L-肉堿在羅非魚體內(nèi)的藥代動力學

羅志遠，周 宇，楊淇齡，黃 凱，唐 笑，武林華

( 1.廣西大學 動物科學技術學院， 廣西 南寧 530000； 2.廣西水產(chǎn)科學研究院， 廣西 南寧 530000； 3.河池市水產(chǎn)畜牧局， 廣西 河池 547000 )

吉富羅非魚(Oreochromisniloticus，GIFT)生長速率快、遺傳性狀穩(wěn)定、出肉率高，我國羅非魚的人工養(yǎng)殖產(chǎn)量已經(jīng)達到世界第一位。肉堿能提高魚類的生產(chǎn)速率，提高成活率，減少脂肪肝的發(fā)生[1]。

目前，國內(nèi)外關于肉堿在人體內(nèi)的藥代動力學研究已有報道[2-4]，且在血液透析患者體內(nèi)L-肉堿水平研究上較為深入[5]。肉堿在水產(chǎn)畜牧飼料中的應用較普遍[6-8]，但肉堿在畜禽及水產(chǎn)動物體內(nèi)的藥代動力學研究鮮有報道。筆者就肉堿經(jīng)口灌給藥的方式下，對相同規(guī)格羅非魚不同劑量肉堿及不同規(guī)格羅非魚體內(nèi)L-肉堿的藥代動力學進行研究，以期為水產(chǎn)飼料中合理添加肉堿提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及設計

試驗對象為吉富羅非魚，由南寧引育種中心提供，不同劑量試驗組中羅非魚體質量為(82.72±3.65) g，不同規(guī)格試驗組中羅非魚體質量分別為(82.72±3.65) g、(413.83±39.92) g，健康無傷病。飼養(yǎng)用水為充分曝氣除氯的自來水，暫養(yǎng)及試驗期間投喂全價顆粒料，日飼量為吉富羅非魚初始體質量的2%，殘餌用虹吸管吸出。試驗期間持續(xù)充氧并對水體進行循環(huán)過濾，每日早晚投喂吉富羅非魚配合飼料各1次，及時吸出殘餌和糞便，每2 d換水1/2。給藥與采樣前 3 d 停飼，處理期間不投喂飼料，持續(xù)保持充氣狀態(tài)。

1.2 試劑及儀器

肉堿標準品(純度99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；魚旺四號(肉堿)(純度10%，杭州天農(nóng)生物營養(yǎng)技術有限公司)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司)；乙腈(色譜純，Merck公司)；三乙胺(色譜純，天津市光復精細化工研究所)；檸檬酸(分析純，天津市大茂化學試劑廠)；磷酸氫二鈉(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；磷酸二氫鉀(分析純，天津市博迪化工股份有限公司)；氧化銀(分析純，天津市科密歐化學試劑研發(fā)中心)；對溴苯乙?；?p-BPB)(阿拉丁公司)；10%四丁基氫氧化銨(國藥集團化學試劑有限公司)；肝素鈉(南京新百藥業(yè)有限公司)。

UltiMate 3000高效液相色譜系統(tǒng) (包括雙泵3200A，手動進樣器 3200，恒溫柱溫箱 330，可見波長檢測器 3400RS)(Chromeleon戴安中國有限公司)；精密電子天平[豪斯儀器(上海)有限公司]；高速臺式離心機(Sigma 公司)；Vortex-Genie 2型漩渦混合器(美國 Scientific Industries公司)；HW-100型恒溫水浴箱(南京泰斯特試驗設備有限公司)；5200DT型超聲清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.3 溶液配制

L-肉堿貯備液：精密稱取肉堿標準品 16.1 mg，10 mL雙蒸水溶解，配制成10 mmol/L的肉堿儲備液，4 ℃保存?zhèn)溆?，以此配制肉堿標準溶液。

衍生劑配制：精確稱取對溴苯乙?；?p-BPB)40 mg于試管中，依次加入乙腈1 mL、10%四丁基氫氧化銨100 μL，充分混勻，注意只能在當日使用，避光存放。蛋白沉淀劑：乙腈∶甲醇=9∶1 (體積比)。

磷酸二氫鉀和氧化銀混合物：磷酸二氫鉀∶氧化銀混合物=9∶1 (質量比)。

檸檬酸緩沖液的配置：稱取1.89 g檸檬酸 (C6H8O7·H2O) 于燒杯中，加入約400 mL超純水溶解混勻后，再加入超純水定容至500 mL。

1.4 給藥與樣品前處理

將試驗魚分為(82.72±3.65) g組和(413.83±39.92) g組，再將(82.72±3.65) g魚隨機分為12 mg/kg劑量組和120 mg/kg劑量組；(82.72±3.65) g規(guī)格120 mg/kg劑量組，按120 mL/kg魚質量劑量灌藥，而(413.83±39.92) g規(guī)格12 mg/kg劑量組，按12 mg/L劑量灌藥。以上3個試驗組每組約有180尾魚。再將每個試驗組分為15個小組，每小組有10尾魚，口腔灌藥給藥。具體操作為：將藥品搖勻后，用長10 cm軟膠管自魚口插入胃中，用注射器將藥物灌入魚胃，無回吐者為試驗對象保留。每組分為15個時間點采樣。給藥前，試驗動物禁食3 d，分別于口灌前(0 h)和給藥后0.083、0.13、0.20、0.25、0.33、0.5、1、2、4、8、12、24、36 h和48 h采樣，用經(jīng)肝素鈉潤洗的注射器自尾靜脈采血1.0 mL，置于含0.1%肝素鈉處理過的離心管中混勻，4000 r/min，離心15 min。分離血漿，置于冰箱中-20 ℃保存?zhèn)錅y。每個時間點6尾魚，做6個平行樣。

1.5 樣品測定方法

取空腹尾脈血3 mL，離心后取上清液300 μL，加1000 μL 10%甲醇—乙腈溶液，混勻后，加入400 mg無水磷酸氫二鈉+氧化銀(9∶1)和400 mg無水磷酸二氫鉀，立即劇烈振搖5 min，8000 r/min離心5 min，吸取上清液600 μL再加入衍生化試劑50 μL混勻后，70 ℃水浴90 min。冷卻后進樣20 μL作HPLC分析。該法的標準曲線的線性范圍是1～400 μmol/L，肉堿衍生物色譜峰面積與待測肉堿的濃度線性關系良好，標準曲線回歸方程為：y=0.08376x+0.09663 (n=6，r2=0.9995)，回收率穩(wěn)定為88.16%～101.48%，平均回收率為95.83%，日內(nèi)變異系數(shù)為1.79%～5.56%，日間變異系數(shù)為9.83%～11.81%。

1.6 色譜條件及數(shù)據(jù)處理

色譜柱： Kromasil Sil 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相配制：乙腈—檸檬酸緩沖液(90∶10，體積比)，每1 L流動相中含有 0.25 mL 三乙胺，在上機前流動相及樣品均用0.45 μm 濾膜減壓過濾；流速1.2 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長260 nm；進樣量20 μL。

試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 11.5 進行平均值和標準差的計算及標準曲線回歸分析，用 Microsoft Office Excel 2003 繪制藥—時曲線，采用WinNonlin 5.2軟件非房室模型統(tǒng)計矩方法計算藥動學參數(shù)和模型擬合。

2 結果與分析

2.1 不同劑量肉堿在吉富羅非魚血漿中的濃度

單次口灌肉堿后，羅非魚血漿中藥物濃度隨時間變化情況見圖1。兩種劑量羅非魚血漿中藥物濃度變化趨勢基本一致，即給藥后藥物濃度迅速上升，0.5 h達最大值；在達最大濃度后至4 h之間，藥物濃度以較大的速率下降，4～12 h藥物濃度下降速率稍慢。在12 h又明顯升高形成第二個峰，至48 h時肉堿濃度分別為1.0 μmol/L和0.73 μmol/L。較高劑量組魚血漿中的藥物濃度高于較低劑量組。

圖1 不同劑量單次口灌給藥后羅非魚體內(nèi)肉堿的藥—時曲線

2.2 不同劑量的肉堿在羅非魚體內(nèi)藥代動力學比較

12 mg/kg和120 mg/kg劑量口灌單次給藥，有關動力學數(shù)據(jù)經(jīng) WinNonlin 5.2 藥代動力學軟件分析非房室模型的統(tǒng)計矩方法得出藥動學參數(shù)(表1)。12 mg/kg劑量的肉堿經(jīng)口灌進入魚體后，迅速進入吸收部位，血藥濃度達峰時間為0.5 h，達峰濃度為21.27 μmol/L。其消除半衰期為8.73 h，魚體對藥物的總清除率為0.10 L/h·kg-1，曲線下面積為 96.95 μmol/h·L-1。120 mg/kg劑量組口灌給藥肉堿的血藥濃度達峰時間、達峰濃度、消除半衰期、表觀分布容積、總體清除率、平均滯留時間分別為0.5 h、82.28 μmol/L、9.71 h、3.90 L/h·kg-1、0.28 L/h·kg-1、12.27 h。由表1可知，120 mg/kg劑量組的達峰濃度、藥時曲線下面積顯著高于12 mg/kg劑量組的達峰濃度和藥時曲線下面積(P<0.05)，兩者清除率和平均滯留時間差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同劑量肉堿單次口灌給藥后在吉富羅非魚體內(nèi)的藥動力學參數(shù)(n=6，平均值±標準差)

2.3 不同規(guī)格吉富羅非魚血漿中肉堿的含量

以相同劑量12 mg/kg的肉堿口灌不同規(guī)格的羅非魚后，羅非魚血漿中藥物濃度隨時間變化情況見圖2。由圖2可知，(82.72±3.65) g魚比(413.83±39.92) g的分布要稍快；(82.72±3.65) g魚0.5 h時到達峰值19.95 μmol/L，而(413.83±39.92) g 0.5 h時達到峰值為(22.38±0.51) μmol/L，(82.72±3.65) g魚峰濃度略低于(413.83±39.92) g；12 h時兩組又形成第二峰，24 h時二者基本處于同一水平，分別為1.73 μmol/L和1.61 μmol/L，以后二者在同一水平上波動下降，至48 h時(82.72±3.65) g和(413.83±39.92) g羅非魚血藥濃度降至1.00 μmol/L和1.05 μmol/L。

圖2 單次口灌給藥后不同規(guī)格羅非魚體內(nèi)肉堿的藥—時曲線

2.4 不同規(guī)格吉富羅非魚血漿中肉堿的藥代動力學比較

采用WinNonlin 5.2 藥代動力學軟件的非房室模型統(tǒng)計矩原理對試驗數(shù)據(jù)進行分析，結果見表2，其中達峰時間、達峰濃度為實測值，藥時曲線下面積用梯形法計算。由表2可知，(413.83±39.92) g魚和(82.72±3.65) g魚的達峰時間相同，(413.83±39.92) g消除相半衰期較長、峰濃度較高；而(82.72±3.65) g魚的表觀分布容積比(413.83±39.92) g大，說明肉堿在(82.72±3.65) g魚體內(nèi)的分布程度比(413.83±39.92) g魚廣泛；(413.83±39.92) g魚清除率低于(82.72±3.65) g魚，(82.72±3.65) g魚的平均滯留時間比(413.83±39.92) g長。

表2 單次口灌給藥后不同規(guī)格羅非魚體內(nèi)肉堿的藥代動力學參數(shù)(n=6，平均值±標準差)

3 討 論

3.1 吉富羅非魚體內(nèi)藥代動力學模型選擇及特征

試驗經(jīng)過WinNonlin 5.2軟件計算，得出統(tǒng)計矩參數(shù)，由于血藥濃度—時間出現(xiàn)明顯的多峰現(xiàn)象，而房室參數(shù)無法滿足肉堿藥代過程中客觀描述的要求，對肉堿藥代過程進行客觀描述，因此本試驗選擇客觀性較強的非房室模型進行分析。在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)肌注和口灌恩諾沙星[9]，硫酸新霉素口灌吉富羅非魚[10]和甲基睪丸酮口灌羅非魚[11]的藥時曲線符合房室模型參數(shù)。而甲磺酸達氟沙星口灌銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[12]，氟苯尼考、氟苯尼考胺口灌及肌注克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[13]和褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)口灌噁喹酸[14]則采用了非房室模型統(tǒng)計矩參數(shù)進行分析，由此可見，藥物種類及研究對象不同影響房室模型的擬合。房室模型擬合的優(yōu)點是將復雜的生物問題簡單化，將其作為一種數(shù)據(jù)分析的手段推導出藥動學參數(shù)，為臨床用藥提供了基本規(guī)律。

本試驗表明，肉堿劑量120 mg/kg時(82.72±3.65) g魚組肉堿在羅非魚體內(nèi)的分布最廣和肉堿在人體內(nèi)(藥時曲線下面積為3738.93 mmol·h/L、2284.27 μmol·h/L)報道不一致[15]，這可能與試驗動物和給藥劑量等有關。

試驗結果表明在口灌給藥的方式下，12 mg/kg劑量(82.72±3.65) g魚組和120 mg/kg劑量(82.72±3.65) g魚組及12 mg/kg劑量(413.83±39.92) g組表觀分布容積為1.29 L/kg、3.9 L/kg、1.08 L/kg，大于1.0 kg/L，說明肉堿有較強的組織穿透性。

口灌給藥下，以相同的劑量給藥，比較肉堿在未成熟(82.72±3.65) g魚和(413.83±39.92) g羅非魚體內(nèi)藥動學差異顯示。試驗結果顯示，(82.72±3.65) g魚和(413.83±39.92) g魚達峰時間均為0.5 h，但(82.72±3.65) g魚消除半衰期、清除率分別為8.73 h、0.10 L/kg·h-1；(413.83±39.92) g魚的半衰期、清除率分別為7.91 h、0.095 L/kg·h-1，可見(413.83±39.92) g魚消除速率較快。筆者認為造成不同規(guī)格羅非魚對肉堿消除速度差異的原因可能是(413.83±39.92) g魚的腎臟排泄功能發(fā)育較未成熟(82.72±3.65) g魚完全，亦或(82.72±3.65) g魚相對于(413.83±39.92) g魚更易受肉堿的影響而使其功能降低，影響肉堿的代謝，消除速度較(413.83±39.92) g魚慢。

本試驗中，以12 mg/kg劑量給羅非魚口服肉堿，消除半衰期為8.73 h，而以120 mg/kg劑量時，消除半衰期為9.71 h；120 mg/kg劑量組的消除半衰期小于12 mg/kg劑量組，這與甲基睪丸酮在羅非魚體內(nèi)的藥代動力學研究結果[16]類似。推測肉堿的劑量影響其在羅非魚體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)。

3.2 消除曲線多峰現(xiàn)象的探討

研究藥物動力學參數(shù)是選擇藥物種類、劑量以及用藥周期重要依據(jù)，對確保人類的健康和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。我國水產(chǎn)動物藥理學研究發(fā)展空間和應用前景較大。

[1] 黃凱,陳濤,戰(zhàn)歌,等.L-肉堿對奧尼羅非魚生長、脂肪含量及血漿相關生化指標的影響[J].上海海洋大學學報,2010,19(2):201-206.

[2] Mendes G D, Zaffalon G T, Silveira A S, et al. Assessment of pharmacokinetic interaction between piracetam and l-carnitine in healthy subjects[J]. Biomed Chromatogr,2016,30(4):536-542.

[3] Dabrowska M, Starek M. Analytical approaches to determination of carnitine in biological materials, foods and dietary supplements[J]. Food Chemistry, 2013,142(3):220-232.

[4] Reuter S E, Evans A M. Carnitine and acylcarnitines pharmacokinetic, pharmacological and clinical aspects[J]. Clinical Pharmacokinetics,2012,51(9):553-572.

[5] 劉惠蘭,張曉潔,曹峰.血液透析患者靜脈應用左旋肉堿(可益能)的藥代動力學研究[J].中國血液凈化,2003,2(6):298-310.

[6] 徐少輝,武書庚,張海軍,等.飼糧中添加L-肉堿對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質及脂質代謝的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報,2011,23(4):640-646.

[7] 柘麗曾,秋鳳,丁雪梅,等.飼糧添加乳化劑與L-肉堿對肉雞生長性能和血脂指標的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報,2012,24(9):1754-1763.

[8] 徐少輝,張亞男,武書庚,等. L-肉堿對飼糧中添加葵花油的產(chǎn)蛋雞抗氧化功能及雞蛋品質的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報，2011，23(7):1201-1208.

[9] 梁俊平,李健,張喆,等.肌注和口服恩諾沙星在大菱鲆體內(nèi)的藥代動力學比較[J].水生生物學報,2010,4(6):1122-1129.

[10] 宋潔,王賢玉,王偉利, 等. 硫酸新霉素在吉富羅非魚體內(nèi)的藥代動力學及休藥期[J]. 中國水產(chǎn)科學,2010,17(3):1358-1363.

[11] 洪二利,鄭光明,孟娣,等. 甲基睪丸酮在羅非魚體內(nèi)的藥代動力學[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報,2011,38(6):911-915.

[12] 艾曉輝,陳正望. 磺胺二甲嘧啶在銀鯽體內(nèi)的藥動學及組織殘留研究[J]. 淡水漁業(yè),2001,31(6):52-54.

[13] 陳文銀,印春華. 諾氟沙星在中華鱉體內(nèi)的藥代動力學研究[J].水產(chǎn)學報,1997,27(3):434-437.

[14] 艾曉輝,陳正望,張春光,等. 喹乙醇在鯉體內(nèi)的藥物代謝動力學及組織濃度[J]. 水生生物學報,2003,27(3):273-277.

[15] 徐洪實,沈蘭貞,梅長林,等. 尿毒癥血透病人靜脈應用左旋卡尼汀的藥代動力學[J]. 中國藥理學通報,1999,15(2):467-469.

[16] 洪二利,鄭光明,孟娣,等.甲基睪丸酮在羅非魚體內(nèi)的藥代動力學[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報,2011,38(6):911-915.

[18] 魏廣力,肖淑華,劉昌孝.愛普斯特在大鼠和犬的藥代動力學[J]. 藥學學報,2000,35(10):721-724.

[19] 馮敬賓,賈曉平. 2種水溫條件下羅非魚體內(nèi)氟苯尼考的藥物動力學比較[J]. 南方水產(chǎn),2008,4(4):49-54.

[20] 楊先樂,湛嘉,胡鯤,等.氯霉素在尼羅羅非魚血漿中的藥代動力學研究[J].水產(chǎn)學報,2005,29(1):61-65.