老年宮頸癌組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1、叉頭框蛋白P3、程序性死亡蛋白1及其受體的表達及意義

高雁榮 郭 玉

(安陽市腫瘤醫(yī)院婦三科，河南 安陽 455000)

研究表明，腫瘤免疫逃逸可能在宮頸癌形成過程中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是細胞生長抑制因子，參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1,2〕。叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子(FOX)P3可通過調(diào)控Treg細胞發(fā)育、分化和成熟，發(fā)揮免疫抑制作用〔3,4〕。程序性死亡受體配體-1(PD-L1)及程序性死亡受體(PD)-1是免疫反應(yīng)中極其重要的協(xié)同刺激分子，其激活有助于腫瘤免疫逃逸〔5,6〕。TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1在多種腫瘤中表達異常。本研究通過分析TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1在不同組織中的表達及相關(guān)性，并分析這四種蛋白表達水平與老年宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1在老年宮頸癌發(fā)生中的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取安陽市腫瘤醫(yī)院2014年9月至2016年9月手術(shù)切除的老年宮頸癌患者的癌組織60例及老年宮頸上皮內(nèi)瘤樣變患者的宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織30例，同時收集因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)且術(shù)后病理證實無宮頸病變的組織標本共20例。所有組織標本均置于液氮中保存，標本均經(jīng)HE染色，經(jīng)3名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師確診，納入對象均未接受過放、化療等。老年宮頸癌患者年齡60～78歲，平均(69.4±4.8)歲；臨床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期14例，Ⅲ期18例，Ⅳ期16例。腫瘤大?。?3 cm 28例，≥3 cm 32例。組織學(xué)分級：中高分化27例，低分化33例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，病理類型：38例為鱗狀細胞癌，17例為腺癌，5例為腺鱗癌。宮頸上皮內(nèi)瘤樣變患者年齡60～76歲，平均(69.1±4.3)歲；正常宮頸組織患者年齡61～78歲，平均(68.8±4.7)歲。三組研究對象年齡經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2主要試劑 小鼠抗人TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1一抗均購自Santa Cruz公司(美國)，免疫組化二抗購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組化染色 石蠟包埋組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，在100%、95%、85%的酒精浸泡水化，在98℃的枸櫞酸鈉溶液(0.01 mol/L，pH6.0)中浸泡15 min進行抗原修復(fù)，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10～15 min以降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色。室溫封閉20 min，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，室溫孵育1 h，DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，流水沖洗及時中止反應(yīng)，封片，鏡檢。

1.4免疫組化結(jié)果判定 在放大400倍的顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取5個以上觀察視野。綜合染色強度和陽性細胞百分比判定，染色強度：0分為無著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；陽性染色百分比(<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分)。兩項評分乘積小于2分判定為陰性，≥2分判定為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗，相關(guān)性分析采用列聯(lián)系數(shù)分析。

2 結(jié) 果

2.1老年宮頸癌組織TGF-β1蛋白的表達 與正常宮頸組織及宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織比較，老年宮頸癌組織中TGF-β1蛋白陽性表達率明顯較高(P<0.05)；與正常宮頸組織比較，宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織中TGF-β1蛋白陽性表較高(P<0.05)；正常宮頸組織中少見TGF-β1表達，見圖1，表1。

A：正常宮頸組織；B：宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織；C：老年宮頸癌組織；下圖同圖1 不同宮頸組織中 TGF-β1蛋白表達(DAB，× 400)

2.2老年宮頸癌組織FOXP3蛋白的表達 與正常宮頸組織和宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織比較，F(xiàn)OXP3蛋白在老年宮頸癌組織中表達的陽性率明顯較高；與正常宮頸組織比較，宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織中FOXP3蛋白表達的陽性率明顯較高(P<0.05)，見表1，圖2。

2.3老年宮頸癌組織PD-1蛋白的表達 與正常宮頸組織和宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織比較，PD-1蛋白在老年宮頸癌組織中表達的陽性率明顯較高；與正常宮頸組織比較，宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織中PD-1蛋白表達的陽性率明顯較高(P<0.05)，見表1，圖3。

2.4老年宮頸癌患者組織PD-L1蛋白的表達 與宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織比較，PD-L1蛋白在老年宮頸癌組織中表達的陽性率明顯較高(P<0.05)，而正常宮頸組織無PD-L1的表達，見表1，圖4。

圖2 不同宮頸組織中 FOXP3蛋白的表達(DAB，×400)

圖3 不同宮頸組織中 PD-1蛋白的表達(DAB，×400)

圖4 不同宮頸組織中 PD-L1蛋白的表達(DAB，×400)

表1 不同組織標本中各蛋白的表達比較〔n(%)〕

與正常宮頸組織比較：1)P<0.05；與宮頸上皮內(nèi)瘤樣變組織比較：2)P<0.05

2.5老年宮頸癌組織TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1表達與臨床病理特征的關(guān)系 TGF-β1的陽性表達與老年宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與腫瘤大小、臨床分期及組織學(xué)分級無關(guān)(P>0.05)。FOXP3的陽性表達與老年宮頸癌的組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與腫瘤大小、臨床分期無關(guān)(P>0.05)。PD-1的陽性表達與老年宮頸癌的組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與腫瘤大小、臨床分期無關(guān)(P>0.05)。PD-L1的陽性表達與老年宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與腫瘤大小、臨床分期及組織學(xué)分級無關(guān)(P>0.05)，見表2。

2.6老年宮頸癌組織TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1表達的相關(guān)性 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β1與FOXP3表達呈正相關(guān)(r=0.685，P=0.003)；PD-1與PD-L1表達呈正相關(guān)(r=0.412，P=0.000)；TGF-β1與PD-1、PD-L1的表達無相關(guān)性(r=-0.177、0.137，P=0.171、0.284)，F(xiàn)OXP3與PD-1、PD-L1的表達無相關(guān)性(r=0.163、0.023，P=0.206、0.757)。

表2 老年宮頸癌患者TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1表達與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

目前宮頸癌發(fā)病機制尚不完全清楚，對其預(yù)防和治療仍是難點。因此，探討宮頸癌發(fā)生發(fā)展機制，將為該類患者的治療提供新的治療策略和理論依據(jù)，并為該病防治藥物的研發(fā)提供新機制、新靶點、新方向。免疫監(jiān)視學(xué)說認為，免疫系統(tǒng)的一個關(guān)鍵作用是識別并清除腫瘤，免疫系統(tǒng)可監(jiān)視腫瘤的發(fā)生并通過免疫機制殺滅腫瘤，若機體免疫功能低下則可能發(fā)生腫瘤。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，細胞衍生出逃避免疫監(jiān)視的方式，腫瘤能夠逃避免疫監(jiān)視則被視為腫瘤的十大特征之一。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌發(fā)生發(fā)展中宮頸局部微環(huán)境的免疫監(jiān)視功能下降所導(dǎo)致的免疫逃逸現(xiàn)象起到了重要的作用，但導(dǎo)致宮頸癌免疫監(jiān)視能力下降的機制目前尚不清楚。

TGF-β1是一類多肽類細胞因子，具有多種功能，可通過其信號通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，廣泛參與機體各種生理病理過程。惡性腫瘤細胞可分泌大量的TGF-β1，發(fā)揮免疫抑制因子作用。TGF-β1在不同惡性腫瘤患者中有不同程度的表達并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后〔7，8〕。FOXP3是一種多功能的轉(zhuǎn)錄因子，其發(fā)揮免疫抑制作用的途徑是通過調(diào)控Treg細胞的發(fā)育、分化和成熟。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3陽性表達的細胞在腫瘤免疫逃逸機制中發(fā)揮了相當重要的作用，并且FOXP3在多種腫瘤中表達上調(diào)，如肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌等〔9，10〕。PD-1主要表達在活化T細胞上，是個抑制性受體，可與其配體PD-L1結(jié)合，抑制T細胞增殖、活化。PD-L1、PD-1在多種腫瘤中表達異常，可傳遞負性調(diào)節(jié)信號，使得腫瘤細胞能夠逃避機體免疫機制的監(jiān)控、殺傷〔11～15〕。本研究提示TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1在老年宮頸癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但其在腫瘤細胞中的高表達是如何形成的尚待進一步研究。本文結(jié)果提示TGF-β1、PD-L1、FOXP3、PD-1與老年宮頸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，分析可能原因為，此4種蛋白可能直接或間接地參與宮頸癌細胞的侵襲、遷移能力調(diào)控，并且FOXP3、PD-1可能還參與宮頸癌細胞分化能力的調(diào)控；本研究結(jié)果還提示TGF-β1與FOXP3、PD-1與PD-L1可能在同一通路中發(fā)揮作用。

綜上所述，老年宮頸癌組織中TGF-β1、FOXP3、PD-1、PD-L1蛋白表達顯著升高，可能與機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視能力下降密切相關(guān)，進而導(dǎo)致老年宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，研究這些蛋白的表達對老年宮頸癌患者的治療、預(yù)后具有一定的臨床價值。

4 參考文獻

1Zhou X,Mao Y,Zhu J,etal.TGF-beta1 promotes colorectal cancer immune escape by elevating B7-H3 and B7-H4 via the miR-155/miR-143 axis〔J〕.Oncotarget,2016;7(41):67196-211.

2Wu M,Chen X,Lou J,etal.TGF-β1 contributes to CD8+Treg induction through p38 MAPK signaling in ovarian cancer microenvironment〔J〕.Oncotarget,2016;7(28):44534-44.

3Wang X,Lang M,Zhao T,etal.Cancer-FOXP3 directly activated CCL5 to recruit FOXP3+Treg cells in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Oncogene,2017;36(21):3048-58.

4韓麗萍,劉麗雅,孫曉慧,等.宮頸癌組織中 FOXP3、PD-1及PD-L1蛋白的表達〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2017;52(1):83-8.

5吳介恒,楊安鋼,溫偉紅.PD-1/PD-L1參與腫瘤免疫逃逸的研究進展〔J〕.細胞與分子免疫學(xué)雜志,2014;30(7):777-80.

6林 城,陳 雄,劉靜南,等.PD-1/PD-L1信號通路在非小細胞肺癌免疫逃逸及其治療中的研究進展〔J〕.中國肺癌雜志,2014;17(10):734-40.

7Zhang F,Dong W,Zeng W,etal.Naringenin prevents TGF-β1 secretion from breast cancer and suppresses pulmonarymetastasis by inhibiting PKC activation〔J〕.Breast Cancer Res,2016;18(1):38.

8García-Rocha R,Moreno-Lafont M,Mora-García ML,etal.Mesenchymal stromal cells derived from cervical cancer tumors induce TGF-β1 expression andIL-10 expression and secretion in the cervical cancer cells,resulting in protection from cytotoxicT cell activity〔J〕.Cytokine,2015;76(2):382-90.

9Sun X,Feng Z,Wang Y,etal.Expression of Foxp3 and its prognostic significance in colorectal cancer〔J〕.Int J Immunopathol Pharmacol,2017;30(2):201-6.

10Chakraborty S,Panda AK,Bose S,etal.Transcriptional regulation of FOXP3 requires integrated activation of both promoter and CNS regions in tumor-induced CD8+Treg cells〔J〕.Sci Rep,2017;7(1):1628.

11Ciccarese C,Iacovelli R,Bria E,etal.The incidence and relative risk of pulmonary toxicity in patients treated with anti-PD1/PD-L1 therapy for solid tumors:a meta-analysis of current studies〔J〕.Immunotherapy,2017;9(7):579-87.

12Erlmeier F,Weichert W,Schrader AJ,etal.Prognostic impact of PD-1 and its ligands in renal cell carcinoma〔J〕.Med Oncol,2017;34(6):99.

13Jones K,Ballesteros A,Mentink-Kane M,etal.PSG9 stimulates increase in FoxP3+ regulatory T-cells through the TGF-β1 pathway〔J〕.PLoS One,2016;11(7):e0158050.

14Bally AP,Tang Y,Lee JT,etal.Conserved region C functions to regulate PD-1 expression and subsequent CD8 T cell memory〔J〕.J Immunol,2017;198(1):205-17.

15Moret FM,van der Wurff-Jacobs KM,Bijlsma JW,etal.Synovial T cell hyporesponsiveness to myeloid dendritic cells is reversed by preventing PD-1/PD-L1interactions〔J〕.Arthritis Res Ther,2014;16(6):497.