五苓散對腦梗死小鼠腦水腫及線粒體生物合成的影響

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腦梗死作為一種常見的腦血管疾病，具有較高的致殘率和致死率，早期干預可使10%～50%卒中病人的認知功能得到一定程度改善[1-2]。多項研究證實，應用五苓散可有效改善病人腦水腫和神經(jīng)功能損傷癥狀，但具體機制尚不明確。線粒體是機體能量代謝的重要場所，線粒體功能障礙與細胞毒性腦水腫及神經(jīng)功能損傷程度密切相關，提示線粒體可能是五苓散發(fā)揮腦保護作用的重要靶點之一[3-5]。本研究擬通過構建小鼠腦缺血再灌注(MCAO)模型，探討五苓散對腦水腫的影響，并進一步檢測線粒體生物合成相關基因表達及線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數(shù)的變化，為五苓散治療腦梗死的機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑、儀器 雄性C57BL/6小鼠30只，體重25 g～30 g，購于軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心?？俁NA/DNA共提取試劑盒(天根公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(天根公司)，real-time PCR劑盒(康為世紀公司)，real-time PCR儀(美國ABI公司，Step One Plus)，小動物麻醉機(瑞沃德公司)。

1.2 方法

1.2.1 五苓散配制 茯苓9 g，豬苓9 g，白術9 g，澤瀉15 g，桂枝6 g，煎煮兩次，合并藥液后稀釋成1 g/mL，4 ℃保存。

1.2.2 分組及相應手術操作 將小鼠隨機分為對照組(S組)、大腦中動脈栓塞組(MCAO組)和五苓散組(W組)，各10只。MCAO組和W組采用線栓法構建右側大腦中動脈栓塞模型：首先，以400 mL/min流量，2%濃度異氟烷麻醉小鼠后，取頸正中切口，分離頸內(nèi)、外動脈；其次，結扎頸外動脈根部和頸總動脈近心端，另分別在頸內(nèi)動脈和頸總動脈距遠心端3 mm～5 mm處套線不結扎，為下一步線栓插入做準備；最后，頸總動脈遠心端處夾一動脈夾，并在頸總動脈兩線之間剪一斜形切口，將單絲尼龍線(6-0)從切口插入至動脈夾處，之后結扎頸總動脈遠端套線，松開動脈夾，繼續(xù)向頸內(nèi)動脈插入1 cm左右，遇阻力時即停止，縫合皮膚并將線栓一頭留在體外，1 h后拔出線栓完成再灌注。MCAO組按1 mL/100 g給予生理鹽水灌胃，每日3次；W組按1 mL/100 g給予五苓散灌胃，每日3次；S組僅暴露頸內(nèi)動脈后縫合皮膚。

1.2.3 MCAO模型評價 麻醉清醒后，小鼠出現(xiàn)如下3種狀態(tài)之一，認為MCAO造模成功：①不能完全伸展單側前肢；②向單側轉圈；③向單側傾斜[6]。

1.2.4 神經(jīng)功能損傷評分(mNSS)及標本采集 3組小鼠均于術后72 h行mNSS評分[6]，分數(shù)越高說明癥狀越嚴重，0分為正常，最嚴重為18分。評價完成后采用頸椎離斷法處死小鼠，MCAO組及W組留取缺血半暗帶同一部位約10 mg腦組織，S組留取相應部位腦組織。剩余腦組織進行干濕比重測量。

1.2.5 相關基因表達及mtDNA拷貝數(shù)測定 按照試劑盒說明書，提取腦組織的總RNA和基因組DNA，并將RNA反轉錄成cDNA，以測定線粒體生物合成相關基因的表達變化，包括受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferators activated receptor gamma coactivator-1 alpha，PGC-1α)、核呼吸因子1和2(nuclear respiratory factor 1/2，NRF1/2)、線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)及線粒體單拷貝基因COX2。方法如下：配制PCR反應體系，包括2×UltraSYBR Mixture，cDNA 10 ng或基因組DNA 50 ng及相應體積的引物和滅菌雙蒸水，每個基因設置3個重復孔。反應條件采用兩步法：95 ℃，10 min預變性，隨后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)測定CT值，以0.3 ℃梯度逐步升溫行融解曲線分析。應用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 腦組織含水量測定 去除嗅球、小腦和腦干后，分離左右大腦半球，立即稱重(濕重)。之后將大腦放入烘干箱中，75 ℃烘烤48 h后稱重(干重)。含水量=(濕重-干重)/濕重。

2 結 果

2.1 3組mNSS評分比較 S組、W組和MCAO組mNSS評分依次升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

2.2 3組各基因表達及mtDNA拷貝數(shù)變化比較 S組、MCAO組和W組大鼠腦組織PGC-1α和TFAM 基因表達及mtDNA拷貝數(shù)依次增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MCAO組和W組大鼠腦組織NRF1和NRF2表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但均顯著高于S組(P<0.05)。詳見表2。

組別mNSS評分(分)PGC-1αNRF1NRF2TFAMmtDNA拷貝數(shù)W組 5.30±1.651)2) 4.97±1.321)2) 3.04±1.501) 2.70±1.061) 2.89±0.201)2) 7.82±3.201)2)MCAO組 7.30±1.591) 1.86±0.611) 2.86±1.431) 2.98±1.221) 1.83±0.351) 5.50±1.421)S組 0.10±0.32 1.04±0.31 1.20±0.48 0.93±0.60 1.01±0.55 1.10±0.82 與S組比較,1)P<0.05;與MCAO組比較,2)P<0.05。

2.3 3組腦組織含水量比較 MCAO組、W組和S組大鼠患側腦組織含水量依次降低分別為0.798±0.014，0.781±0.011與0.760±0.009，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

腦水腫是腦梗死后常見的并發(fā)癥之一，常于發(fā)病后第3天～第5天達到高峰，缺氧的腦細胞發(fā)生水腫后，可使顱內(nèi)壓急劇增高，進一步使腦部血液灌注減少，過高顱內(nèi)壓壓迫正常腦組織，進一步加重病情，甚至導致腦疝威脅生命[7]。

五苓散是《傷寒雜病論》中利水滲濕的代表方，具有利濕行水，溫陽化氣的功效，在腦梗死治療中可作為輔助用藥。本實驗結果表明，五苓散可有效減輕腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)功能損傷癥狀，并降低腦梗死后腦水腫的嚴重程度，這與李星瑞等[8]研究結果一致，發(fā)現(xiàn)應用五苓散治療腦梗死可有效改善病人神經(jīng)功能損傷程度，但目前五苓散發(fā)揮腦保護作用的具體機制尚不明確。

線粒體是通過氧化磷酸化為細胞活動提供能量的重要細胞器，當缺血缺氧導致線粒體功能障礙時，引起細胞內(nèi)乳酸堆積并影響Na+-H+交換，促進腦水腫的發(fā)生[9]。本研究探討腦組織mtDNA拷貝數(shù)及線粒體生物合成相關基因表達的變化。結果發(fā)現(xiàn)，腦梗死后腦組織中mtDNA拷貝數(shù)顯著增加，表明缺氧在造成線粒體損傷后，mtDNA發(fā)生代償性擴增。一方面，mtDNA是獨立存在于細胞器中的基因組DNA，其在基因組中的個數(shù)稱為mtDNA拷貝數(shù)，由于缺少組蛋白保護，mtDNA易受到氧化應激、炎癥等危險因素損傷，造成基因突變及線粒體功能障礙[10-11]，腦梗死后，局部腦組織因氧化應激產(chǎn)生大量活性氧，從而造成mtDNA損傷。另一方面，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)造成mtDNA損傷同時，本身可作為第二信使，觸發(fā)TFAM和NRF表達，促進線粒體擴增以降低功能障礙mtDNA所占比例，代償能量供應水平的下降[12-13]。應用五苓散后，可見大鼠PGC-1α基因及下游TFAM基因表達進一步升高，且mtDNA拷貝數(shù)顯著提高，表明五苓散可能通過激活PGC及下游通路，促進mtDNA的生物合成，增強缺血缺氧腦組織的能量供應，改善腦水腫程度，發(fā)揮腦保護作用。

綜上所述，本實驗通過構建腦缺血再灌注小鼠模型，初步探討五苓散對腦水腫及線粒體生物合成基因的影響，為解釋五苓散發(fā)揮腦保護作用的機制提供基礎研究。腦梗死發(fā)病是多因素共同造成的，其發(fā)生發(fā)展涉及其他多條通路及靶基因，仍有待進一步研究。若能進一步探討五苓散對其他通路的影響，可能為腦梗死的臨床治療用藥及發(fā)現(xiàn)五苓散的新用途提供依據(jù)。

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