熱處理方式對苦蕎蛋白功能特性的影響

周小理，侍榮華，周一鳴，夏 珂，肖 瀛

（上海應用技術大學 香料香精技術與工程學院，上海 201418）

0 引 言

苦蕎是一種很有前景的功能性食物，富含多種營養(yǎng)成分，包括蛋白質，纖維素，淀粉，微量元素，維生素，抗氧化劑等[1-4]。苦蕎籽粒中的蛋白質含量高于甜蕎，營養(yǎng)價值高于大豆、小麥、玉米等作物[5-7]。苦蕎蛋白是苦蕎中主要的生物活性物質，約占苦蕎的15%～17%，具有抗菌、抗腫瘤、降血壓、抑制絲氨酸蛋白酶等生理活性，是一種理想的健康食品原料[8]?？囵B(yǎng)蛋白主要由清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白4種蛋白組成，且富含18種氨基酸，氨基酸比例平衡，包含人體所需的 8種必需氨基酸。不同區(qū)域、不同品種的苦養(yǎng)蛋白其組成有所不同。Thanhaeuser等[9-11]研究表明，苦養(yǎng)蛋白含清蛋白 18%，球蛋白 43%，醇溶蛋白 1%，谷蛋白及其他蛋白含量為38%；王世霞等[12]分析表明，苦養(yǎng)蛋白的組分同小麥粉差別較大，水溶性球蛋白含量最高，達到31.8%～42.3%，谷蛋白含量第二，約為 25.4%～26.1%，醇溶蛋白含量1.7%～2.3%；Kankanamge等[13]研究發(fā)現(xiàn)苦養(yǎng)蛋白中清蛋白和球蛋白含量為55.4%，谷蛋白和殘基含量為42.8%，酵溶蛋白含量1.8%。通過SDS-PAGE電泳分析表明，幾種不同分子量范圍（由高到低）的亞基組成了苦養(yǎng)蛋白中的谷蛋白和球蛋白，而清蛋白大多是由低分子量的亞基組成，苦養(yǎng)蛋白的醇溶蛋白組分中包含了中等分子量到低分子量范圍的一些亞基。Tomotake等[14]通過研究苦蕎蛋白對倉鼠血漿膽固醇、膽囊膽汁組成以及糞便中類固醇排泄量的影響，第一次提出了苦蕎蛋白不僅顯著可以抑制膽結石形成，還可降低膽囊和肝臟中膽固醇濃度；周小理等[15]通過體外吸附膽酸鹽能力的測定證實所提取分離得到的苦蕎水溶性蛋白具有一定的降血脂功能。

熱處理是食品加工中不可避免的加工方法，目前常用的的熱處理方法包括：濕熱、干熱和微波等加熱方法，王曉琳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，適度熱處理能夠使花生蛋白發(fā)生變性，改變乳化性能，濕熱處理容易使蛋白發(fā)生聚集沉淀，此外，蛋白質與多糖在干熱條件下反應形成蛋白質-多糖復合物，可以大大改善蛋白質的乳化性和起泡性。為了最大限度的保持食品的功能特性，研究不同熱處理加工方式對苦蕎產品的影響極為重要。本研究擬采用 3種常見的加熱手段（濕熱、干熱和微波加熱），研究其對苦蕎蛋白營養(yǎng)功能特性的影響，以期獲得有利于保持或改善苦蕎蛋白各種功能特性的熱處理條件，為進一步研究苦蕎蛋白在功能食品的應用上提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎籽粒選取山西黑豐1號作為供試樣品。

主要試劑：硫酸銨、水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、茚三酮、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、十二烷基硫酸鈉、硫酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、過氧化氫、乙醇、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、水楊酸（CP級化學純，99%）等購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶購自 Sigma公司；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽購自上海寶曼生物科技有限公司。

主要儀器：M1-211A微波爐（220 V/50 Hz，700 W）購自美的集團；HH-4恒溫水浴鍋（800 W）購自上海森地科學儀器儀器有限公司；UV-2600紫外可見光分光光度計（185～900 nm）購自島津企業(yè)管理有限公司；X85-2磁力攪拌器（100～1 500 r/min，600 W）購自上海閔行虹浦儀器廠；AL204電子天平（最大稱量值210 g，重復性0.1 mg）購自梅特勒-托利多儀器有限公司；PRO 250高速均質機（576 W，10 000～30 000 r/min）購自上海致金儀器設備有限公司；FD-1D-80冷凍干燥機（220 V，50 Hz，1 300 W，＜ –80 ℃，＜ 20 Pa）購自北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦蕎蛋白的提取[17]

苦蕎籽粒（山西黑豐1號）→粉碎、過100目篩→石油醚脫脂→加水溶解（1∶10）→離心取上清液（5 000 r/min，30 min，4 ℃）→調節(jié)pH值至等電點（pH值4.5）→離心取沉淀（5 000 r/min，30 min，4 ℃）→真空冷凍干燥(–70 ℃，24 h)。

1.2.2 苦蕎蛋白的熱處理[18-20]

1）濕熱處理。苦蕎蛋白與水按照固液比1∶10加水混勻，水浴溫度80、100 ℃，處理時間20、40、60 min，得到6個蛋白樣品凍干備用。

2）干熱處理。將苦蕎蛋白平鋪在搪瓷盤上，置于烘箱中，溫度80、100 ℃，處理時間20、40、60 min，得到6個蛋白樣品備用。

3)微波加熱處理。將苦蕎蛋白置于微波爐中，微波功率700 W，處理時間2、4、6 min，得到3個蛋白樣品備用。

1.2.3 苦蕎蛋白水化性的測定

參考Molina等[21-22]的方法，分別對苦蕎蛋白溶解度和持水性進行測定。

1.2.4 苦蕎蛋白乳化活性的測定

參照張維農等[23]的方法，對苦蕎蛋白乳化活性進行測定。

1.2.5 苦蕎蛋白起泡活性的測定

參照Mirmoghtadaie等[24]的方法，對苦蕎蛋白起泡活性進行測定。

1.2.6 苦蕎蛋白體外消化率的測定

參照姜瞻梅等[25-26]的方法，對苦蕎蛋白體外消化率進行測定。

1.2.7 苦蕎蛋白抗氧化性的測定

參照 Osada等[27-29]的方法，分別對苦蕎蛋白 ABTS自由基清除能力、·OH清除能力和總還原力進行測定。

1.2.8 膽酸鹽吸附能力的測定

參照周小理等[30]的方法，對苦蕎蛋白膽酸鹽吸附能力進行測定。

1.2.9 數據分析

試驗重復3次，采用SPSS20.0對數據進行進行因子方差分析及Ducan’s 多重檢驗（P＜0.05），試驗結果以均值±標準差表示，其他數據作圖采用Origin9軟件處理。

2 結果與分析

2.1 熱處理對苦蕎蛋白加工特性的影響

2.1.1 熱處理對苦蕎蛋白水化性質的影響

蛋白質的水化性質是蛋白質最主要的功能特性之一，水化性質的強弱在很大程度上影響著其他功能性質，同時，對于蛋白質的商用及營養(yǎng)價值也具有較大的影響[31]。表1為熱處理對苦蕎蛋白水化性質的影響。除濕熱（100 ℃，60 min）以外，其余濕熱處理能夠顯著提高苦蕎蛋白的溶解度（P＜0.05）。干熱處理會降低苦蕎蛋白的溶解度，干熱（80、100 ℃）處理60 min時，溶解度分別降至約69.65%和63.29%，長時微波處理(4、6 min)可以明顯地改善苦蕎蛋白的溶解度，在微波處理6 min時，苦蕎蛋白溶解度最大，達到約93.54%，比未處理蛋白增加了18%。在熱處理過程中，可溶性小分子蛋白聚集成了大分子蛋白質，從而導致苦蕎蛋白溶解度降低；而微波加熱過程中可能造成了蛋白質分解，生成可溶性小分子物質。在食品加工過程中，可以適當控制熱加工條件，控制大分子聚集物的生成，避免蛋白質的溶解度下降，故可以選擇微波加熱方式進行加工[32]。經過濕熱處理后，苦蕎蛋白的持水性高于未處理的苦蕎蛋白；干熱 100 ℃和短時微波（2 min）處理可以明顯地改善苦蕎蛋白的持水性，在干熱100 ℃處理60 min時，其持水性達到1.341 g/g，比未處理蛋白增加了31%；在微波處理2 min時，苦蕎蛋白的持水性最大，達到約1.528 g/g，比未處理蛋白增加51%。這可能是由于熱處理會使蛋白質分子熱運動加劇，使得水在蛋白質中的分布更加均勻，吸收水分的速度加快。而長時微波導致持水性迅速下降的原因可能是微波加熱改變了蛋白質內部的極性基團對水的結合速率和程度。故為了保持或改善苦蕎蛋白的持水性，可以選擇干熱或短時微波加熱的方式進行熱加工。

表1 熱處理對苦蕎蛋白水化性質的影響Table 1 Influence of heat treatment on tartary buckwheat protein hydration properties

2.1.2 熱處理對苦蕎蛋白乳化特性的影響

乳化性在食品的加工過程中具有重要作用，只有具有良好乳化性的食品才會擁有良好的口感。表 2為熱處理對苦蕎蛋白乳化性質的影響。濕熱（100 ℃，20 min）處理時，苦蕎蛋白的乳化性最高，為14.54 m2/g，較未處理蛋白升高了 28%，而干熱和微波處理會顯著降低苦蕎蛋白的乳化性（P＜0.05）。微波（700 W）處理6 min時，苦蕎蛋白的乳化性最低，為4.41 m2/g，較未處理蛋白降低了 62%?？嗍w蛋白經過適度的濕熱處理，會增大分子的柔順性，繼而導致乳化性的上升，但是熱處理過度，可能會導致蛋白質過度變性產生許多聚集體，使分子的柔順性降低，溶解度降低，而少數蛋白質分子則可以在較短時間內擴散到油水分界面，從而導致其乳化效果明顯下降[33]。濕熱（80 ℃，20 min）處理時，苦蕎蛋白的乳化性穩(wěn)定性最高，約為32.47 min，較未處理蛋白分別升高了22%，干熱處理20 min時，乳化穩(wěn)定性分別升至約28.73和29.34 min，微波加熱對苦養(yǎng)蛋白乳化穩(wěn)定性的影響劇烈，隨著處理時間的增加迅速降低，在6 min時，降至約6.19 min，比未處理蛋白降低了77%。乳化穩(wěn)定性的改善可能是因為蛋白質展開使分子的柔韌性增強，從而可以更快地吸附在表面。而微波加熱可能使蛋白質重新聚合，分子的柔韌性降低，乳化穩(wěn)定性下降。故為了保持苦蕎蛋白的乳化特性，可以選擇濕熱（80、100 ℃）20 min進行食品加工。

表2 熱處理對苦蕎蛋白乳化特性的影響Table 2 Influence of heat treatment on tartary buckwheat protein emulsion properties

2.1.3 熱處理對苦蕎蛋白起泡特性的影響

蛋白質只有可溶解，才可以在水-空氣表層形成一種具有良好吸附力的薄層，進而形成泡沫；蛋白質必須具有很大的機械強度以及黏度，才能阻止泡沫的破裂以及結合，具有較好的泡沫穩(wěn)定性。表 3為熱處理對苦蕎蛋白起泡特性的影響。濕熱（100 ℃）處理20 min時，其起泡性為最高值，達30.33%，和未處理的蛋白質相比較，升高了 22%。干熱處理后的起泡性先下降后沒有明顯變化，而微波加熱6 min時，起泡性降低了66%。在濕熱（80 ℃）處理 60 min時，蛋白質的泡沫穩(wěn)定性達最大值，約為54.71%，和未處理的蛋白質相比較，升高了 23%。濕熱100 ℃以及干熱處理對苦蕎蛋白的泡沫穩(wěn)定性均有顯著影響；微波加熱的初期，泡沫穩(wěn)定性并沒有明顯變化，隨著微波時間的增加，便迅速下降，處理6 min時，其泡沫穩(wěn)定性降低了 54%。蛋白質的起泡性可能與蛋白質分子中游離于表面的疏水性氨基酸數量有聯(lián)系[34]。熱處理一方面可能會增加蛋白質肽鏈柔軟程度，使蛋白質分子在空氣-水界面展開吸附并形成網絡更加簡單；另一方面可以使更多的疏水性氨基酸裸露，提高蛋白質和空氣結合的能力[35]。因此從保持其起泡性的角度考慮，可以選擇濕熱100 ℃，20 min進行加工；而從改善泡沫穩(wěn)定性的角度考慮，可以選擇濕熱80 ℃，60 min進行加工。

表3 熱處理對苦蕎蛋白泡沫穩(wěn)定性的影響Table 3 Influence of heat treatment on tartary buckwheat protein foam stability

2.1.4 熱處理對苦蕎蛋白體外消化率的影響

鑒于單一的方法已無法對城市固體廢棄物中Cl含量進行準確測量，為更準確地測量出城市固體廢棄物中的Cl含量，分別采用氧彈燃燒法、艾士卡法、水萃取聯(lián)合氧彈燃燒法、水萃取聯(lián)合艾士卡法和XRF對廚余沼渣中Cl的含量進行檢測，以期找出較為適用且更能準確量化城市固體廢棄物中Cl含量的方法。

加熱處理蛋白質后，會改變其結構，從而影響其消化性。Ikeda等[36]通過體外模擬試驗，用胃蛋白酶－胰酶對甜蕎蛋白質進行水解消化，并探討了膳食纖維、單寧、植酸和蛋白酶抑制劑對甜蕎蛋白消化率的影響。但是熱處理對苦蕎蛋白消化性的研究報道較少，所以本試驗采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步消化的方法對熱處理后的苦蕎蛋白進行消化試驗。熱處理后的苦蕎蛋白，其消化率均得到不同程度的提高。圖 1為熱處理對苦蕎蛋白消化率的影響。

圖1 熱處理對苦蕎蛋白消化率的影響Fig.1 Influence of heat treatment on tartary buckwheat protein digestion rate

圖1a為濕熱處理對蛋白質消化率的影響，在胃消化階段，濕熱處理80 ℃時其消化率增長速度很緩慢，在加熱60 min時其消化率僅增長了6.73%；在100 ℃處理時，其消化率增長就相對比較明顯；而在胰酶消化階段，其消化率均保持一個較高水平，在濕熱 80和 100 ℃處理60 min時，其消化率分別增加了11.52%和22.59%，原因在于熱處理不僅使苦蕎蛋白暴露出更多的酶切位點，而且使苦蕎蛋白中的胰蛋白酶抑制因子失活，加速了胰蛋白酶與苦蕎蛋白的反應速率，從而提高了其消化率。

圖1b為干熱處理對苦蕎蛋白消化率影響。由圖可知，干熱80 ℃處理后的消化率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在處理60 min時，其消化率數值跟原始蛋白差異不大；100 ℃處理后的苦蕎蛋白消化率則持續(xù)上升，到60 min時其消化率比未處理蛋白增加了20.01%?？赡艿脑蚴沁m當熱處理可以使苦蕎蛋白的空間構象發(fā)生變化，使更多的酶切位點裸露，使其消化率增加。

圖1c為微波加熱對苦蕎蛋白消化率影響。由圖可知，微波加熱時間少于4 min時，在胃蛋白酶作用下，其消化率迅速上升，在處理4 min時，其消化率上升了19.15%；而在胰酶作用下，其消化率先迅速上升，后逐漸趨于平緩；在微波加熱6 min時，其消化率開始低于原始蛋白，這可能是因為過度的熱處理造成了大聚集體的生成，延長了酶作用的時間，從而降低了其消化率。苦蕎蛋白的消化率受處理溫度和加熱時間的影響。若要保持改善苦蕎蛋白的消化性，可以選擇濕熱或干熱的傳統(tǒng)方式，或是合理控制微波加熱的時間。

2.2 熱處理對抗氧化活性的影響

表 4為熱處理對苦蕎蛋白抗氧化性的影響。與未處理的苦蕎蛋白相比，其 2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)自由基清除能力均呈現(xiàn)不同程度的降低。傳統(tǒng)濕熱（80、100 ℃）以及干熱（80、100 ℃）處理對其ABTS自由基清除能力影響較小，微波加熱影響最大。適當溫度的濕熱處理會使苦蕎蛋白·OH清除能力增加，而干熱和微波加熱會不同程度降低其清除能力。在濕熱80 ℃的時候，隨著時間的增加，其·OH清除能力呈現(xiàn)上升趨勢，在60 min時，升至62.92%，與未處理的苦蕎蛋白相比，提高了9.75%。說明適量溫度與時間的濕熱處理，可以增加苦蕎蛋白的·OH清除能力，為改善其·OH清除能力，可以選擇濕熱（80 ℃，40 min）處理的方式。干熱80 ℃處理會使苦蕎蛋白還原力明顯上升，在處理60 min的時候，上升了16.34%；濕熱處理使其還原力逐漸下降，說明濕熱處理會略微降低苦蕎蛋白的還原能力，干熱處理則可以不同程度地提高其還原力，長時的微波加熱(4、6 min)會明顯降低其還原能力，故從保持其還原力的角度，應選擇干熱（80 ℃，60 min）處理進行加工。短時的微波加熱對苦蕎蛋白的抗氧化性影響不大，而長時的微波加熱會大大降低了苦蕎蛋白的抗氧化性。在700 W，6 min的時候，其ABTS自由基清除能力降低了48.79%，·OH清除能力降低了63.49%，還原力降低了49.18%。高于濕熱和干熱方式對其造成的影響。可見，長時微波加熱對苦蕎蛋白的抗氧化性具有很大的影響，尤其是對·OH的清除能力。

表4 熱處理對苦蕎蛋白抗氧化性的影響Table 4 Influence of heat treatment on tartary buckwheat protein oxidation resistance

2.3 熱處理對苦蕎蛋白膽酸鹽吸附能力的影響

表 5為熱處理對苦蕎蛋白膽酸鹽吸附能力的影響。膽酸鹽是降解膽固醇后的物質，膽酸鹽被吸附以后，可以使積累在肝腸循環(huán)中的膽酸鹽清出體外，達到促進膽固醇代謝，降低膽固醇含量的效果，從而起到降血脂的作用。

表5 熱處理對苦蕎蛋白膽酸鹽吸附能力的影響Table 5 Influence of heat treatment on tartary buckwheat protein bile salts adsorption capacity

3 結 論

1）濕熱處理可以提高苦蕎蛋白的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性、·OH清除能力、?；悄懰徕c吸附能力，較未處理的苦蕎蛋白分別提高了28%、22%、22%、23%、9.75%、28%。干熱處理可以提高苦蕎蛋白的持水性和還原力，較未處理的苦蕎蛋白分別提高了31%、16.34%。短時微波對苦蕎蛋白無明顯影響，在微波2 min時，苦蕎蛋白持水性提高了51%。

2）長時微波(4、6 min)對苦蕎蛋白的功能特性有很強的負面影響，可使其乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性分別降低62%，77%，66%，54%，ABTS自由基清除力、·OH清除力、還原力分別降低 48.79%、63.49%和49.18%，膽酸鈉、脫氧膽酸鈉和?；悄懰徕c吸附能力也分別降低了64%，55%和41%。

3）為保持苦蕎蛋白良好的功能特性，可以選擇傳統(tǒng)加熱方式（濕熱和干熱）或者嚴格控制微波時間，避免長時微波加熱對苦蕎蛋白功能特性的破壞?？嗍w蛋白的生產與加工均涉及熱處理工藝，雖然苦蕎產品的生產規(guī)模日益擴大，但產品質量仍然有待提高，造成這一差異的原因可能是熱處理加工工藝不同導致的。所以未來可以對苦蕎蛋白的熱加工工藝進行進一步地探究，對功能性蛋白產品的開發(fā)具有很大價值。

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