微乳體系中脂肪酶催化棕櫚酸制備 生物柴油及其工藝優(yōu)化

朱廣琪 李芳浩 劉 妍 王彩娜 談忠琴 韓曉祥

(浙江工商大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，杭州 310018)

生物柴油是一種新型的可再生綠色能源，它具有閃點(diǎn)高、抗爆性好、燃燒性能優(yōu)良、能有效降低SOx，NOx等有害溫室氣體排放量等優(yōu)點(diǎn)。生物柴油是一種高級(jí)脂肪酸酯類化合物，可以通過(guò)動(dòng)植物油脂、餐飲廢油等為原料與低級(jí)醇經(jīng)過(guò)酯交換或酯化反應(yīng)制備得到。在傳統(tǒng)制備工藝中，常采用濃硫酸作為催化劑。濃硫酸催化時(shí)雖有較高催化活性，但存在易發(fā)生副反應(yīng)，產(chǎn)品不易提純，設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)，工藝路線不符合當(dāng)今社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的要求。采用固體酸、金屬鹽類、離子液體等催化劑[1-5]，雖然在一定程度上解決了傳統(tǒng)催化劑存在的一些缺點(diǎn)，但它們?nèi)源嬖谙鄬?duì)活性低、表面易積碳、酸中心分布不均、再生困難等缺陷，從而限制了它們的應(yīng)用。

微乳體系是指由油、水、表面活性劑和助劑按照一定比例自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定的、外觀透明或半透明的高度分散體系，具有超低的界面張力，穩(wěn)定的熱力學(xué)特性且價(jià)格低廉，廣泛用于聚合反應(yīng)、酶催化反應(yīng)、分離及納米材料制備等領(lǐng)域[6-13]。脂肪酶作為一種生物催化劑，在催化反應(yīng)中常具有很高的立體選擇性和區(qū)域選擇性，微乳體系中進(jìn)行脂肪酶催化反應(yīng)已有文獻(xiàn)報(bào)道，微乳體系為脂肪酶提供了適宜的作用環(huán)境，從而使脂肪酶顯現(xiàn)出較好的催化性能[14-19]。離子液體，主要由含氮元素的有機(jī)陽(yáng)離子與無(wú)機(jī)陰離子形成的，在室溫下呈液態(tài)的離子化合物。離子液體不僅可以作為催化劑，還能作為綠色溶劑廣泛的應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[20]。近年來(lái)，通過(guò)離子液體構(gòu)建離子液體微乳液備受關(guān)注，離子液體微乳液作為一種新型體系，同時(shí)具備了離子液體和微乳液二者的優(yōu)點(diǎn)，在納米材料的制備，蛋白質(zhì)萃取分離，醫(yī)藥及化工領(lǐng)域已經(jīng)得到了應(yīng)用[21-23]。

本試驗(yàn)以棕櫚酸為模型反應(yīng)原料，DBSA+TX-100/環(huán)己烷/BmimBF4離子液體微乳體系為反應(yīng)介質(zhì)，考察了醇酸摩爾比、脂肪酶用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)Candidarugosa脂肪酶催化合成棕櫚酸乙酯產(chǎn)率的影響，并采用響應(yīng)面分析法對(duì)該合成反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為生物柴油的綠色制備和高酸值餐飲廢油脂的清潔利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

十二烷基苯磺酸(DBSA)：日本Tokyo Kasei Kogyo有限公司；Candidarugosa脂肪酶：Sigma-Aldrich公司；曲拉通(TX-100)：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(BmimBF4)：阿拉丁試劑公司；環(huán)己烷、棕櫚酸、乙醇、氫氧化鈉、酚酞及其他試劑：邁瑞化學(xué)試劑公司，皆為分析純。

GC7890B氣相色譜儀，安捷倫公司；GL-3250A磁力攪拌器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；DZF-6050真空干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微乳體系的制備

稱取一定質(zhì)量的DBSA+TX-100與環(huán)己烷混合于小燒杯中，在磁力攪拌的作用下，攪拌均勻后向體系中滴加BmimBF4，直至溶液由澄清變渾濁或者由渾濁變澄清，變化臨界點(diǎn)即為相變點(diǎn)。根據(jù)三組分中各質(zhì)量得到溶液的組成分?jǐn)?shù)，整理數(shù)據(jù)，采用 Origin 8.5 繪制三元相圖。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在30 ℃環(huán)境下進(jìn)行。

根據(jù)所繪制的三相圖，在微乳區(qū)中任取幾個(gè)特殊點(diǎn)，根據(jù)各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)算出每個(gè)組分的質(zhì)量，配成微乳體系。在相同的反應(yīng)條件下進(jìn)行棕櫚酸乙酯的合成。酯化反應(yīng)結(jié)束后，用氣相色譜法檢測(cè)棕櫚酸的轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而確定微乳區(qū)的最大反應(yīng)點(diǎn)，并將此最大反應(yīng)點(diǎn)作為研究棕櫚酸酯化反應(yīng)單因素影響的反應(yīng)點(diǎn)。

1.2.2 微乳體系中棕櫚酸乙酯的合成

在圓底燒瓶中分別加入形成微乳體系的3種組分，磁力攪拌30 min，形成均勻澄清透明的微乳體系。向微乳體系中加入棕櫚酸、乙醇及脂肪酶，在水浴條件下進(jìn)行酯化反應(yīng)。酯化產(chǎn)物在Agilent 7890B氣相色譜儀上進(jìn)行定量分析，F(xiàn)ID檢測(cè)器，HP-5毛細(xì)管柱，月桂酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子液體微乳中脂肪酶催化酯化反應(yīng)

離子液體微乳體系的形成對(duì)酯化反應(yīng)有著重要的影響，實(shí)驗(yàn)研究了DBSA，TX-100等表面活性劑對(duì)BmimBF4/環(huán)己烷形成微乳液的影響。研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)DBSA與離子液體不能形成微乳體系，而單獨(dú)的TX-100可以與離子液體形成微乳體系，當(dāng)DBSA與TX-100形成復(fù)配表面活性劑同樣可以與BmimBF4及環(huán)己烷形成微乳體系。微乳體系三相圖如圖1所示，由圖1可見(jiàn)，表面活性劑對(duì)該離子液體微乳液的形成有重要作用，當(dāng)表面活性劑的比例較小時(shí)，通常不能形成微乳液，隨著表面活性劑所用比例的增加，微乳區(qū)逐漸擴(kuò)大，并且也越穩(wěn)定。

圖1 微乳體系三相圖

在三相圖的微乳區(qū)中尋找不同離子液體含量的點(diǎn)，根據(jù)不同點(diǎn)三組分的比率，配制離子液體微乳體系，考察離子液體含量對(duì)脂肪酶催化合成棕櫚酸乙酯的影響。離子液體含量是影響微乳體系中脂肪酶活性的一個(gè)重要因素，離子液體用量對(duì)微乳體系中脂肪酶催化酯化反應(yīng)的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著微乳體系中離子液體含量的增加，棕櫚酸乙酯的產(chǎn)率逐漸增長(zhǎng)，當(dāng)體系中離子液體含量達(dá)到30%時(shí)，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率出現(xiàn)了一個(gè)峰值。隨后，繼續(xù)增加離子液體用量，棕櫚酸乙酯的產(chǎn)率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。一般來(lái)說(shuō)，微乳體系中，酯化反應(yīng)發(fā)生在相界面處，相界面處的面積越大，底物分子間的接觸越充分，從而反應(yīng)速度加快，提高反應(yīng)產(chǎn)率。隨著離子液體用量的增加，界面增加，反應(yīng)過(guò)程中生成的水不僅提高酶的活力，也可參與微乳體系的形成，從而進(jìn)一步促進(jìn)反應(yīng)平衡向右移動(dòng)，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率增加。離子液體的過(guò)多存在可能會(huì)影響脂肪酶的活性，從而導(dǎo)致酯化反應(yīng)活性降低，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率降低，因此，試驗(yàn)中選擇離子液體用量為30%。

圖2 離子液體用量對(duì)微乳體系中脂肪酶催化酯化反應(yīng)的影響

2.2 反應(yīng)條件對(duì)脂肪酶催化合成棕櫚酸乙酯的影響

酯化反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，常通過(guò)增加反應(yīng)物的量來(lái)提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，不同反應(yīng)條件對(duì)離子液體微乳體系中脂肪酶催化酯化反應(yīng)的影響如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，當(dāng)離子液體用量為30%，脂肪酶濃度為12%，反應(yīng)時(shí)間為3.0 h時(shí)，不同醇酸摩爾比對(duì)棕櫚酸酯化反應(yīng)的影響較大。在所考察的范圍內(nèi)，隨著乙醇用量的增加，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率逐漸上升，當(dāng)醇酸摩爾比為6∶1時(shí)，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率最高為95.8%，進(jìn)一步增加乙醇用量，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率下降。這是因?yàn)樵黾右掖嫉臐舛?，即增加了反?yīng)物的濃度，有利于反應(yīng)向酯化反應(yīng)方向進(jìn)行。但是隨著醇酸摩爾比進(jìn)一步增加，反應(yīng)體系中過(guò)高的乙醇濃度對(duì)脂肪酶活性有抑制作用，同時(shí)反應(yīng)體系體積增大，催化劑濃度變稀，反應(yīng)速度變慢，棕櫚酸轉(zhuǎn)化率下降。因此，醇酸摩爾比選為6∶1。

酶濃度的增加有利于反應(yīng)速率增加，但是過(guò)量的酶也會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生不利影響，本試驗(yàn)在研究脂肪酶用量對(duì)棕櫚酸酯化反應(yīng)的影響時(shí)，獲得了脂肪酶用量適宜值，具體結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖可見(jiàn)，無(wú)脂肪酶存在時(shí)，該微乳體系中進(jìn)行酯化反應(yīng)具有一定的催化活性，而在TX-100/環(huán)己烷/BmimBF4微乳體系中進(jìn)行催化酯化制備棕櫚酸乙酯時(shí)，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率小于5%，由此說(shuō)明微乳體系中DBSA不僅與TX-100結(jié)合作為表面活性劑與環(huán)己烷、離子液體形成微乳體系，還可作為Br?nsted酸催化酯化反應(yīng)。有脂肪酶存在時(shí)，催化酯化反應(yīng)活性進(jìn)一步增加，且棕櫚酸轉(zhuǎn)化率隨著脂肪酶用量的增加而增加，當(dāng)脂肪酶用量為12%時(shí)，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率達(dá)到最大為95.8%，進(jìn)一步增加脂肪酶用量，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率增幅不明顯。這可能是因?yàn)槊笣舛仍谝欢ǚ秶鷥?nèi)增加時(shí)，隨著酶用量的增加，使得酶分子中越來(lái)越多的活性部位與底物分子接觸[24]，從而加快反應(yīng)速度，使棕櫚酸轉(zhuǎn)化率快速增加；但當(dāng)酶的活性部位增加到一定程度時(shí)，由于蛋白質(zhì)的聚集作用而不再與底物接觸，反應(yīng)速率即幾乎不再增加，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率基本保持不變。因此選擇加酶量為12%。

溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響主要有兩個(gè)方面，提高反應(yīng)溫度，一方面可以提高反應(yīng)速率，另一方面過(guò)高的反應(yīng)溫度會(huì)使酶失活，不利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行。由圖3可見(jiàn)，隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)速率加快，棕櫚酸轉(zhuǎn)化率增加，在35 ℃時(shí)棕櫚酸乙酯的產(chǎn)率達(dá)到最大值，脂肪酶此時(shí)表現(xiàn)出最大的催化活力。進(jìn)一步升高反應(yīng)溫度，雖然有利于DBSA的酸催化作用，但酶的催化活性受到抑制，兩者相互作用的結(jié)果，使得棕櫚酸乙酯的產(chǎn)率呈下降趨勢(shì)。

通常條件下，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間有助于反應(yīng)進(jìn)行。由圖3可見(jiàn)，脂肪酶存在時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3.0 h時(shí)，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率為95.8%，進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率基本保持不變。因此反應(yīng)時(shí)間以3.0 h為宜。

圖3 不同反應(yīng)條件對(duì)離子液體微乳體系中脂肪酶催化酯化反應(yīng)的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化生物柴油制備工藝

2.3.1 分析因素的選取及分析方案

根據(jù) Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取醇酸摩爾比、脂肪酶用量、反應(yīng)溫度這三個(gè)因素，采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法確定棕櫚酸乙酯制備的最佳工藝條件，試驗(yàn)因素水平及編碼表見(jiàn)表1，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。試驗(yàn)1～12是析因試驗(yàn)，13～17是中心試驗(yàn)，中心試驗(yàn)重復(fù)5次，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼表

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

表3 二次多項(xiàng)式預(yù)測(cè)反應(yīng)回歸模型的系數(shù)及方差分析結(jié)果

注：“*”表示該項(xiàng)具有顯著性效應(yīng)；“**” 表示該項(xiàng)具有極顯著效應(yīng)。

此外，失擬項(xiàng)的F值為3.58表明失擬項(xiàng)與絕對(duì)誤差不顯著，說(shuō)明該模型能夠適用于本試驗(yàn)的大部分?jǐn)?shù)據(jù)，可以預(yù)測(cè)棕櫚酸乙酯生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)率變化及各因素對(duì)產(chǎn)率的影響。綜上所述，該模型能夠用來(lái)預(yù)測(cè)本試驗(yàn)，準(zhǔn)確可靠。以棕櫚酸乙酯產(chǎn)率為響應(yīng)值，通過(guò)RSM軟件對(duì)模型進(jìn)行多元回歸分析，回歸方程的二次項(xiàng)系數(shù)見(jiàn)表3，該二次多項(xiàng)回歸方程可擬合為：

Y=+95.84+7.44A+2.13B-3.14C-8.14A2-16.22B2-11.20C2+4.08AB-1.05AC+0.13BC

2.3.3 因素間的交互影響

因素交互作用對(duì)棕櫚酸乙酯產(chǎn)率影響的等高線和響應(yīng)曲面圖如圖4所示?？梢钥闯龈饕蛩貙?duì)棕櫚酸乙酯產(chǎn)率的影響，以及兩獨(dú)立因素間交互作用的強(qiáng)弱。

由圖4可知，當(dāng)醇酸摩爾比和脂肪酶用量均為最小值時(shí)，隨著脂肪酶用量和醇酸摩爾比增加，酯化產(chǎn)率也逐漸增加。隨后，繼續(xù)增加醇酸摩爾比，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率減小，這是因?yàn)檫^(guò)量的醇不利于酶活性表達(dá)，從而不利于棕櫚酸乙酯產(chǎn)率的提高。從圖4a和圖4d的等高線及響應(yīng)曲面圖可以看出，脂肪酶用量和醇酸摩爾比的相互作用顯著，這與表3的分析結(jié)果一致。

反應(yīng)溫度一定時(shí)，隨著脂肪酶用量的增加，棕櫚酸乙酯的產(chǎn)率持續(xù)增加，當(dāng)脂肪酶用量達(dá)13%左右產(chǎn)率最高，繼續(xù)增加脂肪酶用量，產(chǎn)率變化不大。當(dāng)脂肪酶用量保持不變時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高棕櫚酸乙酯的產(chǎn)率出現(xiàn)先逐步增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。較高的溫度不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，所以當(dāng)溫度升高時(shí)反應(yīng)產(chǎn)率呈下降趨勢(shì)。

隨著醇酸摩爾比以及反應(yīng)溫度的升高，棕櫚酸乙酯的產(chǎn)率呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，達(dá)到峰值后繼續(xù)增加任一因素，產(chǎn)率都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。從圖 4c可以看出等高線圖呈圓形[25]，說(shuō)明兩個(gè)因素間的交互作用不明顯，這也與表3分析結(jié)果一致。

2.3.4 最佳工藝條件的確定

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法得到離子液體微乳體系中脂肪酶催化酯化反應(yīng)的最佳條件是：離子液體用量30%，醇酸摩爾比6.26∶1，脂肪酶用量為棕櫚酸質(zhì)量的13.99%，體系反應(yīng)溫度是34.19 ℃，棕櫚酸乙酯的產(chǎn)率為98.09%?？紤]到實(shí)際操作的方便，將最佳反應(yīng)條件修正為離子液體用量30%，醇酸摩爾比6.3∶1，脂肪酶用量是14%，體系反應(yīng)溫度是34 ℃。在最佳條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，棕櫚酸乙酯平均產(chǎn)率為97.5%，與理論預(yù)測(cè)值基本相符。因此，該回歸模型能夠真實(shí)地反應(yīng)各因素對(duì)棕櫚酸乙酯產(chǎn)率的影響。

a

b

c

d

e

f

3 結(jié) 論

脂肪酶存在時(shí)，在DBSA+TX-100/環(huán)己烷/BmimBF4微乳體系中制備棕櫚酸乙酯具有較好的催化活性。微乳體系中DBSA一方面作為表面活性劑參與微乳體系的形成，同時(shí)作為Br?nsted酸催化酯化反應(yīng)的進(jìn)行，脂肪酶與DBSA的協(xié)同作用是使該酯化反應(yīng)獲得較高產(chǎn)率的原因。

經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化，DBSA+TX-100/環(huán)己烷/BmimBF4微乳體系中脂肪酶催化合成棕櫚酸乙酯的較佳工藝條件為：離子液體用量30%，醇酸摩爾比6.3∶1，脂肪酶用量為棕櫚酸質(zhì)量的14%，反應(yīng)溫度34 ℃，反應(yīng)時(shí)間3.0 h。在此條件下，棕櫚酸乙酯產(chǎn)率為97.5%。該結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值基本相符。

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