苦參素對大鼠腦缺血后腦線粒體損傷保護作用的研究*

余 婷 韓亞非

（1.河北省邯鄲市中醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2.河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲056001）

隨著人口老齡化的加劇以及高血壓、高血脂等基礎疾病發(fā)病率的升高，缺血性腦血管病已逐漸發(fā)展成為致殘和死亡的主要疾病之一，病理生理學研究發(fā)現(xiàn)能量耗竭及氧自由基代謝障礙是缺血性腦損傷的主要病理機制［1-4］。線粒體為能量代謝及自由基產(chǎn)生的主要場所，而線粒體又是缺血性腦損傷主要亞細胞器靶目標。

中藥苦參為豆科苦參屬多年生落葉亞灌木植物苦參（Sophora flavescens Ait.）的根；其味苦、性寒，具有清熱燥濕、利水退黃、祛風殺蟲之功效，為我國傳統(tǒng)中藥品種之一，《本草綱目》《神農(nóng)本草經(jīng)》等均有記載?？鄥⑺兀∣xymatrine）是從中藥苦參中提取的一種喹諾西啶類生物堿，是其主要有效成分之一，現(xiàn)代藥學研究發(fā)現(xiàn)苦參素具有抗炎、抗細胞凋亡等多種生物學活性［5-6］以及擴張血管、改善微循環(huán)等藥理學作用［7］。本實驗以線粒體為研究對象，進一步探討苦參素對缺血性腦血管病的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠（雌雄不限）100只，體質(zhì)量250～300 g，購自河北省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（冀）2013-1-003，飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫 23～25 ℃、相對濕度65%～70%、光照周期12 h∶12 h。適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 試藥與儀器

苦參素購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司（批號：20170114）；線粒體分離試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所（批號：20170124）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，丙二醛（MDA）含量，鈉鉀 ATP 酶（Na+-K+-ATPase）、鈣鎂 ATP 酶（Ca2+-Mg2+-ATPase）試劑盒和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：20170309、20170413、20161207、20161128、20170316、20161125）。 UV-1206型紫外分光光度計（日本SHIMODZU）；透射電子顯微鏡（美國FEI公司）。

1.3 干預方法

1）分組與模型制備：取100只試驗用大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組、模型組和苦參素低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組，每組20只。參照繆培等［8］報道的試驗方法，采用線栓法阻斷大腦中動脈制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，假手術(shù)組行手術(shù)操作但不插入栓線。各組大鼠均于術(shù)前10 min腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水。 2）線粒體的制備［9］：腦缺血 24 h后，實施麻醉、斷頭取腦，分離缺血側(cè)大腦組織，置于預冷（4℃）的組織裂解液中，制備10%腦組織勻漿液，3000 r/min低溫（4℃）離心5 min后取上清液，12000 r/min低溫（4℃）離心10 min后，棄上清液取沉淀，即為線粒體，考馬斯亮藍測定蛋白含量。

1.4 標本采集與檢測

1.4.1 線粒體腫脹程度的測定 取線粒體加入緩沖液（250 mmol/L 蔗糖、5 mmol/L KH2PO4、3 mmol/L 琥珀酸鈉，調(diào)節(jié)pH7.2）中，制備線粒體蛋白0.25 g/L懸液；混勻后，通過紫外-可見分光光度計測定520 nm處的吸光度值（A），A與膜腫脹程度呈反比關(guān)系，即A越小則表示線粒體腫脹程度越嚴重。

1.4.2 線粒體膜流動性測定 采用熒光偏振度法［10］：取“1.3”項下“線粒體制備”中留出的不去上清液的部分制備線粒體蛋白1.00 g/L懸液，取1 mL線粒體懸液加入3 mL二苯基己三烯溶液（2 μmol/L），25℃溫水浴30 min后測定熒光偏振度（K）（激發(fā)波長362 nm，發(fā)射波長 432 nm），微黏度（η）＝2K（0.46-K）；膜流動性用熒光偏振度（K）、微黏度（η）表示，微黏度越大，膜流動性越小。

1.4.3 線粒體呼吸功能的測定 采用改良Clark氧電極法［11］取1 mg蛋白量線粒體加入2.5 mL反應介質(zhì)中（225 mmol/L 甘露醇，75 mmol/L 蔗糖，10 mmol/L KCl，20 mmol/L Tirs-HCI，3 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，0.1 mmol/L EDTA，調(diào)pH7.4），30℃恒溫孵育1 min后加入20 μL底物（NAD鏈為5 mmol/L谷氨酸+5 mmol/L蘋果酸；FAD鏈為5 mmol/L唬拍酸），然后描記呼吸曲線。2 min后加人 10 μL 腺苷二磷酸（ADP，45 mmol/L），連續(xù)描記Ⅲ態(tài)（R3）快速耗氧及ADP完全磷酸化后的Ⅳ態(tài)（R4）耗氧曲線，R3、R4耗氧速率比值為呼吸控制率（RCR）。

1.4.4 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 取1 mm×1 mm×1 mm缺血側(cè)腦組織置于2.5%戊二醛溶液進行固定6 h后，置于1%鋨酸進行后固定1 h，行梯度乙醇脫水、環(huán)氧樹脂包埋、切片（厚度約70 nm）、醋酸鈾浸泡、枸櫞酸鉛染色、沖洗、干燥處理后，通過透射電鏡觀察各組大鼠缺血側(cè)腦線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.4.5 線粒體內(nèi) SOD、GSH-Px、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性和MDA含量的測定 取線粒體加入適量冷裂解液，用超聲波儀破碎線粒體，然后嚴格按各試劑盒操作說明，依次測定線粒體內(nèi)SOD、GSH-Px、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性和MDA含量。

1.4.6 線粒體內(nèi)游離 Ca2+測定 參照Xi T等［12］報道的原子化學發(fā)光法測定各組大鼠缺血側(cè)腦組織線粒體內(nèi)游離Ca2+（以CaCO3為標準）。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦缺血后腦線粒體腫脹程度比較

見表1。與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血大鼠缺血側(cè)腦線粒體A520顯著降低（P＜0.01），提示線粒體腫脹程度顯著升高；而與模型組比較，苦參素中、高劑量組腦缺血大鼠A520顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示缺血側(cè)腦線粒體腫脹程度顯著降低。

2.2 各組大鼠腦缺血后腦線粒體膜流動性比較

見表1。與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血大鼠缺血側(cè)腦線粒體熒光偏振度（K值）、微黏度（η值）顯著升高（P＜0.01），提示腦線粒體膜流動性明顯降低；而與模型組比較，苦參素中、高劑量組腦缺血大鼠缺血側(cè)腦線粒體K值、η值顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），提示苦參素具有提高腦缺血大鼠缺血側(cè)腦線粒體膜流動性的作用。

表1 各組大鼠腦缺血后腦線粒體腫脹程度、膜流動性比較（±s）

表1 各組大鼠腦缺血后腦線粒體腫脹程度、膜流動性比較（±s）

與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n 腫脹程度（A520）膜流動性K η假手術(shù)組 20 86.93±4.25 0.62±0.04 2.08±0.17模型組 20 4.53±0.36**苦參素低劑量組 20 4.02±0.31 48.17±8.03** 1.41±0.09**55.48±9.12 1.13±0.09苦參素中劑量組 20 3.16±0.27△△61.35±9.76△ 0.95±0.08△苦參素高劑量組 20 75.69±11.28△△ 0.79±0.06△△ 2.79±0.24△△

2.3 各組大鼠腦缺血后腦線粒體呼吸功能比較

見表2。與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血大鼠缺血側(cè)腦線粒R3值顯著降低、R4值顯著升高、RCR顯著降低（P＜0.01）；而與模型組比較，苦參素中、高劑量組腦缺血大鼠缺血側(cè)腦線粒體R3值顯著升高、R4值顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠腦缺血后腦線粒體呼吸功能比較（±s）

表2 各組大鼠腦缺血后腦線粒體呼吸功能比較（±s）

組 別 n RCR（%）假手術(shù)組 20 2.73±0.53模型組 20 1.42±0.31**苦參素低劑量組 20 1.59±0.37 R3［mmol/（min·mg）］R4［mmol/（min·mg）］67.41±8.05 24.72±2.61 43.92±6.17** 31.05±2.89**47.35±7.62 29.83±3.14苦參素中劑量組 20 2.02±0.44△52.81±6.94△ 26.17±2.82△苦參素高劑量組 20 59.46±8.20△△ 23.86±2.75△△ 2.49±0.42△△

2.4 各組大鼠腦缺血后腦線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

見圖1。通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整；模型組缺血側(cè)神經(jīng)元呈現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則、多數(shù)線粒體水腫、少數(shù)線粒體崩解、部分嵴斷裂消失等病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。而與模型組比較，苦參素中、高劑量組大鼠缺血側(cè)神經(jīng)元及線粒體病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變呈不同程度改善，其中苦參素高劑量組缺血側(cè)神經(jīng)元線粒體僅少量出現(xiàn)水腫、線粒體膜基本完整、嵴僅少許破壞。

2.5 各組大鼠腦缺血后腦線粒體SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較

見表3。與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血大鼠缺血側(cè)腦線粒體中SOD、GSH-Px活性顯著降低而MDA含量顯著升高（P＜0.01）；而與模型組比較，苦參素中、高劑量組腦缺血大鼠缺血側(cè)腦線粒體SOD活性顯著升高且MDA含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），苦參素高劑量組GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05）。

圖1 透射電鏡下各組大鼠腦缺血后腦線粒體超微結(jié)構(gòu)（5000倍）

表3 各組大鼠腦缺血后腦線粒體呼吸功能比較（±s）

表3 各組大鼠腦缺血后腦線粒體呼吸功能比較（±s）

組 別 n MDA（nmol/mg）假手術(shù)組 20 2.48±0.35模型組 20 5.71±0.64**苦參素低劑量組 20 5.20±0.58 SOD（U/mg） GSH-Px（U/mg）113.42±5.38 38.05±2.61 69.84±2.97** 26.74±2.53**82.37±3.18 28.65±2.90苦參素中劑量組 20 4.59±0.47△88.65±3.72△△ 31.82±3.07△苦參素高劑量組 20 91.47±4.36△△ 35.49±3.26△△ 3.96±0.43△△

2.6 各組大鼠腦缺血后腦線粒體Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性比較

見表4。與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血大鼠缺血側(cè)腦線粒體中Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低（P＜0.01）；而與模型組比較，苦參素中、高劑量組腦線粒體Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），其中高劑量組Na+-K+-ATPase活性顯著升高（P＜0.01）。

表4 各組大鼠腦缺血后腦線粒體Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase 活性比較（μmol/mg，±s）

表4 各組大鼠腦缺血后腦線粒體Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase 活性比較（μmol/mg，±s）

組 別 n Na+-K+-ATPase Ca2+-Mg2+-ATPase假手術(shù)組 20 15.86±2.94 18.25±3.73模型組 20 7.37±2.06** 9.01±2.89**苦參素低劑量組 20 9.10±2.35 10.76±2.75苦參素中劑量組 20 11.02±2.71△△ 12.40±3.18△苦參素高劑量組 20 13.28±3.06△△ 14.19±3.22△△

2.7 各組大鼠腦缺血后腦線粒體內(nèi)游離Ca2+含量比較

見表5。與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血大鼠缺血側(cè)腦線粒體中游離Ca2+含量顯著升高（P＜0.01）；而與模型組比較，苦參素中、高劑量組腦線粒體游離Ca2+含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 各組大鼠腦缺血后腦線粒體內(nèi)游離Ca2+含量比較（nmol/g，±s）

表5 各組大鼠腦缺血后腦線粒體內(nèi)游離Ca2+含量比較（nmol/g，±s）

組 別 n Ca2+假手術(shù)組 20 12.97±2.03模型組 20 33.84±4.72**苦參素低劑量組 20 30.15±4.52苦參素中劑量組 20 25.63±4.08△苦參素高劑量組 20 19.74±2.88△△

3 討 論

能量代謝障礙及其所引發(fā)的一系列連鎖反應是腦缺血損傷發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，線粒體是細胞能量的轉(zhuǎn)換器，線粒體受損將導致線粒體呼吸功能障礙、ATP合成下降、自由基大量生成、細胞色素C釋放等而進一步誘發(fā)氧化應激損傷及細胞凋亡，因此，保護線粒體對抑制缺血性腦損傷具有重要作用［13］。

苦參為豆科苦參屬的變種，廣泛分布于我國、俄羅斯、日本、印度等海拔1500米以上的山坡上，具有清熱燥濕、祛風殺蟲之功效?？鄥⑺睾卸喾N化學成分，其中苦參素是其主要有效成分之一，具有多種生物學活性，苦參素對心肌、肝臟、腎臟等組織缺血均具有一定的保護作用［7，14-15］。 此外，程鋼等［16］和陳利平等［17］研究發(fā)現(xiàn)苦參素能夠通過抑制氧化應激、炎癥反應及繼發(fā)性細胞凋亡而對腦缺血損傷起到一定的保護作用，但苦參素是否對腦缺血后腦線粒體具有保護作用尚未見文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)苦參素50～100 mg/kg預處理能夠有效降低大鼠腦缺血后缺血側(cè)腦線粒體腫脹程度、提高線粒體膜流動性、提高線粒體呼吸功能。透射電鏡觀察顯示：經(jīng)苦參素預處理能夠有效抑制大鼠腦缺血后缺血側(cè)腦線粒體水腫、保護線粒體膜完整性等，提示苦參素對腦缺血后腦線粒體具有一定的保護作用。

線粒體是維持細胞內(nèi)Ca2+動態(tài)平衡的主要調(diào)節(jié)者，缺血性腦病發(fā)生后Ca2+可由路徑進入神經(jīng)細胞，而線粒體則可以通過膜單向轉(zhuǎn)運功能攝取細胞質(zhì)中過多的 Ca2+，進而導致線粒體 Ca2+超載［18］。 氧自由基（ROS）過剩是導致機體氧化應激損傷的根本原因，生理狀態(tài)下ROS能夠在抗氧化酶SOD、GSH-Px相繼催化作用下最終被還原生成H2O和 O2［19］；但過剩的ROS將攻擊細胞膜，使不飽和脂肪酸被氧化破壞而生成MDA［20］；缺血性腦病發(fā)生后線粒體內(nèi)SOD、GSH-Px活性降低而MDA含量升高，說明線粒體內(nèi)ROS代謝失衡，發(fā)生氧化應激損傷。Ca2+超載和氧化應激是導致線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔道（MPTP）開放的主要原因［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)苦參素50～100 mg/kg預處理能夠有效降低大鼠腦缺血后缺血側(cè)腦線粒體Ca2+濃度，改善抗氧化酶SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，提示苦參素能夠抑制線粒體Ca2+超載和氧化應激損傷，這可能是苦參素保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能損害的機制之一。

Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase是存在于生物膜上的蛋白酶，對維持生物膜完整性及能量代謝具有重要意義，但Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase對缺血缺氧非常敏感，缺血性腦病發(fā)生后，ATPase活性降低而使細胞內(nèi)游離Na+、Ca2+濃度增高，從而破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，影響細胞功能［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)苦參素50～100 mg/kg預處理能夠有效提高大鼠腦缺血后缺血側(cè)腦線粒體 Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性，這可能是苦參素保護腦缺血后缺血側(cè)腦線粒體結(jié)構(gòu)的重要分子機制之一。

綜上所述，苦參素對腦缺血后腦線粒體損傷具有一定的保護作用，其機制可能與降低Ca2+濃度、抑制氧化應激損傷以及改善Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性有關(guān)。

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