基于SLAF-seq技術(shù)的喬木柳SNP位點開發(fā)

李 敏，郭 聰，王 瑩，李玉娟，談 峰，張 健(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所， 江蘇 南通 226541)

【研究意義】土壤鹽堿化問題廣泛存在于世界各國和各地區(qū)1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界有各種鹽堿地約 9.5×108hm2，占全球陸地面積的10 %[2]。目前我國鹽堿地面積約為1 億多公頃，其中沿海灘涂面積達 267 ×104hm2以上，并以每年1333.33 hm2的速度增長，是非常重要的土地資源[3]。由于鹽堿地含鹽量分布不均，沿海灘涂土地資源一直不能得到充分利用，因此需要選育出強耐鹽堿、速生、高產(chǎn)值的林木良種，為我國沿海地區(qū)開發(fā)構(gòu)建綠色生態(tài)屏障起到重要的作用。柳樹歸屬于楊柳科(Salicaceae)柳屬(Salix)，包括垂柳和旱柳，全球約520余種，其中在中國發(fā)現(xiàn)250余種柳樹品種，是我國重要的鄉(xiāng)土樹種之一[4]。柳樹具有喜光耐寒，喜濕亦能耐干早，易成活，易繁殖抗性強等特性。同時，柳樹在鹽堿地及水體修復、水土保持和重金屬污染土壤，城市園林綠化，工業(yè)用材林、生物質(zhì)能源林及編織等方面具有廣闊的應用前景[5]?！厩叭搜芯窟M展】柳樹已經(jīng)在遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳圖譜的構(gòu)建、QTL定位等方面取得了重大的成果。Barke等[6]發(fā)現(xiàn)了AFLP條帶在柳樹遺傳多樣性等方面比RAFD的穩(wěn)定性高。SSR標記開發(fā)耗費巨大，但是它是比較高效、快捷的分子標記手段之一。Hanley等[7]在柳樹上開發(fā)了一批SSR分子標記，但并沒有公布其序列。2005年南京林業(yè)大學也開發(fā)了一些柳樹SSR，加上NCBI網(wǎng)上檢索出來的幾條柳樹SSR，總共有68對柳樹SSR[8]。完整、高密度的遺傳連鎖圖譜對柳樹遺傳育種有很大的重要性。一個完整的遺傳連鎖圖譜能夠有效的鑒定出與植物生長發(fā)育、基因型與環(huán)境互作等相關的QTL，為育種工作提供重要的基礎。首張柳樹遺傳圖譜是由Tsarouhas[9]的研究團隊利用父本Bjorn (S.viminalis×S.schwerinii)與母本78183 (S.viminalis)雜交獲得的87個個體為群體成功構(gòu)建，其中AFLP標記有325個，RFLP標記有38個，用于作圖的群體共有87個個體。首張喬木柳遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建由Barcaccia等[10]研究者完成，他們利用白柳與爆竹柳相互雜交所得到的69個個體，利用雙點擬測交法進行構(gòu)建，其中包AFLP標記242個，SAMPL標記50個。Hanley等[7]利用嵩柳的一個全同胞家系的66個個體作為作圖群體，通過雙電擬側(cè)交法構(gòu)建了親本圖譜，并整合得到一張嵩柳遺傳連鎖圖譜，其中包含AFLP標記291個，SSR標記39個。Berlin等[11]采用SNP和AFLP兩種分子標記，構(gòu)建了兩張均包含19個主連鎖群的高密度柳樹S1和S3遺傳連鎖圖譜。QTL定位是輔助育種的直接手段之一。目標性狀相關的QTL在不同的時間、不同的處理表現(xiàn)出不同的作用效率，能夠為相關性狀早期鑒定和基因克隆等研究奠定了基礎。Tsarouhas等[9]通過他們構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，發(fā)現(xiàn)了11個與高生長、莖段直徑、高徑比、萌枝數(shù)以及花期葉芽數(shù)量相關的QTLs。Tsarouhas等[12]通過AFLP標記在一個柳樹家系(n=82)中通過AFLP標記鑒別出了6個QTLs。Gunter等[13]通過RAPD技術(shù)在嵩柳全同胞家系中鑒別到了1個與雌性性別決定位點連接的遺傳標記?！颈狙芯壳腥朦c】本研究以195份喬木柳F1代群體和兩親本資源為材料，采用通量高、準確性高、成本低、周期短的SLAF-seq 高通量測序技術(shù)，篩選特異長度的DNA片段，構(gòu)建SLAF-seq 文庫，通過高通量測序獲得海量序列，再進行軟件分析比對，獲得多態(tài)性SLAF 標簽，在多態(tài)性SLAF 標簽上開發(fā)一批穩(wěn)定性高、特異性強的SNP 位點?！緮M解決的關鍵問題】這將為特異性SNP 標記的開發(fā)、高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、資源鑒定分析和重要農(nóng)藝性狀的關聯(lián)分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

母本：敏鹽旱柳‘沿江柳’，父本：耐鹽旱柳‘9901’及雜交的F1代遺傳群體經(jīng)親本鑒定195株。

1.2 DNA的提取

采用改良的CTAB 法提取F1群體的基因組DNA。用1 %的瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA 條帶的有無，DNA 的濃度和純度通過ND-1000 分光光度計來檢測。

1.3 酶切建庫

根據(jù)其基因組大小以及GC 含量等信息，選取三角葉楊(Populustrichocarpa)基因組(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000002775.3)作為參考基因組進行電子酶切預測，確定用HaeIII 和Hpy166 II 酶切組合進行試驗。雙酶切檢測合格的F1基因組DNA，再對得到的SLAF 標簽(長度為314～364 bp 的片段)進行3′端加A、連接Dual-index 測序接頭、PCR 擴增、片段篩選等處理后構(gòu)建旱柳SLAF 文庫。

1.4 測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出和質(zhì)量分析

文庫質(zhì)檢合格后，SLAF標簽通過IlluminaHiSeq 2500平臺(Illumina, San Diego, CA, USA)進行測序。為檢測實驗流程的合理性，選用水稻(Oryzasativa)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)作為對照(Control)，并對水稻進行相同的處理、建庫和測序。測序所得到的原始數(shù)據(jù)通過Dual-index 識別并得到各樣品的reads，然后評估過濾完接頭測序的reads 的質(zhì)量和數(shù)據(jù)量。

1.5 SLAF標簽的獲得和SNP標記的開發(fā)

將各個樣品的序列的相似度進行聚類，同一個SLAF 標簽中序列是聚類在一起的，不同SLAF 標簽的相似度比同一SLAF標簽在不同樣品間的序列相似度低。一個SLAF 標簽的不同樣品間序列有差異即可定義為多態(tài)性SLAF 標簽。根據(jù)篩選標準MAF>0.05，利用SLAF 標簽統(tǒng)計SNP 位點信息。

表1 根據(jù)酶切方案設計預測信息Table 1 Information prediction according to the enzyme digestion method

表2 Control 測序reads 比對結(jié)果統(tǒng)計表Table 2 Results statistics of control sequenced reads alignment (%)

2 結(jié)果與分析

2.1 建庫評估

根據(jù)目前已公布的柳樹的基因組大小為429 Mb，選擇同科基因組大小相似的三角葉楊基因組(大小為404 Mb，GC 含量為33.64 %)作為參考基因組，并進行電子酶切預測，選擇的酶組合為HaeIII 和Hpy166 II，定義SLAF 標簽為酶切片段長度在314～364 bp 的序列，可預測到126 008 個SLAF 標簽，位于重復序列區(qū)的SLAF 標簽比例為1.60 %(表1)。

以水稻作為對照物種，通過評估監(jiān)控水稻測序數(shù)據(jù)的實驗過程，進一步評估酶切方案的有效性與酶切的效率。通過SOAP[14]軟件對水稻基因組(大小為382M)的測序reads與參考基因組進行比對(表2)，得到雙端比對效率為96.67 %，酶切效率為92.06 %，比對效率基本正常，SLAF建庫正常。

2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與評估

為保證項目分析質(zhì)量，選取reads 的長度為100 bp*2，用于后續(xù)評估和分析的數(shù)據(jù)。

圖1 測序質(zhì)量值分布 Fig.1 Sequencing mass distribution map

首先，通過測序質(zhì)量值的分布檢查來評估堿基的準確性。高通量單堿基錯誤率(e)通常使用測序質(zhì)量值(Q)來表示，堿基錯誤率越低，所對應的測序質(zhì)量的數(shù)值就越高，公式為Q=-10×log10e。若某個堿基測序出錯概率為0.001，則該堿基的測序質(zhì)量值為30。母本樣品(FP)測序質(zhì)量值分布情況如圖1所示。

其次通過堿基分布檢查來檢測有無GC 、AT分離現(xiàn)象。這種分離現(xiàn)象可能會通過測序或建庫產(chǎn)生，從而影響后續(xù)分析。PCR擴增和酶切位點都會影響SLAF-seq 測序reads(基因組DNA 的酶切片段)上堿基的分布，因此堿基分布會呈現(xiàn)不同程度的波動。母本樣品(FP)測序堿基分布情況如圖2所示。

最后對各樣品的測序數(shù)據(jù)(表3)進行統(tǒng)計： 本試驗中樣品共獲得472.53Mreads 數(shù)據(jù)，測序平均Q30為90.15 %，平均GC含量為38.14 %。水稻測序獲得0.40Mreads 的數(shù)據(jù)量可用于評估實驗建庫準確性的。

2.3 SLAF標簽與SNP標記的開發(fā)

根據(jù)等位基因數(shù)和基因序列之間的差異，對所有樣品所開發(fā)的SLAF標簽(277 333個)進行多態(tài)性分析，共得到多態(tài)性標簽，非多態(tài)性標簽，重復性標簽3 種類型的SLAF 標簽，其中多態(tài)性SLAF 標簽共有99 526 個，比例達到35.89 %(表4)。對99 526個多態(tài)性SLAF標簽按照遺傳學通用的等位編碼規(guī)則進行編碼，有58 763個標簽成功編碼，為構(gòu)建遺傳圖譜進一步對SLAF標簽進行過濾，最終獲得6744個SLAF標簽(表5)。進一步進行SNP 位點的開發(fā)，在各連鎖群上共開發(fā)得到9488 個SNP 位點(圖3)。

圖2 堿基含量分布Fig.2 Distribution diagram of base content

表3 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 3 Statistics for sequencing data

表4 SLAF標簽分類Table 4 SLAF label classification

表5 用于圖譜構(gòu)建的SLAF標簽類型統(tǒng)計Table 5 SLAF tag type statistics for map building

3 討 論

SLAF-seq 技術(shù)是高通量測序技術(shù)，根據(jù)設定的預酶切方案，獲得特異長度的片段，采用雙端測序特定酶切片段，這種測序方法可重復性高，可以在短時間內(nèi)獲得遍布整個基因組的海量信息，以實現(xiàn)候選功能區(qū)的精細定位。這種技術(shù)開發(fā)標記具有密度大，一致好，成本低等特點，并且SALF分子標記多數(shù)為SNP，少量的Indel。目前已成功應用于多種動植物中，蘇文瑾等[15]通過SLAF-seq技術(shù)測序，共獲得了260 000個多態(tài)性SLAF 標簽，并開發(fā)了795 794個高質(zhì)量的SNP標記。陳士強等[16]運用這項技術(shù)開發(fā)了偃麥草第7 染色體上抗小麥赤霉病的特異分子標記。Li等[17]運用此技術(shù)獲得了9948 個大豆多態(tài)SLAF 標記。 Wei 等[18]運用SLAF-seq 技術(shù)開發(fā)出黃瓜的5044 個SLAF 多態(tài)標記。本研究利用SLAF-seq技術(shù)對195個柳樹F1代群體和兩親本測序，獲得472.53 Mb的讀長信息，利用所獲得的讀長信息開發(fā)出277 333個SLAF 標簽，其中多態(tài)性SLAF 標簽共有99 526個，從99 526個多態(tài)性SLAF 標簽上共計開發(fā)獲得9488個SNP標記，所獲得的數(shù)據(jù)量能夠用來進行特異性SNP標記的驗證與開發(fā)。今后，可利用所開發(fā)的SNP標記，聯(lián)系群體中不同個體的表型，關聯(lián)定位與某性狀緊密連鎖的分子標記，進而可以實現(xiàn)優(yōu)良基因的精細定位。

4 結(jié) 論

通過對三角葉楊基因組序列進行電子酶切預測，最終選擇的酶切組合為HaeIII和Hpy166II酶，定義長度為314～364 bp的酶切片段序列為SLAF標簽，預測可得SLAF標簽126 008個。通過評估監(jiān)控對照物種水稻的測序數(shù)據(jù)的實驗過程，結(jié)果可得HaeIII和Hpy166II酶的酶切效率為92.06 %，比對效率正常，SLAF建庫正常。通過測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和評估，可以得到本次測序共獲得472.53 Mb的讀長信息，測序平均Q30位90.15 %，平均GC含量為38.14 %。通過信息分析，共獲得277 333個SLAF標簽，其中多態(tài)性SLAF標簽有99 526個，比例達到35.89 %，用于遺傳圖譜構(gòu)建的標簽有6744個。通過99 526個多態(tài)性SLAF標簽，共計開發(fā)了9488個SNP標記，可以用來完成后續(xù)群體進化分析和特異性SNP標記的開發(fā)。

圖3 各連鎖群上SNP標記的數(shù)目Fig.3 Number of SNP tags on each chain group

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