玉米油氧化鋁層析后和硅膠薄層后的甾醇出峰色譜圖，很顯然，氧化鋁層析后玉米油中主要的甾醇峰面積明顯大于薄層后的，這跟進(jìn)樣溶液中各甾醇含量有關(guān)，其余沒有什么不同。同時，國標(biāo)中的樣品都加入了價格昂貴的硅烷化試劑，而在本實(shí)驗(yàn)中則不加，不影響樣品中的甾醇含量測定，因?yàn)楣柰榛噭┲皇瞧鸬教岣邫z測靈敏度的作用。

圖2 膽固醇和豆甾醇出峰色譜圖

圖3 層析后玉米油甾醇色譜圖

圖4 薄層后玉米油甾醇色譜圖

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

對同一菜籽油和玉米油分別按照氧化鋁層析法和硅膠薄層法平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)見表1。

表1 方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

由表1可知，分別采用氧化鋁層析法和硅膠薄層法分別對菜籽油和玉米油平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，RSD%都在0.012%～3.4%，說明兩種方法的重復(fù)性較好。由表1和“3.2色譜圖”中圖3和圖4圖可見，處理同一油樣，其氧化鋁層析后和硅膠薄層后的甾醇含量變化不大，圖譜中各甾醇分離效果好，除了主要甾醇峰面積大小有差異，其余沒什么不同。這說明樣品皂化液經(jīng)氧化鋁層析后提取的不皂化物中，主要含甾醇，且甾醇種類主要為菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇，其他物質(zhì)并不影響主要甾醇含量的測定。因此將植物油甾醇檢測方法進(jìn)行簡化和優(yōu)化，其步驟為：皂化→氧化鋁層析提取不皂化物→濃縮→上機(jī)檢測。

2.4 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

以菜籽油為本底，向其加入一定量的豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ，按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，方法加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)見表2。

表2 方法加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

由表2可知，豆甾醇加標(biāo)回收率在94.0 7%～104%。由此可證明，本實(shí)驗(yàn)方法對測定植物油中甾醇含量具有較好的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本研究通過參照GB/T 25223—2010方法進(jìn)行植物油中甾醇含量的測定，通過比較氧化鋁層析后和硅膠薄層后的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)可知，同一樣品經(jīng)氧化鋁層析后和硅膠薄層分離后的甾醇含量變化很小，其實(shí)驗(yàn)重復(fù)性RSD為0.012%～3.4%。故將GB/T 25223—2010方法的前處理進(jìn)行了簡化和優(yōu)化，不但大大縮短了時間，而且豆甾醇加標(biāo)實(shí)驗(yàn)回收率為94.07%～104%；說明優(yōu)化后的方法快速、準(zhǔn)確。

[1]Normen L, Dutta P, Lia A, et al. Soysterol esters and β- sitostanol ester as inhibitors of cholesterol absorption in human.small bowel[J]. Am J Clin Nutr, 2000,71：908-913

[2]韓軍花，楊月欣.植物甾醇的性質(zhì)、功能及應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊,2001,28(5)：285-291

HAN Junhua, YANG Yuexin. The properties, functions and applications of phytosterols [J]. Foreign Medical Health Branch,2001,28(5)：285-291

[3]文鏡，樊蓉.植物甾醇和植物甾烷醇降膽固醇的功效和安全性[J].食品科學(xué),2005,26(8)：437-442

WEN Jing, FAN Rong. The cholesterol-lowering efficacy and safety of phytosterol and plant sterane alcohol [J]. Journal of Food Science, 2005, 26 (8) ：437-442

[4]吳素萍,章中.植物甾醇的研究現(xiàn)狀[J].中國食物與營養(yǎng),2007(9)：20-22

WU Suping,ZHANG Zhong.The research status of phytosterols[J]. Chinese Food and Nutrition,2007(9)：20-22

[5]LEESAM,MOKRHY,LEERS,etal.Plantsterolsascholesterol-loweringagents[J].Atherosclerossis,1997,28(2)：325-328

[6]Vieno Piironen, Jari Toivo, Riitta Puupponen-Pimia. Plantsterols in vegetables, fruits and berries[J]. Journal of theScience of Food and Agriculture, 2003, 83：330-337

[7]李和,李玉幗. 植物油中常見的幾種植物甾醇的薄層色譜分離與鑒別[J].中國油脂,1997,22(2)：20-22

LIN He,LIN Yuguo.The separation and identification of several phytosterols found in vegetable oils [J]. Chinese Oil, 1997,22(2)：20-22

[8]彭浩,陳文強(qiáng),鄧百萬.氣相色譜法測定食用菜籽油中植物甾醇的組成及含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006,34(19)：4830-4831

PENG Hao, CHEN Wenqiang, DENG baiwan. The determination of phytosterol composition and content in edible rapeseed oil by gas chromatography [J]. Anhui Agricultural Science, 2006,34(19): 483-4831

[9]楊虹,姜元榮,魏婷婷,等.食用油中植物甾醇測定方法的優(yōu)化及含量分析[J].中國糧油學(xué)報,2011,26(2)：120-123

YANG Hong, JIANG Yuanrong, WEI Tingting, et al. The optimization and content analysis of phytosterol in edible oils [J]. Journal of Chinese Grain and Oil,2011,26(2)：120-123

[10]曹萬新,孟橘,陳吉江,等. 精煉過程中玉米油甾醇含量的變化[J].中國油脂,2009,34(8)：16-18

CAO Wanxin , MENG Ju, CHENG Jijiang , et al. The changes in the content of corn oil sterol in the refining process [J]. China Oil, 2009,34(8)：16-18

[11]許文林,沙鷗,錢俊紅.混合植物甾醇中豆甾醇和β-谷甾醇的高效液相色譜分析[J].分析測試學(xué)報, 2003, 22(6)：98-100

XU Wenlin, SHA Ou, QIAN Junhong. The analysis of phytosterol and beta-glusterol by high efficiency liquid chromatography [J]. Journal of Analytical Testing, 2003, 22(6)：98-100

[12]阮慧娜,劉松柏.植物甾醇高效液相色譜法正相和反相檢測方法對比[J].浙江大學(xué)學(xué)報,2013,39(2)：234-235

RUAN Huina, LIU Songbo. The comparison of positive phase and anti-phase detection methods of phytosterol high performance liquid chromatrography[J].Journal of Zhenjiang University,2013,39(2)：234-235

[13]ITOH T,TAMURA T,MATSUMOTOT T.Sterol composition of 19vegetable oils[J].Journal of the American Oil Chemists So-ciety,1973,50：122-125

[14]GB/T 25223—2010,動植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測定氣相色譜法[S]

GB/T 25223—2010,The determination of the composition and total content of animal and plant lipid sterol by gas chromatography[S].