用于植物基因表達載體構建的質粒改造及其應用

安韶雅,虎 娟,張 虹,孫 放,馬 霞,王 晨,陳 任

(1.寧夏大學寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室,中國寧夏銀川750021;2.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室,中國寧夏銀川750021;3.寧夏大學生命科學學院,中國寧夏銀川750021)

自1984年首次獲得轉基因煙草[1]以來,以轉基因技術為代表的植物基因工程技術的廣泛應用為植物的遺傳改良開拓了廣闊的前景。轉基因技術通過將人工分離和修飾過的基因(包括來源于不同物種甚至人工合成的基因)導入到生物體基因組后,借助導入基因的表達,引起生物體性狀發(fā)生可遺傳的改變,在一定程度上有效提高目標性狀改良的效率和準確性,從而實現(xiàn)由表型選擇到基因型選擇的過渡,大大加快了新品種培育進程。

在基因工程的研究與應用過程中,基因克隆、載體構建是必需的常規(guī)步驟。采用合適的表達載體和構建方法會使實驗效果事半功倍。但是,目前常用于植物基因表達載體構建的質粒載體,如pBIN19[2]、pBI121[3]、pIG121-Hm[4]、pMSIsGFP[5]和pCAMBIA系列[6]等,由于其T-DNA區(qū)段中限制性內切酶位點有限,外來基因片段難于插入和連接,有時還需要構建多個中間載體,操作比較麻煩,而且這些經典的質粒載體,有些只限于在研究者同行間互相轉讓,沒有商業(yè)化;有些由于專利限制,只能在研究和實驗等非經營目的的小范圍內使用,基因轉化后的新品種(系)無法在生產上推廣應用。因此建立一個簡單高效的、專門用于植物基因表達載體構建的質粒載體具有現(xiàn)實意義。

為解決上述問題,本研究利用實驗室現(xiàn)有的經大腸桿菌(Escherichia coli)質粒pUC18[7]改造的pKAFCR1和經雙核農桿菌 (Agrobacterium tumefa ciens)Ti(tumor inducing)質粒pBI121改造的pKAFCR100兩種質粒[8],在pKAFCR1的CaMV 35S啟動子(cauliflower mosaic virus 35S promoter)和NOS終止子(nopaline synthase terminator)之間,引入多克隆酶切位點MCS(multiple cloning site),然后將包含35S-MCS-NOS的片段切下來連接到pKAFCR100,使其成為一個用于構建植物基因表達的質粒載體pNULPGE200。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

pKAFCR1和pKAFCR100質粒(寧夏大學植物基因工程研究室,專利號CN201610767834.4)[8];LB培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司);植物生長調節(jié)劑、抗生素和MS培養(yǎng)基等(Sigma-Aldrich公司,美國);各種限制性內切酶(Takara公司,日本);凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit、PCR產物純化試劑盒QIAquick PCR Purification Kit、質粒提取試劑盒QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司,德國);質粒連接試劑盒Ligation High Kit、DNA平滑化試劑盒Blunting High Kit(Toyobo公司,日本);植物基因組DNA提取試劑盒Plant Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司);PCR試劑盒Ex-Taq PCR(Takara公司,日本);大腸桿菌DH5α、農桿菌EHA105感受態(tài)細胞(上海邁其生物科技有限公司)。

1.2 pKAFCR1質粒多克隆酶切位點MCS的改造

利用限制性內切酶XbaI和SacI對pKAFCR1進行雙酶切處理;經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后,切取目的條帶,通過凝膠回收試劑盒回收獲得已切除XbaI-SacI小部分的pKAFCR1。人工合成兩條單鏈DNA(CR1 MCS Adapter-S、CR1 MCS Adapter-A,表1),采用溫度梯度退火法使兩條單鏈DNA構成一條雙鏈DNA接頭,該接頭含有限制性內切酶XbaI、HpaI、PacI、SmaI(XmaI)、StuI、KpnI、XhoI 和SacI位點;利用質粒連接試劑盒將該接頭與切除XbaI-SacI小部分的pKAFCR1進行連接;利用熱激法將連接后的重組質粒轉化到大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞中;將轉化后的大腸桿菌平涂于含有25 mg/L青霉素的LB固體培養(yǎng)基上,37℃黑暗培養(yǎng)12 h后,挑取單獨菌落進行菌落PCR鑒定(采用CR1 35SHind-S、CR1 MCS Adapter-A,CR1 35SHind-S、CR1 NOSEcoR-A引物,表1),篩選含有重組質粒的陽性菌落;利用質粒提取試劑盒提取重組質粒DNA,將該重組質粒命名為pKAFCR1+MCS。利用M13-F、M13-R引物(表1)對該重組質粒進行雙向測序驗證。

1.3 pNULPGE200質粒載體的構建

利用限制性內切酶HindⅢ和StuI,對pKA-FCR100進行雙酶切處理。通過凝膠電泳分離、回收,獲得雙酶切后的pKAFCR100;同樣利用限制性內切酶HindⅢ和PvuⅡ,對pKAFCR1+MCS進行雙酶切處理,通過凝膠電泳分離、回收后獲得包含35S-MCS-NOS片段。利用質粒連接試劑盒將35S-MCS-NOS片段與酶切后的pKAFCR100進行連接、大腸桿菌轉化,用含有50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基篩選,菌落PCR鑒定(采用CR100 Hind35SS、CR100 omega-A,CR100 Hind35S-S、CR1 Adapter-A,GFP-F、GFP-R,NPT-F、NPT-R引物,表1)。將所獲重組質粒命名為pNULPGE200。利用CR100 Hind35S-S、CR100 omega-A 引物(表1)對pNULPGE200進行雙向測序驗證。

1.4 pNULPGE200在植物基因表達載體構建中的應用

參照NCBI等數據庫公開的假單胞菌(Pseudomonas putida)攜帶質粒的二甲苯單加氧酶(xylene monooxygenase,PpXylM+XylA)編碼基因(E02361)的序列,經密碼子優(yōu)化后人工合成DNA片段(2 312 bp),同時在5’和3’端分別引入PacI和KpnI酶切位點序列(共2 326 bp)。利用限制性內切酶PacI和KpnI,對pNULPGE200和人工合成DNA片段進行雙酶切處理,凝膠電泳分離回收后進行連接、大腸桿菌轉化、卡那霉素篩選和菌落PCR鑒定(采用 PpXylM-S、PpXylA-A,GFP-F、GFP-R,NPT-F、NPT-R引物,表1),將獲得的基因表達載體命名為pNULPGE04101。

為了對比實驗,以同樣方法,首先將經PacI和KpnI雙酶切處理后的人工合成PpXylM+XylA基因片段(共2 326 bp)與同樣酶切的pKAFCR1+MCS(3 793 bp)進行連接,構建一個過渡載體,使PpXylM+XylA基因片段的上下游分別加上35S和NOS。然后利用限制性內切酶PvuⅡ處理,切下含有35S-PpXylM+XylA-NOS的片段,與經限制性內切酶SbfI單酶切、DNA平滑化試劑盒處理的pBI121[3]連接,獲得的對照載體命名為pBI121-PpXylM+XylA。利用 PpXylM-SS、PpXylM-SA 引物(表1)對 pNULPGE04101、pBI121-PpXylM+XylA進行雙向測序驗證。

利用質粒提取試劑盒分別從大腸桿菌DH5α提取pNULPGE04101和pBI121-PpXylM+XylA兩種載體DNA,分別取適量(＜1 μg)并利用熱激法轉化到農桿菌EHA105菌株的感受態(tài)細胞中,同樣進行菌落PCR鑒定后,保存陽性菌液。陽性菌液可以用于植物基因轉化。

以上所有具體操作步驟均按照試劑盒的使用說明進行。

1.5 pNULPGE200構建的基因表達載體在植物基因轉化中的應用

以實驗室培育的白色矮牽牛(Petunia hybrid)無菌苗的葉片為材料,用含有上述構建的質粒pNULPGE04101以及對照質粒pBI121-PpXylM+XylA的農桿菌EHA105進行基因轉化。選用長勢良好的葉片,切成約5 mm大小的方塊,在OD550=0.25濃度的農桿菌中侵染,于22℃、黑暗條件下共培養(yǎng)3 d后,移至 25 ℃、有效光量子密度 30 μmol/(m2·s)、光照16 h/d條件下進行愈傷組織、不定芽、不定根誘導和篩選(表2),培育轉基因植株。農桿菌感染、基因轉化、sGFP熒光觀察和GUS(β-glucuronidase)分析等操作均按照實驗室以往的方法[9,10]進行。采取各轉基因植株的葉片80～100 mg,利用植物基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA,進行PCR鑒定,采用 PpXylM-S、PpXylA-A 為引物(表1)。

2 結果與分析

2.1 pKAFCR1質粒多克隆酶切位點MCS的改造及鑒定

pKAFCR1(3 796 bp)經XbaI和SacI雙酶切處理后,凝膠電泳分離回收獲得已切除XbaISacI(1 265～1 294)部分的 pKAFCR1(3 766 bp,圖1A)。將其與人工合成DNA接頭(48 bp)連接形成的重組質粒pKAFCR1+MCS(3 814 bp)轉化到大腸桿菌后,經菌落PCR鑒定,確認電泳條帶正確(954 bp,1 243 bp,圖1B),說明人工合成DNA接頭已連接到pKAFCR1的XbaI-SacI酶切位點。

利用M13-F和M13-R引物對重組質粒pKAFCR1+MCS進行雙向測序鑒定,結果表明上述構建連接正確。這樣構建形成的pKAFCR1+MCS在35S啟動子與NOS終止子之間加入了XbaI、HpaI、PacI、SmaI(XmaI)、StuI、KpnI、XhoI 和SacI多克隆酶切位點MCS(圖2)。

2.2 pNULPGE200質粒載體的構建及鑒定

pKAFCR100(13 221 bp)經HindⅢ和StuI雙酶切處理后,凝膠電泳分離回收獲得已切除HindⅢ-StuI小部分的pKAFCR100(13 206 bp,圖3A);pKAFCR1+MCS(3 814 bp)經HindⅢ和PvuⅡ雙酶切處理,凝膠電泳分離回收獲得包含35SMCS-NOS的片段(1 358 bp,圖3B);將回收獲得的pKAFCR100與35S-MCS-NOS片段連接后形成的重組質粒pNULPGE200(14 564 bp)轉化到大腸桿菌,經菌落PCR鑒定,確認電泳條帶正確(1 857 bp、963 bp、611 bp、776 bp,圖3C),說明 pKAFCR1+MCS的35S-MCS-NOS片段已插入到pKAFCR100的HindⅢ-StuI酶切位點。

表1 各種PCR引物和DNA接頭Table1 Primers and adapters

圖1 pKAFCR1質粒酶切以及pKAFCR1+MCS質粒構建后的菌落PCR鑒定Fig.1 Restriction digestion of pKAFCR1 and colony PCR for identification of the constructed pKAFCR1+MCS plasmid

利用 CR100 Hind35S-S、CR100 omega-A 引物對pNULPGE200進行雙向測序鑒定,結果表明上述構建連接正確。這樣構建形成的pNULPGE200具有35S-MCS-NOS,經PCR等方法克隆得到的目的基因可以多種方式很方便地連接到35S啟動子與NOS終止子之間,使目的基因能夠在植物體內穩(wěn)定表達;該質粒載體同時還具有獨立表達的卡那霉素NPTⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)耐性基因和sGFP(synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)綠色熒光蛋白報告基因,可用于基因轉化時的篩選(圖4)。

2.3 pNULPGE200在植物基因表達載體構建中的應用

為了驗證文中所構建的pNULPGE200的使用效果,以假單胞菌攜帶質粒的二甲苯單加氧酶編碼基因(PpXylM+XylA)片段為材料進行了基因表達載體的構建實驗。pNULPGE200(14 564 bp)經PacI和KpnI雙酶切(14 544 bp)后,與同樣酶切處理的PpXylM+XylA(2 320 bp)片段進行連接,轉化大腸桿菌。經菌落PCR鑒定,確認電泳條帶正確(2 333 bp、611 bp和776 bp,圖5),說明該基因片段已正確連接到pNULPGE200的35S啟動子與NOS終止子之間的PacI和KpnI酶切位點上。這樣獲得的基因表達載體pNULPGE04101(16 865 bp,圖6),其目的基因的上游和下游分別連接了啟動子和終止子,轉化到農桿菌后可用于植物基因轉化、目的基因功能研究等。

與pNULPGE200相比,目的基因構建到對照載體pBI121比較麻煩,因為pBI121在目的基因插入的多克隆酶切位點的上下游缺少目的基因獨立表達的啟動子和終止子。首先,PpXylM+XylA基因片段經PacI和KpnI雙酶切后(2 320 bp),與經同樣酶切的過渡載體pKAFCR1+MCS(3 793 bp)進行連接,在上下游分別加上35S啟動子和NOS終止子。然后,利用PvuⅡ切下含有35S-PpXylM+XylA-NOS的片段(3 769 bp),將該片段與經限制性內切酶SbfI單酶切、DNA平滑化試劑盒處理的pBI121(14 587 bp)連接,構建成對照載體pBI121-PpXylM+XylA(圖7)。經雙向測序驗證,確定pNULPGE04101、pBI121-PpXylM+XylA構建正確。

圖3 pKAFCR100和pKAFCR1+MCS質粒酶切以及pNULPGE200質粒構建后的菌落PCR鑒定Fig.3 Restriction digestion of pKAFCR100 and pKAFCR1+MCS and colony PCR for identification of the constructed pNULPGE200 plasmid

圖4 pNULPGE200質粒的T-DNA區(qū)段及多克隆酶切位點Fig.4 The T-DNA region and the multiple cloning sites of pNULPGE200 plasmid

圖5 pNULPGE04101基因表達載體構建后的菌落PCR鑒定Fig.5 Colony PCR for identification of the constructed gene expression vector pNULPGE04101

2.4 pNULPGE200構建的基因表達載體在植物基因轉化中的應用

用含有基因表達載體pNULPGE04101以及對照載體pBI121-PpXylM+XylA的農桿菌EHA105對矮牽牛無菌苗的葉片外植體進行基因轉化。經侵染、共培養(yǎng)、愈傷組織和不定芽的誘導與篩選后,15 d左右部分葉片切口部位開始膨脹變大,隨后生成愈傷組織。30 d后,愈傷組織表面陸續(xù)形成芽點,這些芽點逐漸發(fā)育成為不定芽。不定芽伸長后,繼而進行不定根誘導以生成完整植株。再生植株經基因組PCR鑒定,證實構建到基因表達載體pNULPGE04101以及對照載體pBI121-PpXylM+XylA的T-DNA區(qū)段的PpXylM+XylA基因已經導入到矮牽牛轉基因植株(圖8)。整個分化過程中,在抗生素(卡那霉素)篩選的同時,利用sGFP熒光和GUS染色分別對經農桿菌EHA105/pNULPGE04101以及對照EHA105/pBI121-PpXylM+XylA基因轉化后外植體形成的愈傷組織、不定芽和不定根等進行觀察分析(圖9)。由于經pNULPGE04101轉化后分化出的組織細胞活體可以利用熒光顯微鏡進行判斷,特別是在愈傷組織階段,有熒光的部分切下繼續(xù)培養(yǎng),沒有熒光的部分淘汰,因此篩選比較有效。而pBI121-PpXylM+XylA轉化后分化出的愈傷組織經GUS染色后細胞即失去活性。檢測結果顯示,pNULPGE04101的基因轉化效率(PCR陽性植株/外植體×100%)為29%,明顯高于pBI121-PpXylM+XylA的基因轉化效率7%。

3 討論

本研究利用實驗室現(xiàn)有的pKAFCR1和pKAFCR100兩種質粒[8],經改造構建了一個用于植物基因表達載體構建的質粒載體pNULPGE200。利用該質粒載體構建植物基因表達載體,具有簡便和高效等優(yōu)點。

pNULPGE200質粒因為引入了植物基因表達最常用的35S啟動子和NOS終止子,以及之間的多個克隆酶切位點 MCS(HpaI、PacI、SmaI(XmaI)、StuI、KpnI、XhoI 和SacI),克服了目前常用于植物基因表達載體構建的質粒載體(如pBIN19[2]、pBI121[3]、pIG121-Hm[4]、pMSIsGFP[5]和 pCAMBIA 系列[6]等)的一些缺點,包括:目的基因插入的多克隆酶切位點有限;上下游缺少目的基因獨立表達的啟動子和終止子,需要預先把目的基因克隆到一個過渡載體,連接上35S和NOS后再亞克隆到基因表達載體;操作麻煩等。對于本研究構建的pNULPGE200質粒,利用PCR等方法克隆得到的目的基因片段可直接連接到pNULPGE200的35S啟動子與NOS終止子之間,從而構建成為在植物體內能夠獨立表達的載體。由于pNULPGE200質粒的 MCS 既有粘性末端(PacI、XmaI、KpnI、XhoI和SacI)也有平滑末端(HpaI、SmaI和StuI)酶切位點,目的基因在PCR擴增(或人工合成)時,可以通過正反向引物的5′端(或兩端)分別引入這些粘性末端或平滑末端酶切位點,與經同樣酶切后的pNULPGE200進行連接;或者利用有些DNA聚合酶(如Phusion高保真DNA聚合酶)在PCR擴增后能夠產生平滑末端產物的特點,可以直接與經平滑末端酶切(HpaI、SmaI或StuI中一種)后的pNULPGE200進行連接。

圖6 pNULPGE04101基因表達載體的T-DNA區(qū)段Fig.6 The T-DNA region of pNULPGE04101 gene expression vector

圖7 pBI121-PpXylM+XylA基因表達載體的T-DNA區(qū)段Fig.7 The T-DNA region of pBI121-PpXylM+XylA gene expression vector

圖8 矮牽?；蜣D化植株的PCR分析Fig.8 PCR analysis of transgenic P.hybrid plantlets

圖9 矮牽?；蜣D化植株的再生及各階段sGFP和GUS基因表達Fig.9 Regeneration of transgenic P.hybrid plants and monitoring of sGFP and GUS expressions at different developmental stages

另外,pNULPGE200還包含獨立表達的卡那霉素NPTⅡ耐性基因和sGFP綠色熒光蛋白報告基因,外植體經農桿菌侵染后的整個分化過程中,可以利用添加有卡那霉素的培養(yǎng)基進行篩選,也可以利用熒光顯微鏡進行判斷和觀察,篩選效果比較好。再者,pNULPGE200在目的基因插入的35S啟動子和NOS終止子的上游和下游、NPTⅡ抗生素耐性基因和sGFP綠色熒光蛋白報告基因前后均有酶切位點,可以根據實驗需要選擇更合適的基因元件對其進行更換。

為了驗證所構建的pNULPGE200質粒的使用效果,我們以假單胞菌攜帶質粒的二甲苯單加氧酶編碼基因PpXylM+XylA片段為材料,經酶切后直接構建了可用于植物基因轉化的表達載體pNULPGE04101。與利用pBI121構建植物基因表達載體需要克隆到一個過渡載體,然后再亞克隆相比,更簡單高效。此外,該表達載體pNULPGE-04101經農桿菌介導法轉化矮牽牛葉片后,獲得了轉基因植株,其基因轉化效率也明顯高于由pBI121構建的基因表達載體。

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