基于液相色譜—串聯(lián)質譜技術的新疆一枝蒿植物代謝組學分析方法研究

陳路路 王中華 周幟 何秉淑 賀玖明 黃羅嬌 努爾波拉提·阿依達爾汗 劉戈宇 阿吉艾克拜爾·艾薩 再帕爾·阿不力孜

摘 要 藥用植物化學成分種類繁多、結構復雜，而傳統(tǒng)方法難以獲得全面反映其所含成分隨時間、品種和生態(tài)環(huán)境等因素發(fā)生的變化信息，因此需要建立系統(tǒng)、全面的分析方法以進行整體物質基礎研究。本研究開展了基于液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）技術的新疆一枝蒿植物代謝組學分析方法研究，并將其應用于該植物不同組織器官代謝組的差異分析。重點考察了樣品前處理過程中的提取溶劑及比例、復溶溶劑比例、超聲時間對非靶向代謝組學研究的影響，以代謝物覆蓋度為主要指標選擇了最優(yōu)條件并進行了方法學驗證。采用上述前處理方法和LC-MS/MS分析方法，獲得了新疆一枝蒿根、莖、枝、葉、花不同組織器官的代謝組信息，并構建多變量統(tǒng)計模型進行分析，發(fā)現(xiàn)花與其它組織器官的代謝組存在顯著差異。結合數(shù)據(jù)庫檢索與化合物質譜裂解規(guī)律分析，獲得差異代謝物的結構類型，包括61個黃酮類、97個一枝蒿酮酸衍生物、7個綠原酸類化合物及15個其它類型化合物。進一步采用聚類熱圖分析針對上述180個差異代謝物在各組織器官的分布情況進行表征，初步揭示了各類化合物在不同組織器官的分布特征。本研究不僅為新疆一枝蒿植物化學成分的組織器官分布及其有效成分的合理利用提供了重要信息，同時為藥用植物的質量控制、品種改良以及合理開發(fā)提供了新的研究策略。

關鍵詞 新疆一枝蒿； 液相色譜-串聯(lián)質譜； 植物代謝組學； 樣品前處理； 多變量統(tǒng)計分析

1 引 言

從藥用植物中尋找活性物質、發(fā)現(xiàn)新的藥源分子， 一直是新藥研究的重要內容。藥用植物物種多樣，所含化學成分種類繁多，為新藥研發(fā)提供了豐富資源。然而，傳統(tǒng)的藥用植物藥效成分研究方法難以全面反映化學成分及其體內分布，以及生態(tài)環(huán)境對其體內物質的影響。植物代謝組學研究是從整體出發(fā)，系統(tǒng)地分析植物中的所有小分子物質及其隨時間、環(huán)境的變化，有利于藥用植物物質基礎及其功能的闡明、物種的判斷及預測等[1]。目前，液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS/MS）作為代謝組學研究中的常用分析手段，因其具有高靈敏、高通量、特異性強的特點，可高效、快速、準確地研究植物內源性代謝物的動態(tài)變化信息，為闡明藥用植物復雜代謝體系提供分子依據(jù)[2～8]。

新疆一枝蒿植物（Artemisia rupestris L.）為菊科蒿屬、多年生草本植物，主要分布在我國新疆天山、阿勒泰等地區(qū)，全草入藥。作為新疆維吾爾醫(yī)學的傳統(tǒng)用藥，新疆一枝蒿具有抗炎、保肝、抗過敏、抗病毒、抑菌、抗腫瘤等多方面的藥效作用[9～11]，有較高的藥用價值。新疆一枝蒿中化學成分種類繁多，含有黃酮類[12]、生物堿類、倍半萜類[13，14]、多糖類等。文獻報道該植物中黃酮類和倍半萜類化合物是含量較為豐富的活性成分，如倍半萜類次生代謝物一枝蒿酮酸是代表性的特征有效成分[15]。新疆一枝蒿藥材資源多依靠野生采挖，由于該植物具有獨特的生態(tài)特性，自然繁殖極為困難，并且近年來被大量開發(fā)利用，加上礦山開采、過度放牧等原因，野生藥材資源已經(jīng)匱乏，因而新疆一枝蒿的引種、馴化、人工栽培研究得到了重視。在臨床上采用人工栽培品種代替野生品種使用，但兩者藥效物質基礎是否一致尚存爭議。目前，新疆一枝蒿的藥效物質基礎研究主要包括化學成分的分離鑒定[16]、有效成分的含量測定[17]、質量標準分析[18]等。但這些研究多采用傳統(tǒng)分析方法，分離提取過程耗時，分析通量有限，且僅針對少數(shù)幾種化合物，無法高效、系統(tǒng)、全面地表征新疆一枝蒿的藥效物質基礎。

本研究采用高通量的LC-MS/MS技術分析新疆一枝蒿，通過重點考察屬于黃酮類和倍半萜類的一枝蒿酮酸、異槲皮苷、蘆丁、紫花牡荊素、洋艾素、金合歡素、蒙花苷、刺槐素8個內源性代謝物，結合代謝物覆蓋度對提取溶劑及比例、復溶溶劑比例、超聲時間等條件對前處理方法進行了優(yōu)化，建立了適用于新疆一枝蒿植物代謝組學研究的LC-MS/MS分析方法，以期獲得新疆一枝蒿更加全面的代謝組信息，同時結合多變量統(tǒng)計分析，尋找新疆一枝蒿不同組織器官之間的代謝組差異，初步揭示了該藥用植物的代謝組學特征和規(guī)律，并為后續(xù)人工栽培品種和野生品種的藥效物質基礎研究及其質量控制提供了新的分析手段。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Ultramate 3000超高效液相色譜、 Q-OT-qIT雜合型質譜儀（Orbitrap Fusion Lumos）、移液器（美國Thermo公司）； 冷凍干燥機、真空離心濃縮儀（德國Christ公司）； 離心機、混勻儀（德國Eppendorf公司）； 高速分散機（德國IKA公司）； 0.22 μm濾膜（美國Agilent公司）。

對照品一枝蒿酮酸、異槲皮苷、蘆丁、紫花牡荊素、洋艾素、金合歡素（辰光生物公司）； 刺槐素（成都克洛瑪生物科技公司）； 蒙花苷（中國食品藥品檢定研究院）。

乙腈、甲醇（德國Merck公司）； 甲酸（美國ROE公司）； 乙酸乙酯（美國Honeywell公司）； 氯仿（美國Mreda公司）； 所有試劑均為色譜純； 實驗用水為某品牌純凈水。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品采集與制備 盛花期新疆一枝蒿采自新疆維吾爾自治區(qū)富蘊縣（人工栽培品種，于2014年8月育苗，2015年6月底～7月初移栽至大田），采集后立即置于裝有干冰的保溫盒中暫存，并盡快轉移至80℃保存。取新疆一枝蒿根、莖、枝、葉、花，使用研缽在液氮中研磨成粉，粉末冷凍干燥48 h。稱?。?0±1） mg 凍干粉末于勻漿管中，冰浴條件下使用1 mL甲醇-水（80∶20，V/V）溶液在高速分散器中提取3 min（25000 r/min，1 min； 3000 r/min，1 min； 25000 r/min，1 min），超聲10 min后離心10 min（13500 r/min），置于真空離心濃縮儀中濃縮3 h。將濃縮物復溶于1 mL乙腈-水（50∶50，V/V），超聲混勻后離心10 min，使用0.22 μm微孔濾膜過濾上清液，備檢。

2.2.2 色譜條件

Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司）； 水（含0.1%甲酸，A）和乙腈（含0.1%甲酸，B）為流動相； 流速為0.3 mL/min，進樣量為5 μL，柱溫為40℃； 梯度洗脫：每次進樣前用初始流動相平衡8 min； 0～20 min，5%～50% B； 20～27 min，50%～98% B； 27～30 min，98% B； 30～30.1 min，98%～5% B。

2.2.3 質譜條件 離子源為電噴霧（Electrospray ionization， ESI）源； 采用正、負離子檢測模式； 掃描模式為全掃描； 掃描范圍 m/z 150～1000； 分辨率 60000； 噴霧電壓3.5 kV（正離子模式）， 3 kV（負離子模式）； 鞘氣 0.24 MPa； 輔助氣 0.10 MPa； 離子源溫度 350℃（正離子模式），380℃（負離子模式）。

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 獲得正、負離子檢測模式下的UHPLC-（±） ESI-MS譜后，采用數(shù)據(jù)格式轉換軟件MSConvert將原始數(shù)據(jù)（.raw格式）轉換成為mzXML格式文件，并導入開源數(shù)據(jù)處理軟件XCMS進行峰識別、峰對齊、峰填充及峰過濾，最終獲得包括質荷比（m/z）、保留時間（Retention time）及其峰面積的二維數(shù)據(jù)陣。將上述獲得的二維數(shù)據(jù)陣導入SIMCA-P（version 12.0， Umetrics AB， Ume， Sweden）進行多變量統(tǒng)計分析，利用主成分分析（Principal component analysis， PCA）和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least square-discriminant analysis， OPLS-DA）對樣品進行模式識別，選擇對分組貢獻較大的變量（VIP>1），進一步采用帶有Jack-knifed置信區(qū)間（未跨越零值的變量被認為是可信的變量，此條件用于變量的篩選）的載荷圖及原始輪廓圖進行篩選，去除變異較大、組間交差嚴重的變量，再對兩組獨立樣本進行t檢驗，選擇p <0.05的變量，運用Pearson相關性分析進一步篩除加合離子、同位素離子及碎片離子，最終獲得可靠的差異變量。根據(jù)差異代謝物的高分辨m/z及MS/MS譜數(shù)據(jù)，結合代謝物數(shù)據(jù)庫Metlin（http：//metlin.scripps.edu）檢索，確定差異代謝物的類別。

2.3 方法學驗證

2.3.1 儀器精密度 取新疆一枝蒿花的凍干粉末，按2.2.1節(jié)方法制備提取液，對同一樣品連續(xù)進樣6次，計算一枝蒿酮酸、異槲皮苷、蘆丁、紫花牡荊素、洋艾素、金合歡素、蒙花苷、刺槐素8個內源性代謝物峰面積的RSD，對儀器精密度進行考察。

2.3.2 方法精密度 同一天內平行制備提取液6份，計算不同時間洗脫的8個內源性代謝物峰面積的RSD，評估方法的批內精密度； 3天內連續(xù)制備18份提取液，計算上述8個內源性代謝物峰面積的RSD，評估方法的批間精密度。

3 結果與討論

3.1 樣品前處理及參數(shù)優(yōu)化

植物代謝組學的樣品前處理步驟對最終實驗結果至關重要[19]，提取代謝組信息時應盡可能兼顧代謝物不同的理化性質，保持代謝組的原始性和完整性。目前，溶劑提取是最為常用的提取方法[20]，提取溶劑種類及比例、是否使用超聲及超聲時間、復溶溶劑及比例均會影響實驗結果，因此本研究對上述參數(shù)進行了細致的考察與評估。

3.1.1 提取溶劑的選擇及其比例的優(yōu)化結果 為覆蓋更廣極性范圍的代謝物，在文獻調查的基礎上[21]，本研究首先比較了甲醇-水（95∶5； 80∶20； 50∶50，V/V）、乙腈-水（95∶5； 80∶20； 50∶50，V/V）、乙酸乙酯-水（95∶5； 80∶20； 50∶50，V/V）、甲醇-氯仿-水（90∶5∶5； 80∶10∶10； 60∶20∶20，V/V）作為提取溶劑時的提取效果。獲得的原始譜圖數(shù)據(jù)，經(jīng)格式轉化及XCMS軟件進行預處理后，各提取溶劑體系獲得的色譜峰數(shù)目比較結果如圖1所示。為清晰顯示比較結果，計算各提取溶劑獲得的色譜峰數(shù)占所有提取溶劑獲得的色譜峰數(shù)目總和的百分比。結果表明，甲醇-水（80∶20，V/V）提取得到6985個色譜峰，相同溶劑類型下此比例獲得峰數(shù)目最多； 同理，乙腈-水（80∶20，V/V）提取得到6561個色譜峰，乙酸乙酯-水（95∶5，V/V）提取得到5284個色譜峰，甲醇-氯仿-水（60∶20∶20，V/V）提取得到7541個色譜峰，分別為各類型提取溶劑的最佳比例。通過不同提取溶劑體系進行比較表明，甲醇-氯仿-水（60∶20∶20，V/V）提取的離子峰數(shù)目最多，其次為甲醇-水（80∶20，V/V）。

進一步使用SIMCA-P軟件對各提取溶劑獲得的二維數(shù)據(jù)陣進行PCA分析，結果如圖2所示，正、負離子檢測模式下，甲醇-水與甲醇-氯仿-水之間分組不明顯，而二者與乙腈-水、乙酸乙酯-水之間分組明顯，表明使用甲醇-氯仿-水作為提取溶劑時獲得的整體代謝組信息與甲醇-水相似，與乙腈-水、乙酸乙酯-水差異較大，考慮到所采用溶劑的環(huán)保性，盡管甲醇-氯仿-水提取的色譜峰數(shù)目最多，本研究最終采用甲醇-水（80∶20，V/V）代替甲醇-氯仿-水（60∶20∶20，V/V）作為提取溶劑。

3.1.2 超聲時間的選擇結果 在代謝物提取過程中采用超聲進行輔助提取，考察了超聲時間（0、10、20和30 min）對提取效率的影響，比較了各超聲條件下獲得的色譜峰數(shù)目。結果表明，超聲0、10、20和30 min時，可分別提取6347、6349、6146和6479個色譜峰，表明超聲30 min提取的色譜峰數(shù)目最多，但差別不大。為避免提取過程產生熱量使代謝物信息發(fā)生改變，實驗不僅需要在冰浴條件下進行提取，超聲時間也不應過長。綜合以上所述因素，最終選擇適宜的超聲時間為10 min。

3.1.3 復溶溶劑比例的優(yōu)化結果 在復溶溶劑的選擇過程中，為盡量避免造成峰展寬、峰分叉現(xiàn)象的溶劑效應，選擇了與流動相匹配的乙腈-水為復溶溶劑，并在此基礎上優(yōu)化有機相比例，考察了乙腈-水的體積比分別為5∶95、20∶80、50∶50、80∶20時的提取效果。結果表明，在正離子檢測模式下，乙腈-水的體積比為5∶95、20∶80、50∶50、80∶20時分別檢測到了8611、9559、11006、9691個色譜峰，且在負離子模式下分別檢測到了7193、7128、8233、6297個色譜峰。乙腈-水（50∶50，V/V）為復溶溶劑時，在正、負離子模式下檢測的色譜峰數(shù)目均為最多。因此，最終選擇復溶溶劑為乙腈-水（50∶50，V/V）。

3.1.4 色譜與質譜條件的優(yōu)化結果 色譜條件的優(yōu)化：選用代謝組學研究中常用HSS T3色譜柱[22]（100 mm×2.1 mm， 1.8 μm，Waters公司），考察乙腈-水、甲醇-水等流動相體系及其比例、進樣體積、流速、梯度洗脫程序、柱溫等對色譜分離的影響。結果表明，甲醇-水為流動相時，弱極性部分的分離效果不及乙腈-水，同時甲酸的加入有利于抑制峰拖尾現(xiàn)象，因此選擇乙腈（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸）為流動相； 優(yōu)化后的總離子流色譜圖（Total ion chromatograms， TICs）如圖3所示，在進樣量為5 μL，流速為0.3 mL/min，梯度洗脫時間為30 min，柱溫為40℃的條件下，各色譜峰的分離效果良好。

質譜條件的優(yōu)化：選擇一枝蒿酮酸、蘆丁、紫花牡荊素、異槲皮苷、金合歡素、刺槐素、蒙花苷和洋艾素共8種對照品的混合溶液，采用蠕動泵直接進樣進行分析，以分子離子峰強度較高為判斷標準，最終優(yōu)化后的條件如下：噴霧電壓：3.5 kV（正離子模式）， 3 kV（負離子模式）； 鞘氣： 0.24 MPa； 輔助氣： 0.10 MPa； 離子源溫度： 350℃（正離子模式），380℃（負離子模式）。

3.2 方法學驗證

采用上述建立的前處理方法和UHPLC-（±）ESI-MS分析方法，針對人工栽培品種的新疆一枝蒿樣品中-已知內源性代謝物的分析檢測情況進行了系統(tǒng)考察。選擇文獻[12～14]報道的新疆一枝蒿中具有活性的8種倍半萜類和黃酮類成分，其檢測情況及考察結果如表1所示。

儀器精密度考察結果表明，正、負離子模式下各代謝物提取離子流峰面積的RSD均小于6.3%，表明儀器精密度良好。

方法精密度考察結果表明，8種代謝物提取離子流峰面積的批內RSD和批間RSD分別小于11.8%和14.7%，表明方法精密度良好； 連續(xù)測定3天，各代謝物保留時間的RSD<0.5%，說明色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性良好。綜上所述，在儀器精密度良好的前提條件下，本方法精密度、穩(wěn)定性良好，可用于新疆一枝蒿植物樣本的分析。

3.3 新疆一枝蒿不同組織器官的代謝組學研究

采用建立的LC-MS/MS代謝組學方法分析了新疆一枝蒿根、莖、枝、葉、花不同組織器官的代謝組。由各組織器官的二維數(shù)據(jù)陣構建PCA模型得分圖，如圖4所示。結果表明，正、負離子檢測模式下，各組之間具有明顯的分組趨勢，表明各組織器官的代謝組有顯著差異，尤其是花與其它組織器官之間的差異最為明顯。

為了獲得各組間最大程度的分組，篩選出可靠的差異變量，采用2.5節(jié)所述方法進行數(shù)據(jù)處理，最終篩選到的差異變量數(shù)、變化倍數(shù)>10的差異變量數(shù)如表2所示。結果表明，與相似的新疆一枝蒿代謝組學研究結果[23]相比，本研究建立的LC-MS/MS代謝組學分析方法獲得了更多可靠的差異變量及更為全面的成分信息，充分展現(xiàn)了本方法全面、高效、快速的特點。

進一步根據(jù)差異代謝物的高分辨質譜及MS/MS譜數(shù)據(jù)，結合代謝物數(shù)據(jù)庫Metlin（http：//metlin.scripps.edu）檢索，對上述組間變化倍數(shù)大于10的差異代謝物結構類別進行了分析。以黃酮類化合物為例：黃酮類化合物包括黃酮、異黃酮、黃酮醇、異黃酮醇、黃烷酮、異黃烷酮和查耳酮等多種苷元結構類型以及黃酮氧苷、碳苷等異構體形式的糖苷類化合物，且質譜裂解行為具有明顯規(guī)律。比較分析表明[24]，相比于正離子檢測模式，黃酮苷類化合物在負離子檢測模式下靈敏度更高，其酚羥基失去質子產生[M-H]離子， [M-H]的（-）ESI-MS/MS譜易丟失糖基產生苷元離子（Y0）與自由基苷元離子（[Y0-H]·）。 例如，黃酮醇O-糖苷類化合物，B環(huán)為單羥基取代時，易產生m/z 285.0398 （Y0）、m/z 284.0321 （[Y0-H]·）； B環(huán)為雙羥基取代時，易產生m/z 301.0347 （Y0）、m/z 300.0269（[Y0-H]·）。采用該方法共分析判別出61個黃酮類化合物。同理，結合其它類化合物的裂解規(guī)律[12]與數(shù)據(jù)庫檢索，最終判別出97個一枝蒿酮酸衍生物、7個綠原酸類化合物以及15個其它類型化合物。

采用聚類熱圖對上述180個差異代謝物在不同組織器官的分布情況進行表征。由圖5可知，盛花期人工栽培品種新疆一枝蒿中絕大部分黃酮類和綠原酸類化合物在花中含量最高，提示這些化合物可能主要是在花中合成； 絕大部分倍半萜類化合物在花或葉中含量較高，表明花與葉可能是此類化合物的生物合成或積累部位。其中，新疆一枝蒿的特征有效成分“一枝蒿酮酸”在花中含量最高，在葉、枝、莖、根中依次降低，這與文獻 [23]的結論一致，該結果也表明本方法的可靠性。新疆一枝蒿為全草入藥，黃酮類和倍半萜類化合物是主要活性成分，通過建立的代謝組學分析方法獲得的物質分布特征表明，花與葉中其有效成分含量較高，此結果為新疆一枝蒿有效部位的合理利用提供了重要依據(jù)。

4 結 論

建立了基于LC-MS/MS技術的新疆一枝蒿代謝組學分析方法。本方法樣品前處理操作簡便，分析方法穩(wěn)定性好、靈敏度高、代謝物覆蓋范圍寬，可高效、全面地獲取該植物的代謝組信息。采用本方法對新疆一枝蒿的根、莖、枝、葉、花的代謝組進行分析，發(fā)現(xiàn)了不同化學成分及特征活性成分在不同組織器官的分布特征，為新疆一枝蒿有效部位的合理利用提供了重要依據(jù)。同時，本研究結果為揭示新疆一枝蒿植物的生理及代謝適應機制提供了關鍵信息，為藥材的質量控制、品種改良和合理開發(fā)提供了新的研究策略。

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