高脂高糖食物誘導(dǎo)中緬樹鼩肥胖的研究

朱萬龍,侯東敏,左木林,王政昆*

(1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國云南昆明650500;2.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國云南昆明650500)

哺乳動物體內(nèi)脂肪主要分為白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)和褐色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)。WAT和BAT由很多群聚的脂肪細(xì)胞組成,其中結(jié)締組織將這些成團(tuán)的脂肪細(xì)胞分隔成小葉[1]。WAT廣泛分布在動物體內(nèi)[2],主要用于儲存多余的能量,其含量顯著增多是肥胖患者的主要特征[3]。褐色脂肪細(xì)胞(brown adipose cell,BAC)存在于小型哺乳動物和人類嬰兒體內(nèi),一般分布在頸部深處、鎖骨、肩胛、椎體區(qū)、靠近大血管區(qū)域[4]。BAC內(nèi)富含線粒體,通過線粒體解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein-1,UCP1)產(chǎn)生熱量,抵御低溫和肥胖[5],消耗化學(xué)能[6～9]。

“米色脂肪”是在白色脂肪和肌肉中存在的一種誘導(dǎo)性棕色脂肪(inducible BAT),亦稱為beige或brite,米色脂肪細(xì)胞可以表達(dá)產(chǎn)熱基因UCP1,功能上與BAT類似[5]。在特定條件下(如鍛煉或寒冷刺激),米色脂肪細(xì)胞會出現(xiàn)于WAT中[5],該變化稱為WAT的“褐變”。米色脂肪細(xì)胞在接受一定的刺激后可以燃燒脂肪并產(chǎn)熱,再加上成人以米色脂肪為主要產(chǎn)熱脂肪,因此如何激活米色脂肪細(xì)胞并將其作為治療肥胖癥和糖尿病的靶細(xì)胞,已經(jīng)受到越來越多的重視。相關(guān)研究表明人或者動物褐色和米色脂肪細(xì)胞增加的產(chǎn)熱活性一直與肥胖抵抗密切相關(guān)[10～12]。現(xiàn)今,在人類和嚙齒類動物的脂肪研究中已經(jīng)證實(shí),脂肪細(xì)胞表型之間存在“白色-米色-棕色”的相互轉(zhuǎn)化[7,9,13]。

樹鼩被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)列為實(shí)驗(yàn)動物模型,是一種有著蓬松尾巴、形似松鼠的小型哺乳動物。其進(jìn)化程度較高,是除靈長類動物外,在解剖學(xué)、生理學(xué)等方面更接近于人類的動物,因此被醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究者所喜愛,廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究[14]。中緬樹鼩(Tupaia belangeri)屬攀鼩目(Scandentia)樹鼩科(Tupaiidae),是分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)的一種小型哺乳動物。高脂飲食條件下,動物WAT的變化趨勢和規(guī)律與人類相似[5];現(xiàn)已在人體內(nèi)證實(shí)了存在和BAT類似的棕色脂肪組織,但是活性在成年人體內(nèi)不強(qiáng)[11];有研究證明冷馴化可以刺激人體內(nèi)BAT的活性,當(dāng)然,食物也可以誘導(dǎo)動物的BAT產(chǎn)熱[12]。本研究通過測定體重、脂肪組織質(zhì)量和血液指標(biāo)等,研究中緬樹鼩在高脂高糖食物條件下生理上的變化,再利用流式細(xì)胞術(shù)和正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission tomography/computed tomography,PET/CT)掃描成像來探究食物誘導(dǎo)條件下中緬樹鼩是否會出現(xiàn)肥胖抵抗現(xiàn)象,以期為食物誘導(dǎo)中緬樹鼩肥胖的研究提供一些基礎(chǔ)生理學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)用中緬樹鼩30只,雌雄各半,普通級,均是非繁殖期成年個(gè)體,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長類研究中心。動物在云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物飼養(yǎng)房單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)籠的長×寬×高規(guī)格:120 mm×200 mm×300 mm。適應(yīng)一個(gè)月后,30只中緬樹鼩隨機(jī)分為3組:10只(5 ,5♀)為對照組(0 d);10只(5 ,5♀)為食物誘導(dǎo)28 d組(28 d);10只(5 ,5♀)為食物誘導(dǎo)49 d組(49 d),置于溫度為25±1℃,濕度為60%～70%,光暗周期為12 h∶12 h條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前,3組動物的體重差異不顯著(P＞0.05),平均體重為96.35±1.27 g。對照組采用標(biāo)準(zhǔn)食物飼喂,食物誘導(dǎo)28 d組與49 d組均采用高脂高糖食物喂養(yǎng)。飼料配方見表1。

1.2 體重、WAT質(zhì)量和含量測定

對照組動物的體重于0 d、28 d和49 d進(jìn)行測定,食物誘導(dǎo)28 d組和49 d組動物的體重于28 d和49 d進(jìn)行測定。28 d高脂高糖食物組動物于實(shí)驗(yàn)28 d時(shí)處死,對照組和49 d高脂高糖食物組動物于實(shí)驗(yàn)49 d時(shí)處死,用索氏抽提法(浸提儀SoxtecTM2043購自丹麥Foss公司)測量動物的體脂質(zhì)量[15],最后計(jì)算出體脂含量,體脂含量=脂肪質(zhì)量/體重[16]。

表1 飼養(yǎng)食物組成成分(占干物質(zhì)質(zhì)量的百分比)Table1 Compositions of standard and high-fat diets(the percentage of dry matter mass)

1.3 血液指標(biāo)測定

對照組和49 d高脂高糖食物組于實(shí)驗(yàn)49 d進(jìn)行空腹采血(禁食12 h),全血用凝集管收取,進(jìn)行血常規(guī)檢測,離心分離血清進(jìn)行生化指標(biāo)檢測。血液指標(biāo)的測定由云南醫(yī)科大學(xué)完成。

1.4 流式細(xì)胞分析

1)樹鼩斷頸處死后用鑷子取下腹部大網(wǎng)膜WAT與肩胛間BAT,放于裝有PBS的培養(yǎng)皿中。

2)將培養(yǎng)皿中的WAT和BAT組織放入2 mL EP管中,加入1 mL 0.1%的I型膠原酶,剪碎組織;隨后轉(zhuǎn)至15 mL離心管,再加入3 mL 0.1%的I型膠原酶,搖勻后于37℃恒溫水浴鍋中放置1 h,其間每10 min搖勻一次。

3)吸取1 mL 0.1%的I型膠原酶,使用細(xì)胞過濾篩過濾。然后分別將WAT和BAT細(xì)胞液吸取入1.5 mL離心管中,1 000 r/min離心10 min。棄上清,加入1 mL PBS,吹吸混勻,1 000 r/min離心10 min。棄上清,加入1 mL PBS,吹吸混勻后靜置,直至細(xì)胞濾液清澈,隨后用4%多聚甲醛進(jìn)行固定。固定后的細(xì)胞濾液-4℃冰箱保存不超過24 h。

4)WAT分為3組進(jìn)行流式細(xì)胞分析:第1組加入Ⅰ抗UCP1與Ⅱ抗,標(biāo)記UCP1陽性細(xì)胞;第2組加入Ⅰ抗CD137與Ⅱ抗,標(biāo)記米色脂肪細(xì)胞;第3組為對照,加入Ⅱ抗。BAT分為2組進(jìn)行流式細(xì)胞分析:第1組加入Ⅰ抗UCP1與Ⅱ抗,標(biāo)記UCP1陽性細(xì)胞;第2組為對照,加入Ⅱ抗。流式細(xì)胞分析具體步驟:細(xì)胞濾液于1 000 r/min離心10 min,吸取上清液,加入200 μL 0.1%的Triton X-100,靜置5 min;1 000 r/min離心 10 min,去除Triton X-100,加入200 μL PBS,吹吸混勻;在WAT和BAT實(shí)驗(yàn)組1中加入0.5 μL I抗UCP1(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,美國),在WAT實(shí)驗(yàn)組2中加入0.5 μL I抗CD137(Ray-Biotech公司,美國),吹吸混勻,靜置40 min～1 h;1 000 r/min離心 10 min,去除 PBS,再加 200 μL PBS,1 000 r/min離心10 min,去除PBS,再加入1 000 μL PBS,吹吸混勻后,加入0.5 μL Ⅱ抗免疫熒光,靜置40 min～1 h;1 000 r/min離心10 min,去除PBS,再加200 μL PBS,1 000 r/min離心10 min,去除PBS,再加入1 000 μL PBS。WAT實(shí)驗(yàn)組3和BAT實(shí)驗(yàn)組2中加入0.1%的Triton X-100 200 μL,靜置 40 min～1 h,1 000 r/min 離心 10 min,去除Triton X-100,加入200 μL PBS,吹吸混勻,加入0.5 μLⅡ抗,用錫箔紙將離心管包裹避光,輕輕彈離心管,吹吸混勻,靜置40 min～1 h,1 000 r/min離心10 min,去除PBS,再加入1 000 μL PBS。最后采用流式細(xì)胞分析儀(Guava公司,美國)進(jìn)行檢測。

1.5 PET/CT掃描成像

首先是18氟-氟化脫氧葡萄糖(18-fluoro-fluorodeoxyglucose,18F-FDG)注射:用剃毛器將尾部毛發(fā)剃凈,然后用500 μL注射器吸取18F-FDG,注射入中緬樹鼩尾部靜脈。注射40 min后用1 000 μL注射器吸取200 μL濃度為2%的戊巴比妥鈉麻醉樹鼩(5 min左右動物即可被麻醉)。將中緬樹鼩四肢放入固定板的固定繩中進(jìn)行固定,在其麻醉無意識狀態(tài)下進(jìn)行PET/CT掃描(GE公司,美國),共掃描5 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)分布和方差齊次性檢驗(yàn),符合參數(shù)檢驗(yàn)條件。對照組中緬樹鼩的體重在0 d、28 d和49 d時(shí)差異不顯著,因此在分析時(shí)合并。中緬樹鼩體重、WAT質(zhì)量和含量采用單因素方差分析(One Way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對照組、28 d實(shí)驗(yàn)組、49 d實(shí)驗(yàn)組中緬樹鼩的肩胛和腹股溝所采集的圖像使用軟件IRW(Inveon Research Workplace)進(jìn)行分析,分別計(jì)錄各部位的平均輻射值(standardized uptake value,SUV),并進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±sx)表示。P＜0.05 代表差異顯著;P＜0.01代表差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 體重、WAT質(zhì)量和含量

28 d組和49 d組中緬樹鼩體重分別與對照組相比增加了36.61%和53.87%(圖1)。高脂高糖食物組28 d時(shí)中緬樹鼩WAT質(zhì)量是對照組的3.7倍,49 d組中緬樹鼩WAT質(zhì)量是對照組的6.4倍(圖2)。28 d組中緬樹鼩體脂含量是對照組的2.7倍,49 d組中緬樹鼩體脂含量是對照組的3.2 倍(圖3)。

圖1 高脂高糖食物條件下中緬樹鼩體重的變化Fig.1 Changes of body mass in T.belangeri during highglucose-fat diet acclimation

2.2 血液指標(biāo)

49 d實(shí)驗(yàn)組中,中緬樹鼩的血糖水平極顯著高于對照組(P＜0.01),甘油三酯含量顯著高于對照組(P＜0.05),高密度脂蛋白含量顯著低于對照組(P＜0.05),總膽固醇含量極顯著高于對照組(P＜0.01)(表2)。與此同時(shí),49 d實(shí)驗(yàn)組的白細(xì)胞、血紅蛋白以及紅細(xì)胞與對照組相比均無顯著差異,但血小板水平極顯著高于對照組(P＜0.01)(表2)。

圖2 高脂高糖食物條件下中緬樹鼩WAT質(zhì)量的變化Fig.2 Changes of WAT mass in T.belangeri during high-glucose-fat diet acclimation

圖3 高脂高糖食物條件下中緬樹鼩WAT含量的變化Fig.3 Changes of WAT content in T.belangeri during high-glucose-fat diet acclimation

2.3 流式細(xì)胞分析結(jié)果

對照組中緬樹鼩腹部WAT利用UCP1抗體標(biāo)記,R2群標(biāo)記陽性為1.68%;高脂高糖食物28 d組樹鼩腹部WAT被UCP1抗體標(biāo)記后,有36.33%的細(xì)胞為陽性;高脂高糖食物49 d組樹鼩腹部WAT被UCP1抗體標(biāo)記后細(xì)胞陽性為3.74%(圖4)。利用CD137抗體標(biāo)記對照組中緬樹鼩腹部WAT,R2群標(biāo)記陽性為0.55%;高脂高糖食物28 d組樹鼩腹部WAT被CD137抗體標(biāo)記后,有4.51%的細(xì)胞為陽性;高脂高糖食物49 d組樹鼩腹部WAT被CD137抗體標(biāo)記后細(xì)胞陽性為0.84%(圖5)。對照組中緬樹鼩肩胛BAT的R2群用UCP1抗體標(biāo)記后,有3.54%的細(xì)胞顯示為陽性;高脂高糖食物誘導(dǎo)28 d時(shí),中緬樹鼩肩胛BAT中R2群被UCP1抗體標(biāo)記的陽性細(xì)胞為36.33%;高脂高糖食物誘導(dǎo)49 d組的R2群用UCP1抗體標(biāo)記后,有13.34%的細(xì)胞顯示為陽性(圖6)。

表2 中緬樹鼩血糖血脂生化指標(biāo)和血常規(guī)指標(biāo)檢測結(jié)果Table2 The detection results of blood glucose,lipid biochemical indexes and blood routine indexes in T.belangeri

圖4 中緬樹鼩腹部皮下WAT流式分析圖(抗體:UCP1)Fig.4 The flow cytometric analysis diagram of WAT in T.belangeri abdomen(Antibody:UCP1)

2.4 PET/CT掃描成像結(jié)果

圖5 中緬樹鼩腹部皮下WAT流式分析圖(抗體:CD137)Fig.5 The flow cytometric analysis diagram of WAT in T.belangeri abdomen(Antibody:CD137)

圖6 中緬樹鼩腋下BAT流式分析圖(抗體:UCP1)Fig.6 The flow cytometric analysis diagram of BAT in T.belangeri armpit(Antibody:UCP1)

食物誘導(dǎo)28 d組中緬樹鼩腹部WAT的18FFDG吸收60 min后,平均輻射值SUV是對照組的2.4倍,49 d組平均輻射值SUV是對照組的1.2倍。食物誘導(dǎo)28 d組中緬樹鼩腹股溝WAT中出現(xiàn)FDG藥物吸收的增加,說明其代謝增強(qiáng)(圖7)。食物誘導(dǎo)28 d組中緬樹鼩肩胛BAT的18F-FDG吸收60 min后,平均輻射值SUV是對照組的5.3倍,49 d組平均輻射值SUV是對照組的2.6倍,提示食物誘導(dǎo)28 d時(shí)中緬樹鼩肩胛BAT活性增強(qiáng)(圖8)。

圖7 中緬樹鼩WAT FDG攝取分布圖Fig.7 The distribution of FDG in WATs of T.belangeri

圖8 中緬樹鼩BAT FDG攝取分布圖Fig.8 The distribution of FDG in BATs of T.belangeri

3 討論

產(chǎn)生肥胖的因素很多,人類的肥胖與高脂、高糖這些高熱量的食物有關(guān)[17]。由于高脂高糖飲食誘導(dǎo)動物模型的肥胖與人類肥胖的形成相似,所以目前常用高脂食物育肥法建立動物肥胖模型[12]。本研究利用高脂高糖食物構(gòu)建中緬樹鼩肥胖模型,數(shù)據(jù)顯示中緬樹鼩隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長體重顯著增加,在28 d時(shí),體重差異達(dá)到極顯著水平。先前的研究結(jié)果表明,中緬樹鼩在季節(jié)性或者不同溫度光照條件下,其體重的增加可能和WAT質(zhì)量的增加有關(guān)[14]。本研究的結(jié)果表明中緬樹鼩在高脂高糖食物作用下其體重的增加也可能與WAT質(zhì)量的增加有關(guān),28 d組和49 d組中緬樹鼩的體脂質(zhì)量和含量與對照組相比均是差異極顯著,這可能說明高糖高脂食物可以顯著增加中緬樹鼩的體重,使其出現(xiàn)肥胖特征。此外,評價(jià)人類或者動物是否出現(xiàn)肥胖的血液指標(biāo)有葡萄糖(GLU)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等[18]。本研究結(jié)果表明49 d組中緬樹鼩的血糖水平、甘油三酯和總膽固醇含量顯著高于對照組,而高密度脂蛋白含量顯著低于對照組。甘油三酯含量過高或高密度脂蛋白含量過低,均表明中緬樹鼩的血脂出現(xiàn)異常。以上血液指標(biāo)差異說明中緬樹鼩在長期的高脂高糖飲食條件下血糖血脂發(fā)生了改變,已經(jīng)出現(xiàn)了肥胖的相關(guān)癥狀。

Barbatelli等[19]將小鼠進(jìn)行冷暴露處理,發(fā)現(xiàn)冷馴化下小鼠體內(nèi)白色脂肪細(xì)胞的C/EBP α基因表達(dá)增加,但是與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)的基因卻基本維持穩(wěn)定水平,同時(shí)結(jié)合米色脂肪組織超顯微結(jié)構(gòu)結(jié)果,證實(shí)冷馴化可以誘導(dǎo)WAT中出現(xiàn)米色脂肪細(xì)胞。而Tim等[20]利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),他們分選出的前體骨骼肌細(xì)胞可以用藥物誘導(dǎo)分化成米色脂肪細(xì)胞。此外,有研究通過PET/CT掃描發(fā)現(xiàn),冷暴露處理后成人體內(nèi)鎖骨上部區(qū)域BAT的FDG吸收顯著增加[21];冷暴露2 h后,實(shí)驗(yàn)人群中BAT的存在比例也顯著升高[22];還有研究表明BAT的活性在寒冷季節(jié)(1～3月,13.7%)較溫暖季節(jié)(4～12 月,4.1%)更加活躍[23]。本研究中流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明,高脂高糖食物誘導(dǎo)使中緬樹鼩WAT在28 d時(shí)UCP1和CD137表達(dá)陽性的細(xì)胞群增多,而在49 d表達(dá)陽性的細(xì)胞群減少,這可能說明高脂高糖食物可以誘導(dǎo)中緬樹鼩WAT在28 d時(shí)出現(xiàn)米色脂肪細(xì)胞,米色脂肪細(xì)胞或UCP1蛋白的表達(dá)可以短時(shí)間產(chǎn)生肥胖抵抗的現(xiàn)象[19,20,24]。而在BAT細(xì)胞中,食物誘導(dǎo)同樣使BAT在28 d時(shí)UCP1表達(dá)陽性的細(xì)胞群增多,說明食物可以誘導(dǎo)BAT產(chǎn)熱的增加,同樣出現(xiàn)了抵抗肥胖現(xiàn)象。PET/CT掃描結(jié)果顯示,WAT在28 d時(shí)18F-FDG吸收增強(qiáng),這可能是中緬樹鼩WAT中產(chǎn)生了米色脂肪細(xì)胞或褐色脂肪細(xì)胞導(dǎo)致[11,21,23,25,26]。但是隨著時(shí)間的延長,中緬樹鼩的肥胖抵抗現(xiàn)象減弱。

綜上所述,高糖高脂食物可以顯著增加中緬樹鼩WAT的質(zhì)量,而流式細(xì)胞檢測和PET/CT掃描成像研究結(jié)果說明中緬樹鼩在肥胖的過程中,28 d時(shí)會出現(xiàn)肥胖抵抗的現(xiàn)象,但是隨著時(shí)間的延長,該抵抗現(xiàn)象逐漸減少。

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