木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物產(chǎn)物自由基清除活性評價

王 琪, 李 慧,陸文偉,周泉城

(1.山東理工大學 農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院 ，山東 淄博 255049；2.山東理工大學 農(nóng)產(chǎn)品功能化技術山東省高校重點實驗室，山東 淄博 255049)

擠壓技術具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)率高、能量損耗低、功能種類多的優(yōu)點. 擠壓過程中，在溫度、壓力和剪切力作用下，豌豆蛋白會發(fā)生化學鍵的斷裂、重新結合、大分子失去原有的結構、小分子發(fā)生聚合或降解等，從而使原料的生物活性、理化性質和營養(yǎng)價值發(fā)生變化[4-6]. 在擠壓過程中，在溫度、壓力和剪切力的作用下，維持蛋白質結構的作用力減弱，分子結構發(fā)生伸展，由球狀轉為纖維狀，并使分子間氫鍵、二硫鍵等化學鍵斷裂[7]. 經(jīng)過擠壓之后，蛋白質內(nèi)部的疏水性基團暴露，蛋白質交聯(lián)作用加劇，使得一些共價鍵生成. 此外，擠壓后的物料游離氨基的含量增加，使得擠出物的消化率升高，蛋白質的酶解速度加快[7]. 因此，研究擠壓、特別是酶聯(lián)合擠壓過程中豌豆蛋白的結構變化具有重要意義，并可為豌豆蛋白的后續(xù)加工提供理論指導和技術參數(shù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木瓜蛋白酶購自濟寧元素高科生物科技有限公司，木瓜蛋白酶的酶活力為50 234 u/g. 豌豆蛋白購自煙臺雙塔食品股份有限公司，主要組成(質量分數(shù))為水分4.62±0.02%，蛋白質73.2±0.23%，粗脂肪0.22±0.01%，灰分4.62±0.03%，此蛋白為原料豌豆蛋白，簡稱為豌豆蛋白.

1.2 實驗儀器

單螺桿擠壓機由山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院研制，單螺桿擠壓機的長徑比是16.7.

1.3 試驗操作

1.3.1 豌豆蛋白的擠壓處理

稱取2 kg豌豆蛋白粉，含水率25%. 擠壓條件如下：機筒溫度60℃，螺桿轉速170 r/min，?？卓讖?2 mm. 擠出物冷卻、干燥、粉碎，100目篩選，裝袋儲存，稱為豌豆蛋白擠出物.

1.3.2 豌豆蛋白擠出物的酶解

稱取一定質量的豌豆蛋白和由節(jié)1.3.1得出的豌豆蛋白擠出物樣品，加入一定質量的木瓜蛋白酶和一定pH值的磷酸鹽緩沖溶液，搖勻，置于恒溫振蕩水浴鍋中，振蕩酶解3 h，結束后，沸水浴滅酶10 min. 冷卻后，將木瓜蛋白酶解液過濾，濾液稱為酶解物.

1.4 抗氧化活性響應曲面實驗設計

查閱相關資料及文獻可發(fā)現(xiàn)加酶量、溫度、pH、底物濃度為影響酶解條件的4個顯著因素，因此，選擇此4個因素為實驗因素. 通過預實驗研究大致確定實驗因素的用量范圍，利用抗氧化活性作為評判指標，確定顯著用量范圍進而得出實驗因素的5個水平，運用SAS 9.1軟件進行實驗設計分析，得出最佳的酶解條件.實驗設計及結果見表1.

表1 響應面實驗設計及結果Tab.1 Response surface experimental data

1.5 酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究

1.5.1 DPPH清除率的測定

根據(jù)Dike Teng[8]的方法，加以改動. 實驗組取濾液1 mL，加入試管中. 并加入4 mL濃度為0.1 mol/L的DPPH溶液，其中DPPH溶液用體積分數(shù)為95%乙醇：蒸餾水=1∶1的混合溶液作為溶劑配制. 避光靜置30 min后，在517 nm下測定吸光度(Asample).

對照組以1 mL的蒸餾水代替濾液，實驗步驟與上述相同(Acontrol). 空白組以體積分數(shù)為95%乙醇：蒸餾水=1∶1的混合溶液來代替DPPH溶液，實驗步驟與上述相同(Ablank). 參比為1 mL蒸餾水和4 mL的5%乙醇：蒸餾水=1∶1的混合溶液. 計算公式如下：

清除率%=

[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%

1.5.2 OH清除率的測定

采用鄰二氮菲法[9]，做適當修改. 實驗組取2 mL濾液于試管中，加入2 mL的0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH為7.4)，再加入1 mL1.8 mM的鄰二氮菲溶液和1 mL 1.8 mmol/L的FeSO4水溶液，迅速混勻. 最后在混合液中加入1 mL體積分數(shù)0.02%的雙氧水，于37℃下水浴60 min，冷卻后在536 nm下測定吸光度，記為As.

對照組以蒸餾水代替濾液，實驗步驟與上述相同(Ac). 空白組用蒸餾水代替濾液和雙氧水，實驗步驟與上述相同(Ab). 參比為5 mL的磷酸鹽緩沖溶液與2 mL蒸餾水的混合溶液. 計算公式如下：

清除率%=[(As-Ac)/(Ab-Ac)]×100 %

1.6 數(shù)據(jù)分析

每個操作3次平行，利用SAS 9.1軟件建立回歸模型方程，對數(shù)據(jù)進行ANOVA分析，Duncan test確定平均值差異.

2 結果與分析

2.1 木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物抗DPPH清除率實驗

以DPPH清除率為響應值，經(jīng)回歸擬合后，木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物的DPPH清除率的回歸方程為：

DPPH清除率=-292+3.37A+4.29B+61.3C+12.5D+0.009AB+0.0506AC+0.297×AD+0.0643BC-0.0689BD+0.0663CD-0.259A2-0.0363B2-5.13C2-0.897D2.

木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物的DPPH清除率的回歸方程方差分析表，見表2.

由表2可知，所建模型是顯著的，失擬項是不顯著的. 且加酶量(A)和pH的交互項(AC)影響顯著，加酶量的二次項(A2)、溫度的二次項(B2)、pH二次項(C2)、底物濃度的二次項(D2)的影響極顯著. 由F值可知，各因素對豌豆蛋白擠出物酶解液DPPH清除率的影響次序：pH>底物濃度>加酶量>酶解溫度. 加酶量和底物濃度對酶解度的交互作用比其他交互作用更明顯. 趙翊君等[10]研究了辣木籽酶解產(chǎn)物的DPPH清除能力，研究證明了蛋白酶解產(chǎn)物具有較強的DPPH清除率. 本研究的結果與趙翊君等的研究結果相一致. 根據(jù)回歸方程作各因素及其交互作用對DPPH清除率影響的響應曲面圖見圖1.

表2 DPPH清除率方差分析Tab.2 Variance analysis for the scavenging rate of DPPH

通過響應曲面圖1，可以進一步看出加酶量、pH、溫度、底物濃度，任何2個因素對DPPH清除率的交互影響. 由圖1可以看出各因素存在極值點，即有最優(yōu)值，且各因素的相應曲面圖在底面的投影呈圓形或橢圓形，極值點落于圓心處，說明4個因素的水平值選擇合理，驗證了實驗的準確性.

圖1 DPPH清除率響應曲面圖Fig. 1 Response surface plot of the scavenging rate of DPPH

2.2 木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物·OH清除率實驗

以·OH清除率為響應值，經(jīng)回歸擬合后，木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物的·OH清除率的回歸方程為：

·OH 清除=-2637+84.5A+19.1B+389C+102D-0.275AB+0.009AC-0.584AD-0.301BC-0.061BD+1.16CD-2.66A2-0.107B2-29.3C2-6.99D2.

木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白·OH清除率的回歸方程方差分析表，見下表3.

表3 ·OH清除率方差分析Tab.3 Variance analysis for the scavenging rate of ·OH

由表3可知，所建模型是顯著的，失擬項是不顯著的. 加酶量的二次項(A2)、pH的二次項(C2)、底物濃度的二次項(D2)影響極顯著. 由F值可知，各因素對豌豆蛋白擠出物酶解液·OH清除率的影響次序：pH>底物濃度>酶解溫度>加酶量. 這與馬薩日娜的研究結果相一致[11]. 根據(jù)回歸方程作各因素及其交互作用對·OH清除率影響的響應曲面圖見圖2.

圖2 各因素對·OH清除率的響應曲面圖Fig. 2 Response surface plot of the scavenging rate of ·OH

通過響應曲面圖2，可以進一步看出加酶量、pH、溫度、底物濃度，任何2個因素對·OH清除率的交互影響. 由圖2可以看出各因素存在極值點，即有最優(yōu)值，且在底面的投影呈圓形或橢圓形，極值點落于圓心處，說明4個因素的水平值選擇合理，驗證了實驗的準確性. ·OH清除率隨著底物濃度的增加而增加最終趨于平緩；而隨著加酶量、pH、溫度的升高先升高后降低.

2.3 木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物抗氧化最佳酶解條件

以DPPH清除率、·OH清除率為評價指標，對回歸方程進行偏微分，得出最佳酶解條件：加酶量12.1%、溫度60.6℃、pH6.50、底物濃度0.071g/mL.

2.4 驗證實驗

經(jīng)驗證，在節(jié)2.3最佳酶解條件下，得到最佳DPPH清除率、·OH清除率分別為98.2±0.21%、84.5±0.15%，與在此條件下預測值DPPH清除率、·OH清除率分別為98.3%、84.7%方差分析無顯著性差異. 這說明該模型預測準確，可用于豌豆蛋白擠出物抗氧化性預測及酶解條件篩選.

3 結束語

經(jīng)以上實驗操作及軟件分析可得出木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白擠出物最佳酶解條件：加酶量12.1%、溫度60.6℃、pH6.50、底物濃度0.071g/mL. 此條件下，DPPH清除率、·OH清除率預測值分別為98.3%、84.7%，與驗證結果相符.該模型預測準確可靠，可用于豌豆蛋白的生產(chǎn)預測和工藝開發(fā).

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