羅氏沼蝦致病性溶藻弧菌的鑒定及藥敏分析

苗鵬飛，楊 映，譚淑雯，陳言峰，彭鐘琴，吳勇亮，于 輝

( 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231 )

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)亦稱馬來(lái)西亞大蝦、金錢蝦、淡水長(zhǎng)臂大蝦、萬(wàn)氏對(duì)蝦等，屬長(zhǎng)臂蝦科、沼蝦屬，原產(chǎn)地在厄瓜多爾沿岸，是世界上養(yǎng)殖量最高的三大對(duì)蝦之一[1]。該品種具有生長(zhǎng)快、食性廣、肉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分好、養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn)，是深受養(yǎng)殖戶喜愛(ài)的養(yǎng)殖品種。自東南亞地區(qū)引進(jìn)我國(guó)后，經(jīng)過(guò)30多年的養(yǎng)殖，羅氏沼蝦已經(jīng)成為我國(guó)重要的淡水蝦類，養(yǎng)殖廣泛分布在江蘇、廣東、上海、福建、廣西、浙江等16個(gè)省市，養(yǎng)殖面積約3.34×104hm2，年產(chǎn)量逾1.2×105t[2]。隨著羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，高密度、高換水率的養(yǎng)殖模式嚴(yán)重影響周邊的水體環(huán)境，破壞了水體生態(tài)的平衡，繼而導(dǎo)致羅氏沼蝦的病害發(fā)生[3-4]。細(xì)菌是導(dǎo)致羅氏沼蝦病害發(fā)生的一個(gè)主要因素[5]，弧菌(Vibrio)、氣單胞菌(Aeromonas)和假單胞菌(Pseudomonas)被認(rèn)為是羅氏沼蝦感染細(xì)菌性疾病的主要原因[6]。筆者從廣東省湛江市某養(yǎng)殖場(chǎng)患病羅氏沼蝦體內(nèi)分離到一株優(yōu)勢(shì)菌QY170324，對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)觀察、生理生化特征鑒定、16S rDNA序列分析、藥敏試驗(yàn)，旨在為羅氏沼蝦疾病研究提供理論依據(jù)，為羅氏沼蝦健康養(yǎng)殖提供一些參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病幼蝦采自廣東省湛江市某羅氏沼蝦養(yǎng)殖場(chǎng)。癥狀為患病幼蝦行動(dòng)遲緩、大部分浮于水面、紅體等。健康的幼蝦取自廣東省佛山市某養(yǎng)殖場(chǎng)。

硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖弧菌選擇性培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、堿性蛋白胨水購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；SuperMix、GelStain核酸染料(1000×)、瓊脂糖購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Maker DL2000購(gòu)于大連寶生物工程公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)于北京艾萊德生物科技有限公司；1%NaCl葡萄糖產(chǎn)氣、1%NaCl葡萄糖磷酸鹽凍水(V-P)、1%NaCl蛋白胨水、1%NaCl蔗糖、1%NaCl甘露糖、1%NaCl阿拉伯糖、1%NaCl肌醇、1%NaCl賴氨酸脫羧酶、1%NaCl精氨酸雙水解酶、無(wú)鹽胨水、3%NaCl胨水、6%NaCl胨水、8%NaCl胨水、10%NaCl胨水14種生化鑒定管購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 病原菌的分離、純化和保存

患病幼蝦于無(wú)菌狀態(tài)下勻漿處理后，用接種劃線針接種于硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h；挑取形態(tài)一致、單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落接種于含3%NaCl的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，28 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)18 h。菌液中加入體積系數(shù)為30%的甘油，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3 病原菌的生理、生化鑒定

用硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)致病菌，觀察其形態(tài)、菌落大小。對(duì)單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察。挑取新鮮菌落接種于含3%NaCl的營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18 h，取70 μL含3%NaCl的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物依次加入微量生化管中，37 ℃下培養(yǎng)8～48 h，觀察結(jié)果。

1.4 人工感染試驗(yàn)

試驗(yàn)健康蝦為淡化后仔蝦，平均體長(zhǎng)約為2.0 cm。人工感染試驗(yàn)在20 L水族箱中進(jìn)行，溫度控制在28 ℃，連續(xù)充氧。試驗(yàn)組與對(duì)照組分別放入20尾仔蝦，試驗(yàn)前仔蝦在水族箱內(nèi)暫養(yǎng)一周，無(wú)異常情況后開(kāi)始試驗(yàn)。試驗(yàn)組水體中的細(xì)菌密度調(diào)至108cfu/mL，對(duì)照組不加入菌體。每日正常投喂、換氣、吸污換水，并觀察記錄發(fā)病癥狀及死亡情況。

1.5 菌株16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將分離得到的弧菌接種于含3%NaCl的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，28 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)16～18 h，用細(xì)菌的通用引物擴(kuò)增16S rDNA,P1:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，P2:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取分離細(xì)菌的DNA。PCR反應(yīng)體系(50 μL):14 μL 2× Easy Taq Super Mix(含Mg2+、dNTP、DNA聚合酶、buffer)， 10 mmol/L正向和反向引物各1 μL，2 μL模板，ddH2O 32 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至上海生工生物工程有限公司純化并測(cè)序。將測(cè)序所得序列與GenBank中的核酸序列進(jìn)行Blast分析，選取同源性較高的序列，采用Clustal X 1.83軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并通過(guò)MEGA 6軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 藥敏試驗(yàn)

在無(wú)菌環(huán)境下，取100 μL分離純化的新鮮菌液，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布于含3%NaCl的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用鑷子無(wú)菌操作將每種藥敏片輕輕的貼在上面，28 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[7]，判定該菌對(duì)17種抗生素的敏感程度。

2 結(jié)果和分析

2.1 病原形態(tài)特征

自羅氏沼蝦組織中分離獲得1株細(xì)菌QY170324，在硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂平板上培養(yǎng)18 h后，呈現(xiàn)為圓形光滑、黃色突起的菌落。在含3%NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)時(shí)，菌液呈現(xiàn)均勻渾濁。顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性菌(圖1)。

圖1 菌株QY170324革蘭氏染色結(jié)果(1000×)

2.2 病原菌的生理、生化鑒定

由分離菌的生理、生化特性的檢測(cè)結(jié)果可知，該病原菌與溶藻弧菌(V.alginolyticus)極為相似(表1)，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步鑒定該病原菌為溶藻弧菌。

2.3 人工感染試驗(yàn)

人工感染3 d后，羅氏沼蝦開(kāi)始出現(xiàn)死亡，7 d后全部死亡，病死率達(dá)100%。觀察期內(nèi)取感染死亡仔蝦勻漿處理后進(jìn)行細(xì)菌分離，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果顯示分離菌特征與原感染菌基本一致，所以初步判斷廣東省湛江市某養(yǎng)殖場(chǎng)羅氏沼蝦發(fā)病是由該致病菌所致。

表1 分離菌的生理生化特征

注：“+”表示反應(yīng)為陽(yáng)性，“-”為陰性，“d”為結(jié)果未定.

2.4 菌株16S rDNA基因序列的鑒定及發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將分離菌所擴(kuò)增的16S rDNA基因序列提交到GenBank，獲得序列號(hào)為MF187358，Blast比對(duì)結(jié)果顯示，菌株QY170324基因與溶藻弧菌相應(yīng)基因相似率達(dá)99%。所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2，菌株QY170324與溶藻弧菌聚為一支。

2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，溶藻弧菌QY170324對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、哌拉西林、頭孢他啶、復(fù)方新諾明等抗生素敏感，對(duì)頭孢曲松、卡那霉素、新霉素、米諾環(huán)素、麥迪霉素、頭孢唑林、多黏菌素B中度敏感，對(duì)克林霉素、羧芐西林、頭孢氨芐耐藥(表2)。

圖2 基于16S rDNA序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

抗生素藥物含量/μg·片-1抑菌圈直徑/mm判定結(jié)果克林霉素210R頭孢曲松3029I慶大霉素1016S卡那霉素3015I新霉素3015I四環(huán)素3022S多西環(huán)素3023-米諾環(huán)素3025I麥迪霉素3013I羧芐西林1009R哌拉西林10022S頭孢氨芐307R頭孢唑林3015I頭孢他啶3027S多黏菌素B300 units15I復(fù)方新諾明23.75/1.2517S氧氟沙星220S

注：S為高度敏感,I為中度敏感,R為不敏感；-:無(wú)對(duì)應(yīng)的參考標(biāo)準(zhǔn).

3 討 論

3.1 病原菌的分離鑒定及對(duì)羅氏沼蝦的致病力

溶藻弧菌屬弧菌科、弧菌屬，專屬性嗜鹽，是一類廣泛分布于世界范圍內(nèi)的革蘭氏陰性菌，在河口處和海水中最多[8]。該菌不僅對(duì)水生動(dòng)物危害大，亦可導(dǎo)致人類的許多疾病，如引起人食物中毒、腸道炎、傷口感染、中耳炎等[9]，是重要的食源性病原菌之一。溶藻弧菌能夠感染許多水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，如紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)[10]、魁蚶(Scapharcabroughtonii)[11]、大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)[12-13]、花鱸(Lateolabraxjaponicus)[14]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[15]、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[16]、曼氏無(wú)針烏賊(Sepiellamaindroni)[17]等水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病。近幾年有學(xué)者報(bào)道，溶藻弧菌也可以感染半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[18]，本研究首次報(bào)道了在羅氏沼蝦養(yǎng)殖過(guò)程中溶藻弧菌作為潛在的細(xì)菌性病原體也可感染羅氏沼蝦導(dǎo)致死亡的案例，說(shuō)明溶藻弧菌的感染范圍在擴(kuò)大，應(yīng)引起重視。

本試驗(yàn)在廣東省湛江市某養(yǎng)殖場(chǎng)的患病死亡仔蝦體內(nèi)分離得到一株病原菌QY170324，運(yùn)用分子生物學(xué)方法測(cè)定16S rDNA基因序列。16S rDNA 基因檢測(cè)技術(shù)目前已成為病原菌檢測(cè)和鑒定的強(qiáng)有力工具，應(yīng)用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌快速、微量和準(zhǔn)確的分類鑒定[19]。因此，本研究運(yùn)用16S rDNA基因、同時(shí)結(jié)合生理生化試驗(yàn)及回歸感染試驗(yàn)，綜合判定導(dǎo)致羅氏沼蝦死亡的致病菌為溶藻弧菌。本試驗(yàn)分離到了賴氨酸脫羧酶為陰性的致病性溶藻弧菌，與徐曉麗等[18]從半滑舌鰨體內(nèi)分離到的賴氨酸脫羧酶為陰性的溶藻弧菌結(jié)果相同，與Beleneva等[20]提出溶藻弧菌賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性(+)結(jié)果不同，可能是細(xì)菌代謝受環(huán)境、溫度等因素影響，導(dǎo)致菌株之間生化特性具一定的差異性。所以，在判定溶藻弧菌的種屬時(shí)，還應(yīng)結(jié)合生理特征、分子生物學(xué)等方面的特性進(jìn)行綜合判斷。本試驗(yàn)對(duì)分離菌株QY170324的16S rDNA序列進(jìn)行了分析，序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建證實(shí)該菌為溶藻弧菌。

本研究中，人工感染后羅氏沼蝦的癥狀與自然發(fā)病時(shí)的癥狀相似，并自患病的幼蝦體內(nèi)重新分離到了與溶藻弧菌QY170324形態(tài)、生化特征一致的細(xì)菌，證實(shí)這株細(xì)菌即為本次導(dǎo)致羅氏沼蝦發(fā)病的病原菌。

3.2 用于防治羅氏沼蝦溶藻弧菌病抗生素的篩選

目前，抗生素治療仍然是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病治療的一種重要手段[21]。由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，溶藻弧菌QY170324對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、哌拉西林、頭孢他啶、復(fù)方新諾明6種藥物高度敏感，對(duì)頭孢曲松、卡那霉素、新霉素、米諾環(huán)素、麥迪霉素、頭孢唑林、多黏菌素B 8種藥物中度敏感，對(duì)克林霉素、羧芐西林、頭孢氨芐耐藥，所以，在疾病發(fā)生后選擇藥物時(shí)應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，有針對(duì)性地篩選適合的藥物來(lái)治療由該菌引起的疾病，避免造成誤用、濫用漁藥而導(dǎo)致副作用的發(fā)生和一些耐藥菌株的出現(xiàn)，同時(shí)還應(yīng)考慮到養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)藥物的耐受能力，合理安排用藥量或者選用一些窄譜抗生素，更加有目的性地對(duì)病原菌進(jìn)行治療，以至于達(dá)到高效、低殘留的目的。近些年來(lái)，羅氏沼蝦大多以工廠化養(yǎng)殖為主，在養(yǎng)殖過(guò)程中，應(yīng)降低養(yǎng)殖密度，定期對(duì)循環(huán)水設(shè)備進(jìn)行維護(hù)，定期監(jiān)測(cè)水體中弧菌總數(shù)的變化，同時(shí)也可在飼料中添加一定量的免疫增強(qiáng)劑來(lái)提高羅氏沼蝦的抗病力。

溶藻弧菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)對(duì)食品衛(wèi)生安全也造成嚴(yán)重的隱患。對(duì)溶藻弧菌病原學(xué)特征和流行病學(xué)的研究，可為養(yǎng)殖場(chǎng)預(yù)防及防治溶藻弧菌提供科學(xué)依據(jù)。

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