麥胚蛋白雙酶酶解物的制備及其體外醒酒活性的研究

羅思媛 郭紅英,2 張琳娜 王 鋒,2 譚興和,2 何 蕾

(湖南農業(yè)大學食品科學與技術學院1，長沙 410128) (食品科學與生物技術湖南省重點實驗室2,長沙 410128)

小麥胚芽是小麥發(fā)芽及生長的器官之一，同時作為小麥生命的根源，是小麥中營養(yǎng)價值最高的部分[1]，其又名麥芽粉、胚芽，呈金黃色顆粒狀，約占整個麥粒的2%～3%。麥胚含有豐富而優(yōu)質的蛋白質、脂肪及多種維生素、礦物質等多種營養(yǎng)素，是優(yōu)質的人類營養(yǎng)素來源[2]。小麥胚芽氨基酸組成合理，必需氨基酸的相互比值與FAO/WHO頒布的建議模式相似，其中賴氨酸——人類第一限制氨基酸的含量十分高[3]。此外Ge等[4]和Clzver等[5]經過研究均發(fā)現麥胚蛋白具有很好的溶解性、乳化性、起泡性和持水性，不僅可作為畜肉制品的添加劑，以改善食品的結構和口感，還可強化食品營養(yǎng)。

近年來，國內外許多學者因麥胚蛋白的眾多優(yōu)點而產生了濃厚研究興趣，并針對其酶解工藝及酶解產物的功能活性進行了廣泛的研究。張麗霞等[6]研究了堿性蛋白酶與胰蛋白酶雙酶組合水解麥胚蛋白質的工藝及水解產物清除自由基的活性。程云輝等[7]利用超濾法將抗氧化活性肽從麥胚蛋白酶解物中初步分離純化，并比較了超濾前后麥胚蛋白酶解物的氨基酸組成、相對分子質量分布以及抗氧化活性，確定了最優(yōu)工藝參數。與此同時，國內有部分學者利用酶法或非酶法對麥胚蛋白飲料及氨基酸營養(yǎng)液進行研究與制備，以及以麥胚為原料研究開發(fā)了促進鈣吸收、降膽固醇、降血壓、抗氧化等生物活性肽，但鮮有對麥胚多肽的醒酒活性的研究。

酒精引起細胞損傷的因素是多方面的，其中乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)活性降低是酒精引起細胞損傷的主要因素之一。ADH是乙醇代謝過程中的關鍵酶，氧化型輔酶I(NAD+)作為乙醇代謝過程的氫受體與輔酶，是乙醇分解與代謝的必要酶，而多肽可以激活ADH活性并且提高血液中丙氨酸與亮氨酸濃度進而產生穩(wěn)定的NAD+。近年來，國內外學者對醒酒肽的研究也日益增多，Ma等[8]利用高效液相色譜—質譜/質譜法鑒定了一種促進酒精代謝的玉米肽；王真真等[9]對富硒玉米肽和普通玉米肽的醒酒活性進行了研究，并發(fā)現前者的功效優(yōu)于后者；Pan等[10]評價了玉米低聚肽(COP)和姜黃素單獨或聯(lián)合應用對小鼠酒精性損傷的影響及醒酒作用；劉晶晶等[11]以河蜆肉為原料，系統(tǒng)研究了醒酒肽的最佳酶解工藝；寧慶鵬等[12]通過Alcalase蛋白酶制備了具有醒酒作用的花生粕醒酒肽；Seber等[13]進行了大豆醒酒肽的純化及特性研究。為高效利用麥胚資源，本實驗采用雙蛋白酶酶解工藝，研究麥胚蛋白酶解物的體外醒酒活性，以期為麥胚等富含蛋白質的農副產品資源的深度開發(fā)和利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小麥胚：由中央儲備糧株洲直屬庫提供，經干燥、脫脂、粉碎后備用。

無水碳酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、甲醛、三氯乙酸、四氯化碳、硫酸銅、氫氧化鉀、酒石酸鉀鈉等，均為分析純：中國醫(yī)藥(集團)化學試劑有限公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶：丹麥諾維信公司。

1.2 儀器設備

ZN-400A型高速中藥粉碎機：長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠；80目標準篩：浙江上虞市道墟篩具廠；DK-98-IIA型恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；78-2型雙向磁力攪拌器：常州市華普達教學儀器有限公司；pHS-3C型pH計：上海精密科學儀器有限公司；LXJ-IIB型低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；WFJ 7200型可見分光光度計：尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝流程

1.3.2 麥胚的預處理及雙酶酶解

稱取一定量的麥胚粉(過80目篩)，將預處理方式作為實驗變量，共含5種形式：熱變性(80 ℃水浴加熱30 min)、微波處理(750 W，30 s)、添加5% Na2CO3溶液、剪切混合乳化處理(1 500 r/min，20 min)以及未處理參照樣品，保證其他反應條件相同，對這5種麥胚蛋白溶液進行Alcalase酶解，酶解條件為：蛋白質質量分數2.5%、溫度為50 ℃、pH為9.0、Alcalase加酶量[E]/[S]為4 000 U/g、酶解時間為2.0 h。隨后對5種麥胚蛋白酶解液進行水解度(DH)測定，以篩選較佳的預處理方式。

將預處理后的麥胚蛋白酶解液水浴(40 ℃)振蕩10 min，調pH至蛋白酶最適酸堿環(huán)境，按實驗所需酶量加入蛋白酶并置于一定溫度的恒溫培養(yǎng)振蕩器中進行酶解。水解至設定時間后，將酶解液放入95 ℃的熱水中水浴10 min。冷卻至室溫后，將其pH值調至4.0，然后離心(5 000 r/min)12 min，將所得上清液pH調至7.0后即獲得麥胚蛋白酶解液。

1.3.3 肽得率的測定

采用雙縮脲法測定水解液中酸溶性肽含量[14]。

1.3.3.1 標準曲線的繪制。以牛血清白蛋白作為標準蛋白質樣，分別稱取40、50、60、70、80、90、100、110 mg于8支50 mL納氏比色管中，然后各加入1 mL四氯化碳，再用堿性硫酸銅溶液準確稀釋至50 mL，振搖10 min，靜置1 h，取上層清液離心5 min，取離心分離后的透明液于比色皿中。在560 nm波長下測定各溶液的吸光度，繪制牛血清白蛋白濃度X與吸光度Y之間的關系曲線：

Y=1.152×X-0.030，R2=0.992

1.3.3.2 酸溶性肽含量的測定。準確量取麥胚蛋白水解液10 mL與10%TCA 10 mL，將二者混勻，靜置20 min后，在4 000 r/min條件下離心15 min，用雙縮脲測定上清液中的酸溶性肽含量。每個樣品做3個平行實驗。

1.3.4 肽得率(TCA-PSI)的計算

水解后產生的酸溶性肽用雙縮脲法測定[15-16]，原料中蛋白質含量用凱氏定氮法測定，肽得率(TCA-PSI)=酶解液中酸溶性肽含量/原料中蛋白質含量×100%

1.3.5 游離氨基氮含量的測定

采用甲醛電位滴定法[16]。

1.3.6 水解度(DH)的計算

用甲醛電位滴定法測定水解液中游離氨基氮含量[17]，用凱氏定氮法測定總氮含量，再按公式計算水解度：

水解度(DH)=游離氨基氮含量/總氮含量×100%

1.3.7 體外乙醇脫氫酶(ADH)激活率的測定

體外ADH激活率的測定采用用瓦勒-霍赫法進行[18]。將1.5 mL焦磷酸緩沖溶液(pH為8.8)、27 mmol/L氧化型輔酶(NAD)1.0 mL及11.5%的乙醇溶液0.5 mL加入試管中，再加入樣品溶液0.1 mL，混勻后25 ℃水浴5 min后，立即加入0.25 μ/mL乙醇脫氫酶(ADH)0.1 mL，搖勻后于340 nm處測定吸光度，每10 s讀數一次，連續(xù)測定5 min。

激活率=(加樣組酶活力-空白組酶活力)/空白組酶活力

2 結果與分析

2.1 麥胚成分分析

對處理后待用的原料小麥胚進行成分分析，結果顯示，蛋白質、脂肪、含水量分別為28.73%、2.29%、14.54%，碳水化合物為50.16%，灰分為4.28%。

2.2 預處理的影響

因為蛋白酶難以水解天然蛋白質分子中緊密的立體結構，所以對麥胚蛋白質進行預處理有一定意義，以破壞其高級結構，暴露出那些易與酶發(fā)生作用而又處于分子內部的部位，故而在一定程度上增加蛋白水解酶的作用位點，加快酶解速率[19-21]。麥胚蛋白酶解液經5種方式預處理后的水解度如圖1所示。

圖1 預處理對堿性蛋白酶酶解的影響

從圖1顯示結果可知，添加碳酸鈉溶液和剪切乳化兩種預處理方式對促進麥胚蛋白水解、提高水解度均具有明顯作用，且前者比后者高1.51%；與未處理的樣品相比，麥胚蛋白的水解度提高了42.49%。究其原因可能是因為碳酸鈉是強堿弱酸鹽，在麥胚水溶液中解離出使溶液呈堿性的OH-離子，影響麥胚蛋白中部分基團的解離程度，破壞組成蛋白質分子的非共價鍵，將原本嚴密且有序的空間結構變得雜亂松散且無序，致使蛋白質分子內部的疏水基團暴露到分子的表面，增強其疏水性[22]。同時，Na2CO3溶液使麥胚中與蛋白質結合的淀粉顆粒產生溶脹，最后脹破，使蛋白質分子釋放出來。

2.3 Alcalase酶解條件的探究

2.3.1 加酶量的影響

5份20 mL蛋白質質量分數為2.5%的麥胚溶液，經碳酸鈉處理后，在pH為9.0、溫度為50 ℃、堿性蛋白酶加酶量分別為2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g條件下酶解2.0 h的實驗結果見圖2。

由圖2可知，隨著Alcalase加酶量的增加，TCA-PSI、DH與ADH激活率均呈先增加后減少的趨勢，且三者均在加酶量為[E]/[S]為4 000 U/g時達到最大值?？梢?，Alcalase添加量對TCA-PSI、DH與ADH激活率的影響較大。

圖2 加酶量對堿性蛋白酶酶解的影響

當[E]/[S]在2 000～4 000 U/g時，隨著加酶量的增加，蛋白質被分解為小分子肽，因此TCA-PSI、DH與ADH激活率均逐漸增加；當加酶量[E]/[S]大于4 000 U/g時，體系反應的初速度不斷增大，這使得一部分大分子蛋白在較短時間內被降解成為多肽，而后其與蛋白質形成競爭關系，進而形成氨基酸，抑制酶解進程，從而導致TCA-PSI、DH與ADH激活率水平出現下降趨勢。因而Alcalase加酶量應控制在4 000 U/g以內。

2.3.2 酶解時間的影響

5份20 mL蛋白質質量分數為2.5%的麥胚溶液，經碳酸鈉處理后，在pH為9.0、溫度為50 ℃、按堿性蛋白酶加酶量為4 000 U/g條件下，酶解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，所得實驗結果見圖3。

圖3 酶解時間對堿性蛋白酶酶解的影響

由圖3可知，Alcalase的酶解過程中，當酶解時間低于2.0 h時，TCA-PSI、DH與ADH激活率和酶解時間呈正相關，1.5～2.0 h期間酶解速率達到最大值；2.0 h之后，TCA-PSI、DH、ADH激活率均出現不同程度的下降。分析原因可能是隨著時間的延長，原料中的淀粉顆粒溶脹，包埋了部分蛋白質和已降解的多肽，使底物暴露的可降解作用位點減少所致。因此確定最佳水解時間在2.0 h。

2.3.3 蛋白質濃度的影響

圖4為5份20 mL蛋白質質量分數分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的麥胚溶液，經碳酸鈉預處理后，在pH為9.0、溫度為50 ℃、堿性蛋白酶加酶量[E]/[S]為4 000 U/g條件下酶解2 h的實驗結果。

圖4 底物濃度對堿性蛋白酶酶解的影響

由圖4可以看出，隨著蛋白質濃度的增加，水解度也呈逐漸增加的趨勢，其中，當蛋白質質量分數為2.5%～3.0%時，出現了增速減緩的趨勢，3.0%水平的水解度僅僅比前一個水平增加了3.66%。但蛋白質質量分數增加至3.5%后，水解度劇增，達到了75.83%。肽得率則呈現出不一樣的趨勢，在蛋白質質量分數為1.5%～3.0%的范圍內，肽得率隨著濃度的增加而增加，當質量分數大于3.0%時，肽得率出現下降趨勢，且低于總體的平均值。而ADH激活率在蛋白質質量分數為2.5%時達到最大值，在1.5%～2.5%范圍劇增，在3.0%～3.5%范圍內劇降，但當質量分數為3.0%時仍高于平均值。

由結果可推斷，過低的蛋白濃度會降低其與蛋白酶的觸碰機會，不利于酶解反應的進行[23]。故在低濃度范圍內，隨著底物蛋白濃度的升高，有利于酶解的進行，TCA-PSI、DH與ADH激活率會呈上升趨勢；當蛋白質濃度繼續(xù)增大時，酶解過程中生成的多肽與蛋白質競爭蛋白酶的作用位點，參與酶解反應，進而被水解為寡肽或氨基酸，所以TCA-PSI在底物質量分數超過3.0%時會出現減少趨勢，同時，ADH激活率下降，可推斷具有較強醒酒活性的多肽其氨基酸構成較多，而非寡肽或氨基酸。綜合考慮，后期實驗控制蛋白質質量分數為3.0%較佳。

2.4 Neultral酶解條件的探究

2.4.1 加酶量的影響

5份20 mL蛋白質質量分數為3.0%的麥胚溶液，經碳酸鈉處理后，在溫度為50 ℃、pH為9.0、按Alcalase加酶量為4 000 U/g條件下，酶解2.0 h后，95 ℃下滅酶10 min。按Neutral加酶量分別為500、700、900、1 100、1 300 U/g，酶解時間為2.0 h的實驗結果如圖5所示。

圖5 加酶量對雙酶酶解的影響

由圖5可知，隨著中性蛋白酶酶用量的增加，TCA-PSI與DH呈現同增同減的趨勢，ADH激活率在1 400～1 800 U/g范圍內與前兩者增減趨勢略有不同。當加酶量[E]/[S]增加至1 000 U/g時，三者均達到最大值。當酶用量[E]/[S]在200～1 000 U/g范圍內時，TCA-PSI逐漸增加，此時大分子蛋白質被分解為小分子肽并隨酶用量的增加，酸溶性肽含量增加；同時，DH也呈上升趨勢，中性蛋白酶與堿性蛋白酶協(xié)同作用下，小分子肽被進一步水解為游離氨基酸，因而DH增加。當TCA-PSI與DH增加至一定程度后，對中性蛋白酶的酶解作用產生了一定的抑制作用，因而當加酶量[E]/[S]高于1 000 U/g時，TCA-PSI、DH逐漸降低，降幅較大。綜合考慮經濟成本與實驗效果，選擇Neutral酶解實驗加酶量[E]/[S]為1 000 U/g。

結合圖5與圖2分析可知，與Alcalase單酶酶解實驗相比，雙酶酶解產物的DH與TCA-PSI總體高于單酶酶解產物，其中DH平均值高出9.88%，TCA-PSI則高出11.17%，可見雙酶酶解工藝比單酶酶解的效果更優(yōu)。

2.4.2 酶解時間的影響

5份20 mL蛋白質質量分數為3%的麥胚溶液，經碳酸鈉預處理后，在溫度為50 ℃、pH為9.0、按Alcalase加酶量為4 000 U/g條件下，酶解2.0 h后，95 ℃下滅酶10 min。按Neutral加酶量為900 U/g，酶解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后，所得實驗結果如圖6所示。

圖6 酶解時間對雙酶酶解的影響

由圖6可知，酶解時間為0.5 h時，TCA-PSI、DH與ADH激活率均為最低值，且均低于平均值，在0.5～1.0 h這段時間內，反應速率最高，三者數值均增加，且DH的增幅較大。1.0 h時TCA-PSI、DH與ADH激活率分別增加了3.02%、5.94%、16.86%。1.5～2.5 h時間內，TCA-PSI、DH與ADH激活率的變化幅度較小，整體趨于平穩(wěn)。其中，DH與TCA-PSI的峰值出現在1.5 h處，此時肽得率達到81.28%，水解度達到68.52%。這可能是因為蛋白質中與酶接觸的機率大幅下降以及可供酶切的位點大幅減少。此外，水解反應產生的大量酶解物也有可能抑制Alcalase與Neutral的作用[23]。故應選擇1.5 h為Neutral最佳酶解時間。

結合圖6與圖3分析可知，雙酶酶解實驗的TCA-PSI與DH均比單酶酶解實驗的高出將近1倍，其中TCA-PSI、DH的平均值分別增加21.46%、24.07%。

2.5 正交實驗

Alcalase與Neutral雙酶復合酶解麥胚蛋白工藝優(yōu)于Alcalase單酶酶解工藝。且Neutral酶解工藝最優(yōu)條件為：蛋白質質量分數3.0%、溫度50 ℃、pH 7.0、加酶量[E]/[S]為1 000 U/g、時間1.5 h。

綜合Alcalase添加量、酶解時間、底物濃度(麥胚蛋白濃度)及Neutral添加量、酶解時間等對麥胚蛋白酶解及對ADH激活率的影響，可見Alcalase與Neutral雙酶酶解工藝優(yōu)于Alcalase單酶酶解，為獲取最佳的酶解工藝條件，選取底物濃度、Alcalase加酶量、Neutral加酶量這3個影響顯著、變化呈一定趨勢的因素，以麥胚蛋白的水解度、肽得率及ADH激活率為指標，進行正交實驗以確定最佳酶解工藝條件。正交實驗的因素水平以及結果分別見表1、表2。

表1 正交實驗設計的因素及水平

表2 正交實驗設計方案及結果

表2結果表明：影響水解度(DH)、肽得率(TCA-PSI)和ADH激活率的因素主次順序均為：A>C>B(Alcalase加酶量)。對于因素A，三項指標的檢測情況均為k3>k2>k1,故可得出最佳蛋白質質量分數為3.5%；對于因素B，水解度與肽得率兩項指標的檢測情況均為k3>k1>k2，而ADH激活率的檢測情況為k1>k3>k2，考慮到ADH激活率的R值為三者中最小，故確定最佳Alcalase添加量為4 000 U/g；對于因素C，水解度與ADH激活率的檢測情況均為k3>k2>k1,而肽得率的檢測情況為k2>k3>k1，考慮到肽得率的R值為三者中最大，并且鑒于經濟成本以及節(jié)約原料原則，故確定最佳Neutral添加量為1 000 U/g。

所以最優(yōu)工藝條件為A3B3C2，即蛋白質質量分數為3.5%，Alcalase添加量為4 000 U/g，Neutral添加量為1 000 U/g。經實驗得此條件下酶解產物的TCA-PSI、DH、ADH激活率分別為75.49%、65.18%、68.37%。

3 結論

3.1 采用Neutral與Alcalase分步酶解麥胚蛋白的水解度(DH)、肽得率(TCA-PSI)和ADH激活率均有所提升，因此采用雙酶水解麥胚蛋白的效果優(yōu)于Alcalase單酶酶解工藝。

3.2 Alcalase與Neutral雙酶酶解麥胚蛋白的最優(yōu)工藝條件為：麥胚蛋白質質量分數[S]為3.5%，Alcalase添加量[E]/[S]為4 000 U/g，Neutral添加量[E]/[S]為1 000 U/g。在此條件下酶解產物的TCA-PSI、DH、ADH激活率分別為75.49%、65.18%、68.37%。表明Alcalase與Neutral雙酶酶解麥胚蛋白肽得率高，體外醒酒活性好。

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