我國嗜尸性蠅類分子鑒定的研究現(xiàn)狀與分析

趙琳琳，翟仙敦，鄭 哲，李永林，莫耀南

（河南科技大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003）

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷 是法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。昆蟲學(xué)方法經(jīng)過科研工作者的不斷研究和基層法醫(yī)的實(shí)踐，被認(rèn)為是推斷死亡時(shí)間的一種有效方法。法醫(yī)昆蟲學(xué)的研究對象是與尸體有關(guān)的昆蟲，即嗜尸性昆蟲，其中與尸體關(guān)系最為密切的是鞘翅目和雙翅目昆蟲。雙翅目中的麗蠅科、麻蠅科、蚤蠅科、花蠅科、蠅科，以及鞘翅目中的埋葬甲科、隱翅蟲科、皮蠹科與郭公甲科最為重要。相對于嗅覺靈敏且能長途飛行的蠅類，甲蟲通常侵襲尸體稍晚。并且嗜尸性甲蟲全球性甚至全國性分布的種屬較少，僅有大隱翅蟲（Creophilus maxillosus）、白腹皮蠹（Dermestes maculatus）、鉤紋皮蠹（Dermestes ater）以及赤足腐郭公（Neccrobiarufipes）等少數(shù)幾種[1]。 因此，相比較而言，雙翅目中的蠅類是研究和實(shí)際應(yīng)用最多的類型。

1 嗜尸性蠅類用于推斷PMI的瓶頸

利用昆蟲學(xué)知識進(jìn)行法醫(yī)學(xué)死亡時(shí)間推斷，最關(guān)鍵是要對嗜尸性蠅類種屬做出準(zhǔn)確鑒定。但在尸體及其附近發(fā)現(xiàn)的各發(fā)育階段的蠅類，僅用形態(tài)學(xué)方法鑒定其種屬往往比較困難。究其原因[2]：首先昆蟲種類繁多，并且包含許多形態(tài)特征極其相近的近似種、近緣種以及種以下的亞種、生物型和地理種群，僅有少數(shù)形態(tài)學(xué)家能對其熟悉科目的種類進(jìn)行物種鑒定；其二，蠅類卵、幼蟲等形態(tài)差異較小，鑒別極難，如帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)到具有足夠形態(tài)特征來鑒別的成蟲，將耗費(fèi)大量的時(shí)間而影響案件的偵破，并且還要承擔(dān)孵化失敗的風(fēng)險(xiǎn)；其三，很多情況下案發(fā)現(xiàn)場只能采集到形態(tài)不完整的成蟲、蛹?xì)?，形態(tài)特征缺失，使形態(tài)學(xué)鑒定更加困難。嗜尸性蠅類的推廣應(yīng)用存在著許多障礙，嚴(yán)重降低了嗜尸性蠅類在實(shí)際案例應(yīng)用中的價(jià)值，很大程度上阻滯了法醫(yī)昆蟲學(xué)的發(fā)展。因此，廣大法醫(yī)科研工作者都在努力尋找新的方法解決這一難題。

2 分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)的快速發(fā)展給嗜尸性蠅類的種屬鑒定提供了新的契機(jī)，近20年世界范圍的相關(guān)研究一直呈現(xiàn)上升趨勢（圖1），它能夠在基因水平上對物種進(jìn)行快速有效的鑒別，同時(shí)還可以探討昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特點(diǎn)。由于生物DNA不受發(fā)育階段的影響，終生不變，并且分子生物學(xué)方法對樣本保存條件要求較低，單個(gè)翅膀或足就能提取到足夠的DNA。鑒于以上特點(diǎn)嗜尸性蠅類的分子鑒定成為其形態(tài)學(xué)鑒定的重要方法補(bǔ)充?？蒲泄ぷ髡卟捎枚喾N方法對多個(gè)地區(qū)和蠅種進(jìn)行了廣泛而深入的研究。

2.1 DNA序列分析是分子鑒定的主要方法

嗜尸性蠅類分子鑒定所用的方法主要有：限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，ALFP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、簡單重復(fù)序列多態(tài)性（Inter-simple SequenceRepeat， ISSR）、序列特意擴(kuò)增區(qū)域（Sequence Characterized Amplified Region，SCAR）以及 DNA 序列分析（DNA sequence analysis）等[3]。 但由于方法本身的限制，如RFLP由于受酶切位點(diǎn)的限制、RAPD受遺傳方式和引物的限制、ALFP引物需要使用同位素和非同位素標(biāo)記等，目前應(yīng)用最多的是DNA序列分析，與其他方法相比更加直觀，唯一的缺點(diǎn)就是測序成本較高，但隨著測序技術(shù)的普及和新一代測序（next-generation sequencing，NGS）的發(fā)展，這一方法必將得到廣泛應(yīng)用。

圖1 近20年世界范圍嗜尸性蠅類（A）及其分子鑒定（B）研究趨勢

我國學(xué)者采用該方法進(jìn)行了許多研究，劉欽來[2]、蔡繼峰[4]、應(yīng)斌武[5]、白鵬[6]、陳鳳磊等[7]、李進(jìn)華等[8]、王興華[9]、郭亞東[10]、湯振楚等[11]、熊楓[12]、Sanaa等[13]對全國多個(gè)地區(qū)的蠅科、麗蠅科、麻蠅科等的多個(gè)蠅種，王江峰等[14]、楊靜波等[15]對廣東、河南、四川、陜西的蠅科和麗蠅科9個(gè)蠅種，陳慶等[16]對北京的7個(gè)優(yōu)勢蠅種，法娜[17]對浙江華家池麗蠅科的7個(gè)蠅種，張紅玲等[18-19]對貴陽麗蠅科、麻蠅科、蠅科、花蠅科4科11屬19個(gè)蠅種，王劍峰等[20]對遼寧省、廣東省的蚤蠅科的4個(gè)蠅種，李學(xué)博等[21]對重慶麗蠅科、麻蠅科的7個(gè)蠅種，吳榮全等[22]對福建省麗蠅科、麻蠅科、花蠅科、蠅科的15個(gè)蠅種，趙琳琳等[23]，趙祖亮[24]對河南洛陽、鄭州地區(qū)蠅科、麗蠅科、麻蠅科的多個(gè)蠅種進(jìn)行了研究。所采用的分子標(biāo)記所在的基因有：線粒體基因組的COI，COII，16S rRNA，CYTB，ND1，ND5 基因和核基因組的 ITS1，ITS2 基因，分子標(biāo)記信息見表1。但不同學(xué)者所采用的分子標(biāo)記在基因上的位置有所不同。

2.2 我國嗜尸性蠅類分子鑒定地區(qū)和蠅種統(tǒng)計(jì)

根據(jù)國內(nèi)嗜尸性蠅類分子鑒定研究和記錄進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共有29個(gè)省（包括省、自治區(qū)、直轄市、不包括香港和澳門），包含麗蠅科（19個(gè)），蠅科（10個(gè)），麻蠅科（12 個(gè)），花蠅科（1 個(gè)），蚤蠅科（4 個(gè)）共46個(gè)蠅種?？傮w來說，南方地區(qū)研究較北方多，而絲光綠蠅、大頭金蠅和棕尾別麻蠅被多地區(qū)分子鑒定研究，具體結(jié)果見圖2。

圖2 我國嗜尸性蠅類分子鑒定地區(qū)和蠅種統(tǒng)計(jì)

3 研究現(xiàn)狀及分析

我國地域遼闊，經(jīng)緯跨度大，氣候類型多樣，很多地區(qū)（王江峰，珠江三角洲[35]；陳祿仕，貴州[36]；李玲，哈爾濱[37]；馬玉堃，杭州等）已經(jīng)在嗜尸性蠅類的生長發(fā)育和群落演替規(guī)律方面開展了較多研究，但由于地理位置、環(huán)境溫度、營養(yǎng)狀況等自然條件對蠅類的卵、幼蟲、蛹的發(fā)育的影響較大，并且蠅類種類繁多，不同蠅種間的卵、幼蟲、蛹形態(tài)差異很小，還存在一些形態(tài)特征極其相近的近似種、近緣種以及種以下的亞種、生物型和地理種群，有時(shí)同一蠅種的不同地理種群間也存在明顯差異，這些都對明確蠅類發(fā)育資料和形態(tài)學(xué)分類帶來困難。另外各實(shí)驗(yàn)室均是單獨(dú)研究，沒有相對統(tǒng)一的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，研究結(jié)果的科學(xué)性難以保證。盡管我國學(xué)者已經(jīng)用分子生物學(xué)方法針對蠅類的種屬鑒定展開了較多研究，但所采用的分子標(biāo)記多不相同，即使所在基因相同，在基因上的位置（包括長度）也不相同（表1），并且大多是針對單一地區(qū)的某幾個(gè)蠅種的幾只樣本，沒有在全國范圍內(nèi)統(tǒng)一進(jìn)行。

表1 我國用于嗜尸性蠅類分子鑒定的分子標(biāo)記

很多學(xué)者針對不同長度分子標(biāo)記進(jìn)行過研究，如COI+COII全序列或線粒體全基因組分析，但序列長度過長，對提取的DNA質(zhì)量要求較高，蠅類樣本保存條件亦是，同時(shí)需要多對引物擴(kuò)增，測序結(jié)果需要拼接，容易產(chǎn)生錯(cuò)誤，并且成本較高、對實(shí)驗(yàn)人員要求嚴(yán)格，不利于推廣。陳慶等[16]采用COI中1120bp基因序列對北京地區(qū)紅頭麗蠅、大頭金蠅、絲光綠蠅、肥須亞麻蠅、急鉤亞麻蠅、棕尾別麻蠅、家蠅共7個(gè)優(yōu)勢蠅種進(jìn)行分子鑒定，并且用與蔡繼峰[4]COI基因278bp序列中重合的186bp序列構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹，得到了相同的分支模式。但在使用全序列或部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，同一物種個(gè)體序列聚集的同時(shí)也有部分物種整體出現(xiàn)在和分類學(xué)結(jié)果不一致的位置。劉欽來[2]采用272bp和278bp COI片段成功鑒定了70多只嗜尸性麗蠅，其中包括一些難以區(qū)分的姐妹物種，如絲光綠蠅和銅綠蠅，亮綠蠅和叉葉綠蠅等，種類鑒別能力值得肯定，但這兩個(gè)片段在NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹上對于屬以上高階元的分類系統(tǒng)與形態(tài)學(xué)結(jié)果有一定出入。這可能與短片段序列所含信息太少有關(guān)。關(guān)于哪個(gè)或哪些基因的哪個(gè)片段包含足夠的信息用于蠅類的分子鑒定，尚需要進(jìn)一步的研究和實(shí)踐。

此外，根據(jù)Wells等[25]學(xué)者的研究表明，判定一個(gè)遺傳標(biāo)記是否能夠進(jìn)行嗜尸性蠅類的分子鑒定，起決定作用的是種內(nèi)序列變異的百分比，且與種間序列變異百分比無重疊。聯(lián)合線粒體基因COI+II進(jìn)行鑒定，種內(nèi)差異＜1%，種間差異≥3%，通過分子鑒定，即使不能夠準(zhǔn)確確定某一特定嗜尸性蠅種，至少可以把未知蠅種定位于某一特定的進(jìn)化分支上。因此判斷樣本是否同種標(biāo)準(zhǔn)不應(yīng)該局限在種內(nèi)差異＜1%，種間差異≥3%，而應(yīng)是蠅種是否位于某一特定的進(jìn)化分支上，并且種內(nèi)種間變異百分比無重疊。

4 展望

應(yīng)用嗜尸性蠅類推斷PMI是法醫(yī)學(xué)的重要手段，全國范圍內(nèi)沒有統(tǒng)一的嗜尸性蠅類生長發(fā)育和群落演替規(guī)律可循，所以每個(gè)地區(qū)都有必要開展獨(dú)立研究，并建立當(dāng)?shù)厥仁韵夘惿L發(fā)育和群落演替數(shù)據(jù)庫，與此同時(shí)開展全國各地區(qū)嗜尸性蠅類種屬的分子鑒定研究，建立分子鑒定數(shù)據(jù)庫。但以上各項(xiàng)也必須統(tǒng)一進(jìn)行，建立國家標(biāo)準(zhǔn)以保證研究結(jié)果的科學(xué)性和實(shí)用性。此外對于近緣種的判定還需要更多遺傳標(biāo)記的開發(fā)和聯(lián)合應(yīng)用。

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