美托洛爾對(duì)陳舊性心肌梗死大鼠心臟Cx43與p-Cx43表達(dá)的影響

王鴻超 盧 煒 張少娟 謝亞囡 李 芳 劉金明

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)是一種內(nèi)科常見臨床綜合征，常表現(xiàn)為心力衰竭、心律失常、心源性休克及猝死現(xiàn)象。隨著溶栓和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)等治療措施的廣泛實(shí)施，心肌梗死的即刻死亡率顯著下降，然而心力衰竭的發(fā)生率和遠(yuǎn)期死亡的風(fēng)險(xiǎn)并未改變。同時(shí)，陳舊性心肌梗死(OMI)患者也就越來越多，其并發(fā)的心力衰竭或心律失常是臨床最常見的死亡原因之一〔1〕。由縫隙連接蛋白(Cx)家族組成的縫隙連接通道在心肌細(xì)胞之間的耦合在心臟電沖動(dòng)傳導(dǎo)中具有重要作用，其中Cx43是重要成員之一，其表達(dá)水平及其磷酸化狀態(tài)(p-Cx43)被證實(shí)與心電生理重構(gòu)和心律失常的發(fā)生密切相關(guān)〔2〕。美托洛爾是一種親脂性β1-受體阻滯劑藥物，可顯著抑制腎上腺素能受體與交感神經(jīng)傳出，其預(yù)防心肌梗死后心律失常的作用已得到證實(shí)〔3〕。本研究探討在不同美托洛爾干預(yù)劑量下，對(duì)OMI大鼠心臟Cx43與p-Cx43表達(dá)水平的影響，旨在探討美托洛爾預(yù)防心律失常的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)Wistar大鼠80只，體重190～230 g，平均(210±15)g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。采用隨機(jī)數(shù)字表法將Wistar大鼠分為假手術(shù)組、心肌梗死組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組，每組20只。

1.2主要試劑與儀器 RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)；全蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(康肽生物科技北京有限公司)；Western 一抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)研究所)；Western 二抗稀釋液(碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗鼠Cx43單克隆抗體(美國Epitomics公司)；β-actin一抗(Santa Cruz公司)；乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)檢測(cè)試劑盒(上海銘博生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純國產(chǎn)試劑。RT-PCR儀(美國BIO-RAD公司)，電生理刺激儀(蘇州市東方電子儀器廠)，酶標(biāo)儀(上海安亭科學(xué)儀器廠)，雙垂直蛋白電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3心肌梗死模型的構(gòu)建 手術(shù)前12 h禁食不禁水，麻醉(10%水合氯醛)，大鼠取仰臥位，連接多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，行心電圖監(jiān)測(cè)。于頸部正中切開氣管連接動(dòng)物人工呼吸機(jī)。備皮、碘胺酮消毒鋪巾，在胸骨左緣捫和心臟搏動(dòng)處剪開皮膚，于胸骨左緣3、4肋處切開胸廓，剪開心包。于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳下緣間距主動(dòng)脈根部約3 mm處，用眼科無創(chuàng)縫合針結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支深部，觀察心電圖動(dòng)態(tài)變化，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為肢體導(dǎo)聯(lián)發(fā)生ST段弓背向上抬高0.2 mV以上且持續(xù)超過30 min。術(shù)后縫合皮膚，肌肉注射青霉素80萬單位2～3 d。心肌梗死組、實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組構(gòu)建心肌梗死模型；假手術(shù)組不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，其余操作相同。

1.4給藥 實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組分別于建模成功24 h后以灌胃酒石酸美托洛爾(廣州白云山天心制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20030018)10.0 mg/kg和15 mg/kg。假手術(shù)組和心肌梗死組灌胃等量蒸餾水，每天灌胃1次，連續(xù)30 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1血清心肌壞死標(biāo)志物 術(shù)后6 h，取假手術(shù)組和心肌梗死組各動(dòng)脈血2 ml，離心提取上清后，于全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH和CK水平。

1.5.2心室顫動(dòng)閾值檢測(cè) 術(shù)后30 d，取所有組別大鼠，開胸暴露心臟，于前室間溝心尖部位，刺入雙極起搏電極2 mm，采用電生理刺激儀施加起搏脈寬10 ms、電壓5 V的S1S1分級(jí)遞增刺激。心室顫動(dòng)閾值定義為引發(fā)心室顫動(dòng)并且致死的最低刺激頻率。

1.5.3Western印跡檢測(cè)心肌組織Cx43和p-Cx43蛋白表達(dá)水平 取完成心室顫動(dòng)閾值檢測(cè)的大鼠完整心臟，剪刀切碎，用預(yù)冷的組織裂解液提取大鼠心肌組織總蛋白，Bradford法測(cè)定樣品的蛋白含量，12%的凝膠分離蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)膜儀(濕轉(zhuǎn))在100 V 1.5 h的條件下將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后與稀釋的Cx43和p-Cx43單克隆抗體(1∶1 000)過夜結(jié)合，洗模后加入稀釋的二抗，室溫孵育60 min，BeyoECL Plus顯色，凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)收集顯色條帶，運(yùn)用 Quantity One 軟件進(jìn)行蛋白條帶數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠心肌梗死模型的建立 建模30 d后，假手術(shù)組大鼠心肌組織形態(tài)正常，心肌梗死組大鼠心肌細(xì)胞凝固性壞死，形成紅染，核固縮(見圖1)。心肌梗死組血清LDH和CK水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，見表1。

圖1 建模30 d后兩組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變(×200)

表1 兩組心肌組織LDH和CK水平

2.2心室顫動(dòng)閾值 心肌梗死組〔(319.63±89.56)次/min〕、實(shí)驗(yàn)1組〔(378.89±92.35)次/min〕和實(shí)驗(yàn)2組〔(410.32±102.57)次/min〕大鼠心室顫動(dòng)閾值均顯著低于假手術(shù)組〔(526.78±135.15)次/min〕(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組大鼠心室顫動(dòng)閾值均顯著高于心肌梗死組(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)2組顯著高于實(shí)驗(yàn)1組(P<0.05)。

2.3心肌組織Cx43和p-Cx43蛋白表達(dá)水平 心肌梗死組大鼠心肌組織p-Cx43和P-Cx43/Cx43顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組大鼠心肌組織p-Cx43和P-Cx43/Cx43顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組大鼠心肌組織p-Cx43和Cx43/p-Cx4均顯著高于心肌梗死組(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)2組顯著高于實(shí)驗(yàn)1組(P<0.05)。各組大鼠心肌組織Cx43蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織Cx43和p-Cx43蛋白表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與心肌梗死組比較：2)P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較：3)P<0.05

3 討 論

心臟縫隙連接(GJ)具有低選擇性、低電阻和親水性的特點(diǎn)，是心肌細(xì)胞化學(xué)信息傳遞、電耦聯(lián)和化學(xué)耦聯(lián)的基礎(chǔ)，主要由縫隙連接蛋白組成，分為Cx40、Cx43和Cx45三種形式，其中心室肌主要表達(dá)Cx43〔4，5〕。當(dāng)發(fā)生心肌缺血-再灌注、心力衰竭或糖尿病等時(shí)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞縫隙連接發(fā)生重塑?，F(xiàn)已證明，Cx43是心肌細(xì)胞和心室肌細(xì)胞之間的主要連接蛋白，其表達(dá)水平與心室內(nèi)的傳導(dǎo)速度密切相關(guān)〔6，7〕。本研究結(jié)果顯示，心肌梗死后大鼠心室顫動(dòng)閾值降低。經(jīng)Western印跡檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，心肌梗死后Cx43表達(dá)水平無明顯差異，而其磷酸化狀態(tài)p-Cx43表達(dá)下調(diào)。心肌細(xì)胞中GJ連接蛋白之間的通道特性和聚集與連接蛋白的磷酸化狀態(tài)緊密相關(guān)。有研究顯示，Cx43的去磷酸化可影響細(xì)胞之間電耦聯(lián)，導(dǎo)致傳導(dǎo)異常和折返性心律異常的發(fā)生，這與細(xì)胞內(nèi)部的ATP水解存在一定相關(guān)性〔8〕。因此，p-Cx43參與縫隙連接通訊功能的調(diào)節(jié)過程，包括縫隙連接蛋白的組裝、運(yùn)輸、降解、分解、低聚反應(yīng)和門控功能等，從而影響正常由Cx43介導(dǎo)的細(xì)胞縫隙連接通訊功能〔9〕。心肌梗死后Cx43的去磷酸化被證實(shí)是導(dǎo)致心電傳導(dǎo)速率下降、心電生理重構(gòu)和形成折返性心律失常的原因之一〔10〕。本研究表明美托洛爾可顯著提高心肌梗死大鼠心室顫動(dòng)閾值，這可能與p-Cx43蛋白表達(dá)水平提高相關(guān)。既往研究顯示，美托洛爾不但可抑制房室結(jié)的傳輸，延長房室傳導(dǎo)時(shí)間，而且能夠提高膜的穩(wěn)定性〔11〕。臨床上，美托洛爾常被用于預(yù)防心肌梗死后心律失常的發(fā)生。作為一種β1受體阻滯劑，本研究證實(shí)美托洛爾可能參與了Cx43的磷酸化過程，提高了p-Cx43蛋白表達(dá)水平，且呈劑量依賴性。p-Cx43蛋白表達(dá)水平的提高從而有助于逆轉(zhuǎn)心肌缺血介導(dǎo)的心電傳導(dǎo)異?！?2，13〕。

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