整合素連接激酶在大鼠燒傷創(chuàng)面中的表達及對創(chuàng)面愈合的影響

姜 海 劉 宇 徐 剛

(唐山市工人醫(yī)院燒傷整形二科，河北 唐山 063000)

創(chuàng)面是指在熱力、外力、低溫、電流、化學(xué)物質(zhì)、手術(shù)等外界致傷因子以及局部血液供應(yīng)障礙等機體內(nèi)在因素的作用下引起正常皮膚組織的丟失或出現(xiàn)皮膚完整性的中斷，并伴有皮膚功能損傷。皮膚受傷后發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)，真皮組織細胞分泌纖維連接蛋白和膠原等進行真皮組織重建和上皮組織再生〔1〕。整合素連接激酶(ILK)是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的一種，激活的ILK參與生長因子和整合素信號通路，對細胞凋亡、細胞遷移、細胞增生等多種細胞功能有調(diào)節(jié)作用，可以介導(dǎo)細胞外基質(zhì)和細胞的相互作用〔2,3〕。研究發(fā)現(xiàn)ILK在心肌、肝臟、皮膚、神經(jīng)纖維等組織器官損傷后的修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用〔4,5〕。本文通過分析燒傷大鼠創(chuàng)面中ILK的表達水平及大鼠燒傷創(chuàng)面轉(zhuǎn)染ILK過表達慢病毒后對創(chuàng)傷愈合的影響，探討ILK在燒傷創(chuàng)面愈合中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 Wistar大鼠購自首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、SP試劑盒、兔抗鼠ILK單克隆抗體(美國Sigma公司)，重組慢病毒載體(包含重組綠色熒光蛋白編碼基因和大鼠型ILK的cDNA片段)和不含ILK基因片段的空載慢病毒(上海吉凱基因公司構(gòu)建)等。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠皮膚燒傷模型建立 將Wistar大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉成功后固定在燙傷儀上，將背部皮毛剔除，消毒背部皮膚，將80℃圓柱形燙頭垂直接觸Wistar大鼠背部兩側(cè)對稱皮膚致傷8 s建立大鼠燒傷模型；對照組大鼠不做任何處理。術(shù)后觀察創(chuàng)面的愈合情況。

1.2.2大鼠燒傷創(chuàng)面愈合過程中ILK表達測定 分別在燒傷后1、2、3 w隨機取7只燒傷模型大鼠，切取背部全層創(chuàng)面皮膚，對照組切取背部正常皮膚，用甲醛固定，石蠟包埋，切厚5 μm的切片，進行SP法免疫組化染色，以兔抗鼠ILK單克隆抗體為一抗，陰性對照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，具體步驟按照試劑盒說明書進行。結(jié)果分析，每個標(biāo)本取7張切片，每張切片取7個高倍視野，采用Axio Vision顯微圖像采集系統(tǒng)拍攝圖片，采用Image-Proplus圖像分析軟件計算每個視野陽性表達的光密度值(平均光密度值=視野陽性表達積分光密度值/視野總面積)，蛋白表達強度和平均光密度值呈正比，平均光密度值越高蛋白水平越高。

1.2.3ILK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞 取生長良好的293T細胞用胰蛋白酶進行消化，制成細胞懸液接種到24孔板上放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至細胞達85%融合時進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染步驟按照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，并檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率。

1.2.4大鼠的分組和處理 取燒傷大鼠隨機分為ILK轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組，ILK轉(zhuǎn)染組大鼠在燒傷后第2天于創(chuàng)面周圍及基底注射ILK過表達慢病毒液100 μl；陰性對照組大鼠在燒傷后第2天于創(chuàng)面周圍及基底注射空質(zhì)粒慢病毒液100 μl；空白對照組大鼠于燒傷后第2天于創(chuàng)面周圍及基底注射等量生理鹽水。

1.2.5慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠后組織綠色熒光檢測 燒傷后2 w，分別取ILK轉(zhuǎn)染組、陰性對照組大鼠各7只，處死后取相同部位背部創(chuàng)面皮膚，苦味酸標(biāo)記處將創(chuàng)面組織切為厚10 μmol/L的切片，470 nm綠色激光下對創(chuàng)面組織的綠色熒光進行檢測。

1.2.6慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠后ILK表達的檢測 分別取ILK轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組大鼠各21只，分別于燒傷后1、2、3 w每組各處死7只大鼠，取背部創(chuàng)面組織，采用免疫組化法測定組織ILK蛋白的平均光密度值，方法同上。

1.2.7ILK對大鼠燒傷創(chuàng)面愈合時間和愈合率的影響 分別取ILK轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組大鼠各7只觀察大鼠燒傷創(chuàng)面愈合時間和愈合率的影響，在燒傷后第1、2、3周對創(chuàng)面進行拍照，記錄創(chuàng)面愈合時間，采用Image J軟件分析各組大鼠創(chuàng)面面積，計算各組大鼠的創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率=(1-殘余創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，多組均數(shù)比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1燒傷創(chuàng)面愈合情況 燒傷后第3天創(chuàng)面開始收縮，1 w時壞死組織脫離，2 w時形成大量皮島，3 w時創(chuàng)面基本痊愈，所有大鼠創(chuàng)面愈合過程平穩(wěn)，未見感染征象。

2.2大鼠燒傷創(chuàng)面愈合過程中ILK的表達情況 燒傷組燒傷后1 w(0.046±0.014)和2 w(0.057±0.020)燒傷創(chuàng)面ILK的光密度值高于對照組(0.012±0.003)(P<0.05)，燒傷后3 w(0.014±0.007)燒傷創(chuàng)面ILK光密度值和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3ILK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞結(jié)果鑒定 目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后24 h可以觀察到綠色熒光蛋白表達，轉(zhuǎn)染率為86.6%，表明ILK基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

圖1 ILK基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞(×100)

2.4慢病毒活體轉(zhuǎn)染后的表達情況 熒光顯微鏡下見創(chuàng)面冰凍切片中有綠色熒光蛋白表達，綠色熒光蛋白主要在皮膚基底層表達，部分毛囊中也可見綠色熒光蛋白表達。見圖2。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后創(chuàng)面熒光情況(×10)

2.5慢病毒轉(zhuǎn)染后各組大鼠創(chuàng)面組織ILK光密度值比較 燒傷后1、2 w，ILK轉(zhuǎn)染組創(chuàng)面組織ILK光密度值高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)；燒傷后3 w，三組創(chuàng)面組織ILK光密度值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組大鼠創(chuàng)面組織ILK光密度值比較

與ILK轉(zhuǎn)染組比較:1)P<0.05

2.6ILK轉(zhuǎn)染后各組大鼠創(chuàng)面愈合率和愈合時間比較 燒傷后1、2 w，ILK轉(zhuǎn)染組創(chuàng)面愈合率高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)；燒傷后3 w，三組創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ILK轉(zhuǎn)染組創(chuàng)面愈合時間〔(14.54±0.34)d〕短于空白對照組〔(17.98±0.46)d〕和陰性對照組〔(18.24±0.51)d〕(F=223.454，P<0.05)。見表2。

表2 ILK轉(zhuǎn)染后各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較

與ILK轉(zhuǎn)染組比較:1)P<0.05

3 討 論

創(chuàng)面的愈合實質(zhì)為受損組織完整性的重建，創(chuàng)面愈合包括炎性反應(yīng)期、肉芽組織增殖期和細胞外基質(zhì)重塑期，炎性反應(yīng)期主要表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)的釋放和血管收縮；肉芽組織增殖期主要為血管生成、表皮細胞再生、纖維組織增生、纖維蛋白凝固；細胞外基質(zhì)重塑期主要為皮膚組織彈性和抗拉強度的再形成和恢復(fù)〔6,7〕。整合素在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮重要作用，其介導(dǎo)的信號通路對細胞周期、細胞增殖、細胞分化、細胞死亡等具有調(diào)控作用〔8〕；ILK在整合素介導(dǎo)的信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，在生長因子信號通路中，ILK也發(fā)揮重要作用，整合素和生長因子受體胞內(nèi)信號通路胞內(nèi)結(jié)構(gòu)可以激活I(lǐng)LK，ILK被激活后通過多種途徑發(fā)揮激酶活性，參與細胞的調(diào)控〔9,10〕。ILK在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、組織纖維化、組織損傷后修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用〔11,12〕。

ILK對細胞凋亡有抑制作用，其對細胞凋亡的抑制作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用〔13〕，創(chuàng)面的愈合需要細胞的大量增殖，促進細胞增殖可以促進創(chuàng)面的愈合。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ILK在燒傷創(chuàng)面的愈合中發(fā)揮一定作用，ILK水平升高有利于促進燒傷創(chuàng)面的愈合。創(chuàng)面的修復(fù)包括真皮重構(gòu)和表皮再生，真皮重構(gòu)需要纖維細胞大量增生，纖維細胞分泌膠原等細胞外基質(zhì)，從而完成真皮的重建；表皮再生過程中，汗腺、毛囊、基底層等處表皮干細胞首先出現(xiàn)增生，然后分化為表皮細胞，從而完成表皮的再生過程。ILK可能通過整合素信號通路調(diào)節(jié)燒傷創(chuàng)面細胞的增生，并在細胞外基質(zhì)和細胞的相互作用中發(fā)揮作用，ILK表達水平升高促進細胞增殖、生長和分化，促進血管新生，從而促進創(chuàng)面的愈合〔14,15〕。

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