原人參二醇空心金納米藥物載體的制備及體外抗喉癌研究

李賀杰 劉哲 鄧曉然 林君 馬平安 滕博

摘 要 原人參二醇（PPD）對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。但由于水溶性差、利用度低，限制了其在臨床上的應(yīng)用。基于此，本研究以空心金納米顆粒為PPD的運輸載體，合成PPD空心金納米顆粒，采用高效液相色譜分析PPD空心金納米藥物載體的緩釋效應(yīng)性、MTT法檢測對Hep-2細(xì)胞增殖的抑制作用、流式細(xì)胞術(shù)研究對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響，以考察原人參二醇（PPD）空心金納米藥物載體的體外抗喉癌細(xì)胞Hep-2效應(yīng)。結(jié)果表明，PPD空心金納米藥物載體具有緩釋效應(yīng)性，與空白對照組、HAuNs組及PPD組相比，HAuNs-PEG-PPD組的Hep-2細(xì)胞生存率下降更顯著， 細(xì)胞凋亡率增加更顯著 （p<0.01）。PPD空心金納米載體可顯著增強(qiáng)PPD的體外抗喉癌細(xì)胞效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，有望成為PPD新型納米藥物，并應(yīng)用于喉癌的治療研究。

關(guān)鍵詞 原人參二醇；空心金納米顆粒；喉癌；細(xì)胞凋亡

1 引 言

原人參二醇（PPD）作為中國傳統(tǒng)中草藥人參的主要成分，對多種腫瘤具有抑制作用[1～8]。然而PPD水溶性差，臨床生物利用度很低。納米藥物系統(tǒng)作為一種新型給藥系統(tǒng)，由于其副作用較小、藥物生物利用度與療效較好，受到研究者的廣泛關(guān)注。在各種納米藥物系統(tǒng)中，含有高Z元素 （金，銀，碘，釓等）的各種納米材料作為藥物運輸載體[9～11]引起研究者的廣泛關(guān)注。金納米顆粒 （AuNPs）由于其良好的生物相容性、生物惰性、高原子序數(shù)、易于合成和表面修飾等，在納米藥物系統(tǒng)中表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，是藥物運輸載體的優(yōu)良材料[12～20]。You等[21]將DOX負(fù)載到PEG 修飾的空心金納米顆粒上，考察該藥物傳遞系統(tǒng)（DOX@ PEG-HAuNS） 的光熱治療-化療的聯(lián)合治療效果，結(jié)果表明，相比于游離DOX 和DOX 脂質(zhì)體，DOX@ PEG-HAuNS 具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性和更低的心臟毒性。

基于空心納米金顆粒的獨特性質(zhì)，本研究將空心金納米顆粒用于小分子PPD的負(fù)載輸送。將具有空心結(jié)構(gòu)、體積大、外殼薄而堅固等優(yōu)點的空心金納米顆粒和PPD結(jié)合起來，構(gòu)建了一種新型PPD給藥系統(tǒng)；PPD經(jīng)過空心金納米顆粒的負(fù)載，提高了藥物的水溶性及生物利用度，更利于腫瘤的治療。將PEG分子修飾到空心金納米顆粒表面，提高了納米材料的生物相容性； 空心金納米顆粒負(fù)載PPD，起到了緩釋作用，使得PPD的藥效更加持久。本研究還考察了其體外抗喉癌細(xì)胞的作用。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

FEITecnai G2 F20 S-Twin透射電子顯微鏡 （美國FEI公司）； X'Pert Pro X射線衍射儀 （荷蘭帕納科公司）； Vertex Perkine-Elmer 580BIR傅立葉變換紅外光譜儀 （美國瓦里安公司）； Prominenece UFLC高效液相色譜儀 （日本島津公司）； U-3310紫外可見近紅外光譜（HPLC）儀 （日本日立公司）； M630多功能酶標(biāo)儀 （美國Hercules公司）； FACSCan流式細(xì)胞儀 （美國Becton Dickinson公司）； MCO-20AIC CO2培養(yǎng)箱 （中國Sanyo公司）。

氯金酸 （分析純，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）； CoCl2·6H2O、檸檬酸三鈉和NaBH4 （分析純，北京化學(xué)有限公司）； PEG-SH （美國Nanocs 公司）； Hep-2細(xì)胞株 （中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院）；PPD （純度>99%，吉林大學(xué)有機(jī)化學(xué)實驗室合成）； RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國 Hyclone公司）； 二甲亞砜（DMSO）、青霉素和鏈霉素（上海鼎國生物技術(shù)有限公司）； MTT（美國Sigma公司）； TUNEL凋亡檢測試劑盒（瑞士羅氏公司）。實驗用水為Milli-Q純水儀（美國Millipore公司） 制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。

2.2 空心金納米顆粒 （HAuNs）的合成

參照文獻(xiàn)[22]的方法合成空心金納米顆粒（HAuNs）。首先制備鈷納米顆粒，將氯化鈷溶液 （0.1 mL， 0.4 mol/L）加入到含有新制備的硼氫化鈉溶液 （0.1 mL，1 mol/L）和檸檬酸鈉溶液 （0.4 mL，0.1 mol/L）中，混合溶液在氮氣氛下反應(yīng)60 min。將上述制備的無硼氫化鈉的鈷納米顆粒溶液 （30 mL）注入脫氧氯金酸溶液 （10 mL， 1 μmol/L）中，在氮氣氛下反應(yīng)10 min后，將溶液暴露于空氣中至鈷完全氧化。以10000 r/min離心，收集沉淀， 用超純水洗滌3次。

2.3 HAuNs-PEG的合成

通過配體交換法制備HAuNs-PEG[23]。將合成的HAuNs分散在去離子水中 （1.0 mg/mL），將150 mg PEG-SH加入到40 mL上述水溶液中，在室溫下攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束后，用超純水洗滌產(chǎn)物3次， 除去未反應(yīng)的PEG，產(chǎn)物分散在40 mL乙醇中。

2.4 PPD的負(fù)載和體外藥物釋放

將40 mL 1.0 mg/mL PPD乙醇溶液加入到40 mL 1.0 mg/mL HAuNs-PEG的乙醇溶液中，在37℃下攪拌24 h。離心，沉淀用乙醇洗滌3次。合并上清液，通過檢測上清液中PPD減少的重量（m）計算PPD的實際負(fù)載量，負(fù)載率LE （%）= [（初始mPPD-上清液中的mPPD）/mHAuNs-PEG]×100%，測得PPD負(fù)載率為30%。

色譜條件：CORTECS C18色譜柱（100 mm×4.6 mm， 2.7 μm）； 流動相A為0.1%冰醋酸，流動相B為乙腈，以A∶B=20∶80（V/V）等度洗脫； 流速0.5 mL/min，室溫分離； 進(jìn)樣量：10 μL；線性關(guān)系考察：精密稱取PPD，用乙醇定容至10 mL，用流動相分別稀釋成 5、10、25、40、100和200 μg/mL系列濃度，4℃保存?zhèn)溆?。進(jìn)樣量10 μL，測定峰面積，以PPD的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程；待測樣品的制備：將500 μL的HAuNs-PEG-PPD復(fù)合藥物加入4 mL的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%（V/V） CO2培養(yǎng)箱中，分別于30、60、120、180和240 min各取100 μL 上清液，于4℃保存，待測。

數(shù)據(jù)處理：將峰面積帶入回歸方程，得出藥物的劑量，以500 μL復(fù)合藥物中PPD的量為100%，計算出藥物隨時間變化的PDD釋放率。

2.5 實驗分組和體外細(xì)胞培養(yǎng)

空白對照組、HAuNs組、PPD組、HAuNs-PEG-PPD組 （藥物暴露時以PPD、HAuNs-PEG-PPD濃度、以及相應(yīng)負(fù)載濃度單純HAuNs計量為統(tǒng)一濃度單位）Hep-2細(xì)胞，采用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 IU/mL青霉素，鏈霉素100 mg/mL）， 在37℃、5% （V/V） CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.6 細(xì)胞毒性實驗

將PPD溶于無水乙醇中制備成64 mmol/L溶液。將細(xì)胞接種于96孔板中（0.3×104細(xì)胞/孔），培養(yǎng)過夜，然后將其暴露于不同濃度的HAuNs、PPD、HAuNs-PEG-PPD （2.30、4.61、9.21、18.43和36.87 μg/mL） 24 h后，將20 μL MTT （0.5 mg/mL）加入到96孔板和細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后棄MTT與培養(yǎng)基混合液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測各孔吸光度。計算細(xì)胞增殖抑制率 （Inhibitory rate，IR）， IR =[1-（用藥組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）]×100%。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞凋亡

將Hep-2細(xì)胞接種于六孔板中 （2×105細(xì)胞/孔），并分別暴露于HAuNs-PEG-PPD （IC50）、HAuNs （聯(lián)合組IC50所對應(yīng)Au濃度）、PPD （聯(lián)合組IC50所對應(yīng)PPD濃度）和空白對照組。培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)液，并用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，1000 r/min離心5 min，棄上清液。再用1 mL在4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。將400 μL 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，濃度為1×106 cells/mL。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混勻后于2～8℃避光條件下孵育5 min，然后采用流式細(xì)胞儀分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 空心金納米顆粒的結(jié)構(gòu)與表征。

HAuNs和HAuNs-PEG透射電子顯微鏡 （TEM）圖如圖1所示。HAuNs的平均直徑約為50 nm，平均金殼厚度約為8 nm（圖1A），可以清楚地看出空心金納米顆粒殼表面上的PEG層（圖1B）。

Au的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)如圖2所示，結(jié)果表明，合成的HAuNs結(jié)晶性良好。

FT-IR光譜圖如圖3所示。 圖3A中，3424 cm1處的寬帶歸屬于樣品中吸收的H2O的H振動和PEG中的OH伸縮振動，1384和1559 cm1處的峰由于在制備過程中加入Cit3離子而歸屬于（CO）拉伸模式[24] 。在圖3B中，1665和1047 cm1 峰分別歸屬于酯基中的CO伸縮振動和PEG中的CH伸縮振動。如圖3C所示，加載PPD后，可以觀察到PPD在2922和2868 cm1處的特征峰值，分別歸屬于甲基中的CH伸縮振動和亞甲基的CH伸縮振動。上述結(jié)果表明PEG的成功修飾和PPD的加載。

3.2 HPLC檢測HAuNs-PEG-PPD的緩釋性

藥物釋放體系的研究與應(yīng)用對臨床治療有著重要意義。本研究將PPD與空心金納米顆粒共價連接，制備HAuNs-PEG-PPD，構(gòu)筑了一種靶向Hep-2細(xì)胞的藥物控釋體系，采用高效液相色譜檢測HAuNs-PEG-PPD在體外隨時間的釋放率。

在所建立的色譜條件下，PPD的濃度 （x）在5～200 μg/L之間與峰面積 （y）呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=36696x -14104 （R2=0.9996）。如圖4所示，初期0～0.5 h，藥物快速釋放，釋放量占總量的60%，這段區(qū)間釋放出來的藥物主要是吸附在納米粒表面的藥物；0.5～4 h， 釋放速率有所減慢，藥物釋放量約占40%，這是因為藥物從納米粒內(nèi)部釋放出來，釋放速率比較緩慢。這說明了藥物負(fù)載于空心納米粒載體時，既可分布在載體的孔道和空腔內(nèi)部，也可存在于載體的外部表面區(qū)域。同時也說明本研究所制備的HAuNs-PEG-PPD具有較好的藥物緩釋效果，有望作為一種優(yōu)良的抗腫瘤藥物。

3.3 細(xì)胞體外暗場散射成像

為了驗證體外細(xì)胞中HAuNs-PEG的分布和細(xì)胞對HAuNs-PEG吞噬，測量了不同時間HAuNs-PEG納米復(fù)合材料孵育的Hep-2細(xì)胞的暗場散射圖像（圖5）。如圖5H所示，不添加HAuNs-PEG納米復(fù)合材料的Hep-2細(xì)胞在暗場中呈現(xiàn)灰色。用HAuNs-PEG納米復(fù)合材料 （圖5E～5F）培育后，Hep-2細(xì)胞的暗場散射圖像由于其在紅光頻率區(qū)域的強(qiáng)烈的縱向表面等離子體振蕩而顯示散射橙光[25]，散射光的強(qiáng)度隨著孵育時間的延長而增強(qiáng)。這些結(jié)果提示了納米復(fù)合材料通過非特異性內(nèi)吞途徑[26]而進(jìn)入細(xì)胞的過程比較緩慢。

3.4 HAuNs-PEG-PPD對Hep-2細(xì)胞生長的抑制作用

研究證實，PPD對肝癌細(xì)胞HepG2有一定的細(xì)胞毒性作用[27]，適量濃度的PPD對Hep-2細(xì)胞的生長有一定抑制作用[28]。低劑量的PPD可提高細(xì)胞存活率，保護(hù)細(xì)胞，而高劑量的PPD可抑制細(xì)胞增殖[29]。本研究采用MTT法檢測不同濃度的HAuNs、PPD、HAuNs-PEG-PPD對Hep-2細(xì)胞生長的抑制作用。

如圖6所示，在共培養(yǎng)24 h后，PPD、HAuNs-PEG-PPD對Hep-2細(xì)胞的抑制作用均呈劑量依賴性，低劑量PPD （≤4.61 μg/mL）對Hep-2細(xì)胞無明顯抑制作用，而低劑量HAuNs-PEG-PPD對Hep-2細(xì)胞具有明顯的抑制作用。

同等濃度的PPD與HAuNs-PEG-PPD相比較，HAuNs-PEG-PPD的抑制作用更明顯。而單純HAuNs對Hep-2細(xì)胞本身沒有明顯的細(xì)胞毒性作用。單純PPD組IC50為67.38 μg/mL，HAuNs-PEG-PPD的IC50為 39.29 μg/mL，與單純PPD組別相比較，HAuNs-PEG-PPD組IC50降低了1.71倍， 顯著降低了PPD對Hep-2細(xì)胞的IC50。這與圖6的結(jié)論一致，HAuNs-PEG-PPD增強(qiáng)了體外PPD對Hep-2細(xì)胞生長的抑制作用。

3.5 HAuNs-PEG-PPD對 Hep-2 細(xì)胞凋亡率的影響

研究證實PPD對多種癌細(xì)胞具有促凋亡作用，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌[30]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù) （FCM）檢測HAuNs、PPD、HAuNs-PEG-PPD粒子對Hep-2細(xì)胞凋亡率的影響。

圖7為Control 組、HAuNs組、PPD組、HAuNs-PEG-PPD組四組的FCM凋亡圖像。HAuNs-PEG-PPD的FCM 檢測結(jié)果圖8顯示，應(yīng)用IC50濃度的HAuNs-PEG-PPD 組 Hep-2 細(xì)胞凋亡率 （34.10%±3.24%） 明顯高于單純PPD組 （12.69%±2.48%），且與之前細(xì)胞毒實驗中半數(shù)致死量細(xì)胞凋亡率相符，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （p<0.01），且二者均高于單純HAuNs組 （6.06%±1.17%，p<0.01） 及對照組（1.69%±0.14%）。上述結(jié)果說明，HAuNs-PEG-PPD和PPD都可以誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡，HAuNs-PEG-PPD可以增強(qiáng)PPD誘導(dǎo)的Hep-2 細(xì)胞的凋亡率，并通過誘導(dǎo)凋亡使得細(xì)胞活性降低。這與上節(jié)中HAuNs-PEG-PPD加強(qiáng)了體外PPD對Hep-2細(xì)胞生長的抑制作用的結(jié)論，都證實了HAuNs-PEG-PPD與小分子PPD相比有更高的抗腫瘤活性。這可能是因為HAuNs-PEG-PPD納米粒子復(fù)合物通過胞吞作用，更好地被腫瘤細(xì)胞攝取。由于HAuNs-PEG-PPD納米粒子中的PEG具有羧基端，與PPD鏈接形成酯鍵，酯鍵具有pH敏感性，在細(xì)胞質(zhì)的酸性環(huán)境中能發(fā)生斷裂，釋放出PPD[31]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而高效地殺死細(xì)胞。

4 結(jié) 論

本研究將PPD負(fù)載到HAuNs-PEG，合成了HAuNs-PEG-PPD，采用HAuNs-PEG-PPD培育Hep-2細(xì)胞，并研究了HAuNs-PEG、HAuNs-PEG-PPD的特性以及HAuNs-PEG-PPD對 Hep-2細(xì)胞生存率、細(xì)胞凋亡率和PPD的釋放的影響，證實HAuNs-PEG-PPD在體外可顯著增強(qiáng)PPD的抗喉癌細(xì)胞效應(yīng)，有望作為抗喉癌藥物PPD新型給藥系統(tǒng)，為探索更多新劑型抗腫瘤藥物提供了參考。

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