表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑致相關(guān)皮膚瘙癢的機(jī)制研究

彭艷梅，劉 青，鄧 博，崔慧娟*，段 樺，邱鈺芹(.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 0009； .中日友好醫(yī)院，北京 0009)

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的過(guò)表達(dá)與許多惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，使其成為重要的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。目前，表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(epidermal growth factor receptor inhibitors，EGFRIs)已廣泛用于肺癌、胰腺癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤和腸癌的一線(xiàn)至三線(xiàn)治療。這類(lèi)藥物皮膚不良反應(yīng)的發(fā)生率為36%(粘膜炎)～ 80%(痤瘡樣皮疹)[1]，導(dǎo)致了60%的患者減量，32%的患者停藥，因而影響靶向藥的療效[2]。其中，瘙癢總發(fā)生率約為50%，不同藥物發(fā)生情況有一定差別，厄洛替尼總發(fā)生率為13%，3/4級(jí)發(fā)生率< 1%[3]，西妥昔單抗總發(fā)生率為11%，3/4級(jí)發(fā)生率< 1%[4]，帕尼單抗總發(fā)生率為57%，3/4級(jí)發(fā)生率為2%[5]。皮膚瘙癢常常伴隨皮疹發(fā)生，也可因皮膚干燥而引起。盡管瘙癢極少導(dǎo)致靶向藥減量或停藥，但是它嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。一項(xiàng)應(yīng)用靶向藥前6周的生活質(zhì)量研究顯示，干燥和瘙癢是影響患者生活質(zhì)量主要的因素[6]。EGFRIs相關(guān)皮膚瘙癢使患者心煩意亂，夜間的瘙癢會(huì)打亂睡眠周期，影響日間正常生活，常見(jiàn)的皮膚表現(xiàn)是抓痕后的水腫、丘疹、苔蘚樣硬化、滲出或結(jié)硬皮。目前對(duì)于瘙癢性疾病的發(fā)生認(rèn)為存在中樞和外周的雙重機(jī)制調(diào)控，即瘙癢介質(zhì)通過(guò)刺激C類(lèi)神經(jīng)纖維或通過(guò)與皮膚感覺(jué)神經(jīng)纖維上的受體結(jié)合而介導(dǎo)瘙癢。P物質(zhì)(substance P，SP)是引起皮膚瘙癢的一個(gè)重要神經(jīng)介質(zhì)，在靶向藥引起的皮膚瘙癢中起著關(guān)鍵作用。目前對(duì)于EGFRIs相關(guān)皮膚瘙癢的機(jī)制研究尚缺乏，本研究以此為基礎(chǔ)，旨在通過(guò)EGFRIs類(lèi)藥物厄洛替尼與P物質(zhì)致癢小鼠的對(duì)比性研究，對(duì)皮膚瘙癢的機(jī)制進(jìn)行探索。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性ICR小鼠30只，5～6周齡，26～28 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[SCXK (京) 2012-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境為中日友好醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK (京) 2016-0043]。無(wú)菌手術(shù)在中日友好醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)實(shí)驗(yàn)操作室[SYXK (京) 2016-0043]進(jìn)行。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

厄洛替尼為上海羅氏公司產(chǎn)品；SP購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress公司(1 mg/支，純度98.07%，批號(hào)HY-P0201)；NK-1R抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；一氧化氮(NO)比色法試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；IL-31、IL-33 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；組胺、白三烯B4、SP ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海藍(lán)基生物科技有限公司。采用多道微量加液器、(450±10) nm濾光片的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 厄洛替尼與P物質(zhì)致癢小鼠

將30只雄性ICR小鼠按體重排序，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成5組，每組6只，分別編號(hào)SP、A、B、C、D，每只單籠飼養(yǎng)，分別給藥：SP組藥物濃度為2.7 mg/mL，注射于小鼠頸背部，每只50 μL，注射前一天剔除頸背部皮膚，為注射做準(zhǔn)備；A組予去離子水灌胃，每天一次；B組予厄洛替尼20 mg/kg灌胃，每天一次；C組予厄洛替尼100 mg/kg灌胃，每天一次；D組予厄洛替尼150 mg/kg灌胃，每天一次。

1.3.2 行為學(xué)觀察

小鼠瘙癢行為學(xué)表現(xiàn)為搔抓。小鼠搔抓行為觀察按照Kuraishi等的方法[7]。實(shí)驗(yàn)前，小鼠分別放入觀察盒適應(yīng)性活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，保持室內(nèi)安靜無(wú)人，動(dòng)物房監(jiān)控系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行監(jiān)控錄像，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，回放錄像進(jìn)行搔抓行為觀察，由2名不參加實(shí)驗(yàn)的工作人員記數(shù)。一次搔抓是指小鼠后爪對(duì)頸背部注射處及其鄰近部位的一次或連續(xù)多次搔抓，后爪落地或被舔吃時(shí)代表本次搔抓結(jié)束；前肢的活動(dòng)以及后爪對(duì)面、耳、腹部等處的搔抓則不做統(tǒng)計(jì)。

厄洛替尼致癢小鼠[8]：厄洛替尼連續(xù)灌胃10 d，首次給藥前1 d剔除背部毛發(fā)，面積約1 cm2。若小鼠在給藥過(guò)程中出現(xiàn)搔抓，說(shuō)明出現(xiàn)厄洛替尼所致瘙癢，每天對(duì)監(jiān)測(cè)錄像進(jìn)行回放，記錄小鼠每日的搔抓次數(shù)及持續(xù)時(shí)間。SP致癢小鼠[9]：實(shí)驗(yàn)前1 d剔除頸背部毛發(fā)，注射藥物前將小鼠放人玻璃籠內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1 h。對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組分別在頸背部皮內(nèi)注射100 nmol SP和等量的生理鹽水，于小鼠頸后部中央皮內(nèi)注射后立即放回。在無(wú)人條件下用數(shù)碼攝像機(jī)拍攝小鼠搔抓行為1 h，回放錄像觀察小鼠后爪對(duì)注射部位的搔抓次數(shù)。

1.3.3 皮膚取材及病理切片

干預(yù)后于小鼠頸背部進(jìn)行皮膚活檢，標(biāo)本大小為5 mm × 5 mm。進(jìn)行皮膚石蠟切片，并進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，顯微鏡下觀察皮膚組織的表現(xiàn)。包括表皮、毛囊的改變及炎性細(xì)胞聚集情況。

1.3.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

皮膚切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水甲醇液封閉阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波爐熱修復(fù)抗原，10%正常山羊血清封閉非特異性背景。傾去血清加入稀釋(1∶500)的第一抗體工作液(為兔抗鼠NK-1R抗體)，4℃過(guò)夜孵化，PBS沖洗后滴加第二抗體(羊抗兔IgG)及SABC，最后滴加新鮮配制的AEC顯色液，光鏡觀察下顯色后沖洗，甘油明膠封片，光鏡下觀察。顯色陽(yáng)性為胞內(nèi)呈棕黃色顆粒狀沉積。

1.3.5 血清標(biāo)本采集

干預(yù)10 d后留取心尖血1 mL，注入試管中，靜置5～10 min，離心(2000 r/min，10 min)，吸取上層血清注入EP試管中，加蓋塞緊，-80℃保存。

1.3.6 比色法檢測(cè)

取出試劑盒分別加0.1 mL雙蒸水、100 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、樣本于空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管中，加入試劑一、試劑二各0.2 mL，混勻，37℃準(zhǔn)確水浴60 min后，分別加入試劑三、試劑四0.2 mL、0.1 mL，充分旋渦混勻30 s，室溫靜置10 min，3500～4000 r/min，離心10 min，取上清顯色。

采用測(cè)定波長(zhǎng)為550 nm，應(yīng)用可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海菁華科技有限公司)進(jìn)行檢測(cè)血清NO含量。計(jì)算公式：NO含量=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)。

1.3.7 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)

取出試劑盒，于室溫放置30 min。取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中。在各孔中加入50 μL的酶標(biāo)記溶液。將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育反應(yīng)1 h。酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干。各孔加入顯色劑A 50 μL。各孔加入顯色劑B 50 μL。室溫下避光反應(yīng)10 min。各孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組均表現(xiàn)瘙癢的搔抓行為

應(yīng)用厄洛替尼致癢小鼠與SP致癢的小鼠模型進(jìn)行對(duì)照，研究發(fā)現(xiàn)二組均表現(xiàn)為搔抓行為。厄洛替尼所致瘙癢表現(xiàn)在給藥2～5 d一過(guò)性瘙癢，每次搔抓3～4次，持續(xù)1～2 min，第4天達(dá)到高峰，第5天搔抓逐漸緩解；P物質(zhì)所致瘙癢表現(xiàn)在給藥后1 h，以10 min為時(shí)間段，第一個(gè)10 min內(nèi)搔抓最明顯，平均4.7 min開(kāi)始出現(xiàn)搔抓，8 min達(dá)到高峰，后搔抓逐漸減少，至1 h基本完全緩解(如圖1所示)。

圖1 注射SP后1 h內(nèi)搔抓情況Fig.1 Scratching behavior at one hour after substance P stimulation

2.2 厄洛替尼和P物質(zhì)致癢皮膚病理

分別取頸、肩背、腰部皮膚組織，制作石蠟切片。HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，對(duì)照組表現(xiàn)出正常的表皮和毛囊狀態(tài)，厄洛替尼組及SP組均表現(xiàn)為表皮和毛囊周?chē)行粤＜?xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞的聚集，部分表現(xiàn)為表皮脫落、不全(如圖2所示)。

2.3 厄洛替尼和SP上調(diào)皮膚NK-1受體的表達(dá)

免疫組化顯示對(duì)照組小鼠皮膚，NK-1R表達(dá)為陰性；SP致癢小鼠皮膚，NK-1R表達(dá)陽(yáng)性，主要分布在表皮、毛囊區(qū)域，棕黃色免疫復(fù)合物主要沉積在胞漿內(nèi)；厄洛替尼瘙癢模型小鼠，皮膚NK-1R表達(dá)陽(yáng)性，其分布情況與P物質(zhì)致癢小鼠基本一致，以表皮和毛囊的分布最多(如圖3所示)。

2.4 厄洛替尼和SP均能調(diào)節(jié)血清中SP/NK-1受體下游相關(guān)因子的濃度

通過(guò)檢測(cè)SP組、不同劑量厄洛替尼組(其中低劑量組20 mg/kg，中劑量組100 mg/kg，高劑量組150 mg/kg)和空白對(duì)照組中的血清瘙癢相關(guān)神經(jīng)傳遞介質(zhì)。與對(duì)照組相比，厄洛替尼組：白三烯B4、NO無(wú)明顯差異(P> 0.05)；IL-31、IL-33的血清濃度呈劑量依耐性，低劑量組濃度減少，中、高劑量組濃度增加(P< 0.05)。P物質(zhì)在低劑量組的血清濃度增加(P< 0.05)；組胺在低劑量組的血清濃度減少(P< 0.05)，中、高劑量組與對(duì)照組相比差異有顯著性。P物質(zhì)組：NO無(wú)明顯差異(P> 0.05)；IL-31、IL-33的血清濃度減少(P< 0.05)；白三烯B4的血清濃度增加(P< 0.05)；組胺的血清濃度減少(P< 0.05)(如表1所示)。

注：A：對(duì)照組；B：厄洛替尼組；C：P物質(zhì)組。圖2 各組小鼠皮膚組織病理切片變化(HE染色，× 200)Note.A: Control group; B: Erlotinib group; C: Substance P group.Fig.2 Pathological changes in skin tissue of mice from the control group, erlotinib group, and substance P group. HE staining

注：A：對(duì)照組；B：厄洛替尼組；C：P物質(zhì)組。圖3 各組小鼠皮膚NK-1受體免疫組化變化(免疫組化染色，× 200)Note.A: Control group; B: Erlotinib group; C: Substance P group.Fig.3 Immunohistochemical changes in neurokinin 1 receptor in skin tissue of mice from the control group, erlotinib group, and substance P group. Immunohistochemical staining

表1 各組白介素-31、白介素-33、組胺、白三烯B4、一氧化氮、P物質(zhì)濃度Tab.1 Concentration of interleukin-31, interleukin-33, histamine, leukotriene B4, nitric oxide, and substance P in each group

注：與對(duì)照組相比，ΔP< 0.05；與P物質(zhì)組相比，*P< 0.05。

Note.Compared with the control group,ΔP< 0.05. Compared with the substance P group,*P< 0.05.

3 討論

EGFRIs致皮膚不良反應(yīng)的機(jī)制已進(jìn)行了大量的研究。Saveria等[10]闡明了應(yīng)用EGFRIs后發(fā)生皮膚毒性的機(jī)制，應(yīng)用EGFRIs皮膚細(xì)胞EGFR磷酸化受阻致下游信號(hào)通路異常，發(fā)生在角質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，最終出現(xiàn)了皮膚不良反應(yīng)，皮膚瘙癢是其中典型的表現(xiàn)之一。本課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，已建立厄洛替尼引起的皮疹小鼠模型，驗(yàn)證了皮膚病理過(guò)程是一種炎癥反應(yīng)[11]。本研究中，致癢小鼠皮膚HE染色顯示表皮及毛囊周?chē)仔约?xì)胞聚集，提示瘙癢可能也是在炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)上發(fā)生的。

SP是引起皮膚瘙癢的一個(gè)重要神經(jīng)介質(zhì)，SP通過(guò)與神經(jīng)激肽受體結(jié)合發(fā)揮作用，其中SP與NK-1R的親和力最大，SP激活后的瘙癢機(jī)制主要是NK-1R介導(dǎo)的[12]。Severini等[13]進(jìn)一步闡釋了皮膚瘙癢發(fā)生的機(jī)理可能是厄洛替尼誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞干細(xì)胞因子的分泌，隨后導(dǎo)致肥大細(xì)胞累積，肥大細(xì)胞活化后釋放介質(zhì)(如組胺、白三烯B4、NO等)引起瘙癢，SP通過(guò)與NK-1R結(jié)合后是活化肥大細(xì)胞的主要介質(zhì)。Gangemi等[14]研究EGFRIs相關(guān)皮疹瘙癢的血清標(biāo)志物時(shí)發(fā)現(xiàn)，EGFRIs相關(guān)皮疹患者瘙癢的程度與IL-33、IL-31血漿水平呈正相關(guān)，提示EGFRIs可誘導(dǎo)IL-33、IL-31而誘發(fā)瘙癢，其致癢機(jī)制可能也有SP/NK-1R有關(guān)[15]。因此，阿瑞匹坦能通過(guò)阻斷NK-1R介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫粒而發(fā)揮止癢作用。Duval等[16]首次報(bào)道了應(yīng)用阿瑞匹坦治療皮膚瘙癢的3例有效病例。2013年Tonini[17]通過(guò)單中心、前瞻性研究，探索性地評(píng)估了阿瑞匹坦治療EGFRIs類(lèi)靶向藥引起難治性皮膚瘙癢的效果，療效顯著。阿瑞匹坦是一種口服的NK-1R抑制劑，通過(guò)阻斷NK-1R而起到止癢作用，提示EGFRIs相關(guān)皮膚瘙癢可能是由于SP/NK-1受體結(jié)合而誘導(dǎo)的。本研究正是基于這個(gè)假說(shuō)進(jìn)行的，以SP致癢小鼠為陽(yáng)性對(duì)照[18]，觀察厄洛替尼導(dǎo)致皮膚瘙癢后的行為學(xué)表現(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)SP/NK-1R信號(hào)通路可能的下游因子的表達(dá)情況，以此來(lái)初步驗(yàn)證假說(shuō)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)厄洛替尼和SP激發(fā)小鼠瘙癢反應(yīng)，兩者均出現(xiàn)了瘙癢行為，而二者表現(xiàn)有差異。厄洛替尼所致瘙癢表現(xiàn)為間斷性發(fā)作的瘙癢行為，發(fā)作的頻次和程度差別不大，此瘙癢模型是首次探索，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。SP所致瘙癢發(fā)生在注射后8 min左右達(dá)高峰，后搔抓逐漸減少，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。二者的搔抓行為相似，考慮均為瘙癢相關(guān)的反應(yīng)。但二者的表現(xiàn)形式有差別，可能與給藥途徑有關(guān)，SP致癢小鼠為局部皮內(nèi)注射給藥，誘發(fā)皮膚瘙癢迅速；EGFRIs致癢小鼠為灌胃給藥，皮膚瘙癢與藥物應(yīng)用的累積量有關(guān)，這與患者的表現(xiàn)一致。

皮膚NK-1R免疫組化顯示，厄洛替尼組和SP組小鼠表皮中NK-1R相比對(duì)照組均表達(dá)上調(diào)，免疫復(fù)合物沉積主要沉積在表皮和毛囊內(nèi)，推測(cè)NK-1R的表達(dá)部位主要在表皮和毛囊，與皮膚反應(yīng)病變的位置一致。提示NK-1R參與了二者的瘙抓行為，可能致癢的重要因素。致癢過(guò)程一方面可能是誘導(dǎo)一些激動(dòng)劑的釋放，激發(fā)感覺(jué)神經(jīng)元的活動(dòng)引起瘙癢；另一方面可能是SP激活傳導(dǎo)癢覺(jué)的無(wú)髓C纖維上NK-1受體直接引起皮膚瘙癢[19-20]。

實(shí)驗(yàn)用ELISA法檢測(cè)小鼠血清SP/NK-1R可能的下游瘙癢介質(zhì)，結(jié)果顯示厄洛替尼組各因子的釋放，隨著給藥劑量的增加而增多，NO差異無(wú)顯著性。說(shuō)明瘙癢可能與SP的表達(dá)以及下游的信號(hào)分子IL-31、IL-33、組胺、白三烯B4有關(guān)，但厄洛替尼組僅低濃度組與SP組在IL-31、IL-33、組胺、SP的水平具有一致性，提示可能二者的致癢過(guò)程中，下游信號(hào)分子相似。說(shuō)明SP/NK-1R信號(hào)通路可能對(duì)厄洛替尼誘發(fā)的瘙癢行為有調(diào)控作用，但與靶向藥的劑量有關(guān)。此外，其他信號(hào)通路可能也對(duì)這些因子的表達(dá)具有調(diào)控作用。基于此，筆者推測(cè)EGFRIs相關(guān)皮膚瘙癢的機(jī)制可能有以下方面：①SP通過(guò)激活皮膚細(xì)胞上的NK-1R釋放激動(dòng)劑，例如組胺等，激發(fā)感覺(jué)神經(jīng)元的活動(dòng)引起瘙癢；②IL-33、IL-31也可能對(duì)此通路有調(diào)控作用；③SP直接激活傳導(dǎo)癢覺(jué)神經(jīng)纖維上NK-1R引起皮膚瘙癢[21]。

根據(jù)前期研究及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，EGFRIs相關(guān)皮膚瘙癢可能的機(jī)制有SP激活角質(zhì)形成細(xì)胞、肥大細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞表面的NK-1R，誘導(dǎo)瘙癢介質(zhì)組胺、IL-31、IL-33等的合成和釋放，這些瘙癢介質(zhì)作用于神經(jīng)纖維而導(dǎo)致了瘙癢的發(fā)生和發(fā)展。鑒于角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要成分，也是EGFRIs相關(guān)皮膚反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，推測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞可能也是SP作用的主要靶細(xì)胞。然而，該實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性，一方面SP/NK-1R下游信號(hào)因子有待于進(jìn)一步挖掘，另一方面不能排除各因子的表達(dá)與時(shí)間的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)為探索性研究，有待于更深入的研究驗(yàn)證假說(shuō)。

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