樟樹長鏈脂肪?；鵆oA合成酶基因9克隆與表達(dá)分析

汪信東 章挺 楊海寬 鄭永杰 江香梅

摘 要：該研究以樟樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選克隆了擬南芥AtLACS9同源候選基因CcLACS9，二者序列相似性為75%。相關(guān)軟件預(yù)測CcLACS9享有植物L(fēng)ACS亞家族成員3個(gè)特征motifs，且N端含有定位質(zhì)體信手肽。在Δlacs缺陷型酵母互補(bǔ)測試中，以油酸作為唯一外源脂肪酸、轉(zhuǎn)化了CcLACS9的突變型酵母恢復(fù)正常生長，證明CcLACS9具有典型的脂肪?；鵆oA合成酶的功能。為探究CcLACS9是否參與了樟樹籽油生物合成，進(jìn)一步研究了其組織表達(dá)模式和在種子發(fā)育過程中其表達(dá)量與籽油累積量之間的關(guān)系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示CcLACS9基因在種仁與花中優(yōu)勢表達(dá)，種仁中相對表達(dá)量是根中的17.74倍。隨機(jī)測定了30棵成年樟樹成熟期種子千粒重、籽油含量和中鏈脂肪酸比例等指標(biāo)。根據(jù)仁油含量將測試群體劃為高、中、低三個(gè)不同品級，并在各品級中挑選3棵單株、逐月關(guān)聯(lián)分析其仁油含量與CcLACS9相對表達(dá)量。結(jié)果表明：在種仁發(fā)育前期，仁油含量和CcLACS9表達(dá)量都持續(xù)上升且二者呈正相關(guān)性，8月份為CcLACS9表達(dá)量峰值期;9月下旬后，仁油含量趨向穩(wěn)定但CcLACS9表達(dá)量仍處于較高水平但呈現(xiàn)下降趨勢，二者無明顯相關(guān)性。LACS亞家族在植物進(jìn)化中較為保守，同源基因在不同植物中具有相同或相似的功能。該研究結(jié)果暗示CcLACS9可能擁有AtLACS9相似的生物學(xué)功能，即在樟樹種仁油酯合成和累積過程中起重要作用。

關(guān)鍵詞：樟樹，長鏈脂肪酰基CoA合成酶9，籽油，基因表達(dá)分析，酵母互補(bǔ)檢測

中圖分類號：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）10-1335-11

Abstract：In this study，the cDNA encoding AtLACS9 homologous? gene was identified and cloned based on transcriptomes data of Cinnamomum camphora，sharing 75% sequence similarity to AtLACS9 and being registered to CcLACS9. Multiple sequences alignment showed CcLACS9 possessed three plant LACS-specific motifs and plastidical targeting signal in N-terminal. Using oleic acid as a substrate，CcLACS9 could activate free fatty acids into acyl-CoA thioesters in a yeast mutant deficient in LACS complementation test. The tissue-specific expression profile further revealed that CcLACS9 was predominantly expressed in developing seeds and flowers，but fewer in leaf and stem by real-time quantitative PCR analysis. There were 17.74-folds relative quantitative expression of CcLACS9 in kernels relative to roots. In an effort to better understand whether CcLACS9 involved seed oil biosynthesis in camphor kernel，the correlation between expression of CcLACS9 and seed oil content was surveyed. The seeds of thirty adult camphor trees were randomly sampled in November and thousand seed weight，seed oil content and the percentage of decanoic acid and lauric acid were tested and counted. According to seed oil content，the 30 individuals were subdivided into three groups and three representative plants were selected from each group to be subjected to association analysis between seed oil yield and CcLACS9 expression level in developing kernel. The results of three groups all showed that both the contents of seed oil and expression level of CcLACS9 continued to rise from June to August，and there were significant positive correlations between them. The peak of expression level of CcLACS9 in kernel was found in August. After September，the contents of seed oil tended to be stable，however，CcLACS9 keeped high expression level and had no correlation with contents of seed oil. In plant，the homoeologous genes of LACSs subfamily tend to carry the common function. These resluts implies that CcLACS9 possibly play an important role in seed oil accumulation in kernel of camphor tree.

Key words：Cinnamomum camphora，long chain fatty aycl-coA synthetase 9，seed oil，gene expression analysis，yeast complementation

樟樹（Cinnamomum camphora）是我國潛在可持續(xù)開發(fā)能源樹種之一，種仁中油脂占其自身干重的55%～65%，主要以癸酸和月桂酸為主、比例在90%以上（趙曼麗等，2012）。癸酸（C10）和月桂酸（C12）屬于中鏈脂肪酸，具有凝固點(diǎn)低、氧化穩(wěn)定性好、可被迅速吸收、相容性和延展性佳等特性，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥、保健、化妝、動(dòng)物養(yǎng)殖等行業(yè)（宮雪等，2012;劉夢蕓等，2016）。樟樹廣布于南方諸省，據(jù)統(tǒng)計(jì)僅湖南一省每年產(chǎn)籽油便可超過400 t，作為我國鮮有的富含中鏈脂肪酸植物資源具有良好的開發(fā)潛力。然而，目前樟樹籽油未被規(guī)?；_發(fā)利用，缺少具有競爭力的良種是其關(guān)鍵因素之一。作為高雜合的木本植物，樟樹個(gè)體間籽油含量和成分差異顯著，如何為良種定向篩選和培育提供約束性理論指標(biāo)顯得尤為重要。加強(qiáng)樟樹油脂生物合成研究、特別是關(guān)鍵基因挖掘，填補(bǔ)相關(guān)基礎(chǔ)研究空白，將有助于今后良種培育和樟樹油脂產(chǎn)業(yè)開發(fā)。

長鏈脂肪?；鵆oA合成酶（long chain fatty aycl-coA synthetases，LACSs）可催化游離脂肪酸（C14～C20）形成脂肪?；鵆oA參與生物體內(nèi)各類脂類代謝反應(yīng)，在植物發(fā)育、脂肪酸延伸、植物種子油脂即三?；视蚑AG（triacylglycerol）形成和β-氧化、生物膜合成與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程中具有重要作用（Watkins，1997; Khurana et al，2010）。在高等植物中，LACS是一類序列保守的蛋白，具有腺苷合成酶基因超家族（adenylate-forming enzymes superfamily，AAE）的共同特征，即包含一段高度保守的motif1（T[SG]-S[G]-G-[ST]-T[SE]-G[S]-X-P[M]）和motif2（Y[LWF]-G[SMW]-X-T[A]-E）組成（注X代表任意氨基酸）的AMP-綁定結(jié)構(gòu)域和享有相似的催化反應(yīng)機(jī)制：第一步在消耗ATP的條件下形成?；?AMP中間體、同時(shí)釋放焦磷酸鹽;第二步，將?；D(zhuǎn)移至最終受體并釋放AMP（Babbitt et al，1992; Stuible et al，2000）。AMP-綁定結(jié)構(gòu)域是第一步反應(yīng)的主要執(zhí)行者，也是腺苷合成酶基因超家族成員鑒定的特征探針序列（Stuible et al，2000）。LACSs包含的另一段由約25個(gè)高度保守氨基酸殘基組成的保守結(jié)構(gòu)域稱為?；鵆oA合成酶（ACS）信號序列，可能是脂肪酸的結(jié)合部位和 ACS 的激活位點(diǎn)（Mashek et al，2007）。此外，一段由45～70個(gè)不等殘基組成的專一連接區(qū)域（linker）則是LACSs區(qū)別于其它ACS家族成員的特征序列，其為LACSs成員行使正常生物學(xué)功能所必需（Steinberg et al，2000; Iijima et al，1996）。

植物L(fēng)ACSs亞家族各成員功能研究在模式植物擬南芥中的開展較為深入和廣泛。在擬南芥中已鑒定獲得9個(gè)編碼LACSs基因，缺陷型酵母互補(bǔ)測試證實(shí)了當(dāng)中7個(gè)編碼蛋白都具有較強(qiáng)的脂酰CoA合成酶活性，而在體外催化測試中則9個(gè)編碼蛋白皆具有較強(qiáng)的活性、但底物偏好性各異（Shockey et al，2002）。表達(dá)分析顯示，除AtLACS5（花中特異表達(dá)）之外、其它成員在各組織中普遍轉(zhuǎn)錄但具有明顯器官或組織特異性（Shockey et al，2002）。AtLACSs亞家族成員具有不同的亞細(xì)胞定位，在脂肪酸相關(guān)油脂代謝不同節(jié)點(diǎn)上起著重要作用，對植物正常各器官組織發(fā)育亦至關(guān)重要（Fulda et al，2002; L et al，2009; Schnurr et al，2004; Jessen et al，2011）。其中，AtLACS9基因在發(fā)育種子和蓮座葉中優(yōu)勢表達(dá)，其編碼蛋白（At1g77590）定位于質(zhì)體膜上（Schnurr et al，2002）。盡管T-DNA插入未引起lacs9-1突變體發(fā)育和表型明顯變化，但葉綠體中長鏈脂肪?；鵆oA合成酶活性只維持約為野生對照個(gè)體的10%，表明AtLACS9是質(zhì)體中主要的長鏈脂肪?；鵆oA合成酶類但存在另一種LACSs與之共同介導(dǎo)脂肪酸運(yùn)出質(zhì)體（Schnurr et al，2002）。隨后，雙突變鑒定證實(shí)了AtLACS9與AtLACS1功能存在部分冗余，在籽油合成過程中起重要作用（Zhao et al，2010）。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

所用材料取自江西省林業(yè)科學(xué)院院內(nèi)10年生至20年生的小樣本樟樹群體。樟樹LACS9基因序列參考國家林業(yè)局樟樹工程技術(shù)研究中心構(gòu)建的樟樹五種化學(xué)類型（芳樟醇型、桉葉油素型、樟腦型、龍腦型與異橙花椒醇型）葉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（江香梅等，2014）。

RNA提取試劑盒（RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue）、TaKaRa LA Taq、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（First Strand cDNA Synthesis Kit）、熒光定量試劑盒（SYBR Green I qPCR Kit）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒及PMD18-T克隆試劑盒均購自 TaKaRa公司。酵母表達(dá)載體pYES2和缺陷型酵母（Saccharomyces cerevisiae）YB525菌株由江蘇大學(xué)譚小力教授惠贈(zèng)。各鏈長脂肪酸購于Sigma公司。常規(guī)試劑和培養(yǎng)基購自上海生工;克隆測序由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 小樣本樟樹群體種子千粒重和種仁含油量和成分調(diào)查 隨機(jī)挑選30棵長勢相仿的樟樹，于2015年11月采集種子2 kg，洗凈、晾干，利用千分之一克電子天平稱量、統(tǒng)計(jì)千粒重。剝?nèi)》N仁、陰干后，稱取100 g種仁采用索氏提取法提取油脂。稱取油脂重量，計(jì)算單株籽油出油率;通過氣相-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）測定籽油中各中鏈脂肪酸成分和相對含量。

1.2.2 樟樹候選LACS9基因篩選 查詢Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫、下載AAE家族特征結(jié)構(gòu)域的隱馬氏模型文件（Pfam號碼：PF00501）（Conti et al，1996），運(yùn)行HMMER3.0程序（http：//hmmer.janelia.org/）注釋樟樹五種化學(xué)類型葉組織轉(zhuǎn)錄組序列;根據(jù)注釋結(jié)果，篩選獲得樟樹轉(zhuǎn)錄組中注釋為AAE超家族的全部Contigs序列;以AtLACS9作為參考序列建庫，運(yùn)行本地blast X，比對樟樹AAE超家族候選Contigs序列，根據(jù)相似性挑選AtLACS9同源Contigs;運(yùn)行序列拼接軟件CAP3，完成樟樹LACS9基因電子克隆。

1.2.3 樟樹LACS9基因克隆 于2016年4—7月，分別采集樟樹莖、葉、根、花和種仁五種組織，速凍于液氮中。根據(jù)TaKaRa公司RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue說明書提取上述五種組織total RNA。DNAase I消化后去除殘留DNA，取50 ng total RNA，使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。參考由樟樹五種化學(xué)類型葉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提供的LACS9基因電子克隆序列、設(shè)計(jì)特異引物，以樟樹上述五種組織cDNA為模板，采用PCR法特異擴(kuò)增樟樹LACS9基因。特異引物為F：5′-TTGCGAGAAATGGCTGAAT-3′;R：5′-AAGTTCCAACCAACGGATTPCR-3′。反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括LA Taq 0.2 μL、 cDNA 1 μL、 10×LA Taq buffer 2 μL、上下游引物各0.5 μL（10? μmol·L-1）、dNTPs 1 μL（2.5 mmol·L-1）和ddH2O 14.8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min;72 ℃ 10 min;35個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切取與目標(biāo)產(chǎn)物大小相當(dāng)?shù)碾娪緱l帶，回收后與PMD18-T克隆載體連接，42 ℃熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。菌液PCR篩選陽性克隆，送至上海生工測序。

1.2.4 樟樹LACS9基因序列分析與鑒定 使用Scanprosite Results viewer 工具搜索注釋的樟樹LACS9保守域信息;使用Clustalx軟件進(jìn)行多序列比對，計(jì)算樟樹LACS9基因與其它植物直系同源基因序列相似性;使用SignalP 4. 1 Server和Predictprotein等軟件預(yù)測樟樹LACS9亞細(xì)胞定位;引入擬南芥、油菜、花生等植物L(fēng)ACS9，通過MEGA6.0軟件分析植物L(fēng)ACS9基因譜系發(fā)生關(guān)系。

1.2.5 樟樹LACS9基因表達(dá)組織特異性分析 于2016年4—7月，分別采集樟樹花、莖、葉、種仁和根組織，提取total RNA。以Actin基因作為內(nèi)參對照基因（F：5′-CCTCGACACACAGGCGTTAT-3′;R：5′-CCATGCTCGATGGGATATTTCA-3′），采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法（qRT-PCR）檢測樟樹LACS9基因在樟樹不同組織中表達(dá)情況。qRT-PCR引物：F：5′-ACCTGCCTTTGGCTCACA-3′，R：5′- AAGGCGATCCGTATCCAA-3′。PCR反應(yīng)在Bio-RAD C1000 TM Thermal Cycler 熒光定量PCR儀上完成。 反應(yīng)體系總體積20 μL，包括（cDNA 50 ng，2 × SYBR Green qPCR10 μL，10 mmol·L-1的正反向引物各1 μL，超純水補(bǔ)足至20 μL），反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min; 95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s;40個(gè)循環(huán)，添加溶解曲線;每個(gè)樣品重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)參照2-△△CT計(jì)算相對表達(dá)量（Livak & Schmittgen，2001）。

1.2.6 樟樹種仁發(fā)育過程中LACS9基因表達(dá)量與發(fā)育進(jìn)程中種仁油脂含量關(guān)聯(lián)分析 根據(jù)上年種仁油測定結(jié)果，將測試小樣本分為三個(gè)品級，即出油率>60%為高品級、出油率介于50%～60%為中品級和出油率<50%為低品級。每個(gè)品級隨意選取3棵作為代表植株，于2016年5—11月，逐月采集樟樹種子、剝?nèi)》N仁。一部分種仁用于提取籽油，測定油脂含量和成分;一部分種仁用于總RNA提取，測定樟樹種子發(fā)育各時(shí)期

LACS9基因相對表達(dá)量。籽油提取采用索氏提取法并通過GC-MS測定含量和成分。種仁總RNA提取和LACS9基因?qū)崟r(shí)熒光定量表達(dá)分析同上。采用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析種子發(fā)育過程中LACS9基因表達(dá)量和油脂含量之間的關(guān)聯(lián)性。

1.2.7 樟樹LACS9缺陷型酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) 酵母菌株YB525（faa1Δfaa4Δ）缺少活化外源脂肪酸所必需的LACSs，不能在基本培養(yǎng)基中正常生長，常用于外源LACSs活性分析（朱福各等，2009）。將重組質(zhì)粒pYES2-CcLACS9和對照質(zhì)粒pYES2分別轉(zhuǎn)化至缺陷型酵母YB525感受態(tài)細(xì)胞中，通過缺省尿嘧啶固體培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化克隆。隨機(jī)挑取陽性克隆，在缺省尿嘧啶液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期中后期，低速離心收集酵母細(xì)胞，加入2 mol·L-1的山梨醇、漂洗兩次。將細(xì)胞轉(zhuǎn)接至缺省尿嘧啶液體培養(yǎng)基（含2%半乳糖且不含葡萄糖）中，振蕩培養(yǎng)4～5 h、以誘導(dǎo)外源目標(biāo)基因大量表達(dá)。按1%比例吸取菌液加入到缺省尿嘧啶液體培養(yǎng)基（含2%半乳糖和0.1% Tritonx-100）中，并添加98 μmol·L-1的脂肪酸C18∶1作為外源脂肪酸。于30 ℃振蕩培養(yǎng)約84 h，各取1 mL培養(yǎng)基利用分光光度計(jì)測量菌體密度來衡量其生長速度。

2 結(jié)果與分析

2.1 小樣本樟樹群體種子千粒重和種仁含油量調(diào)查

2015年11月采集的30棵樟樹種子千粒重最高值為184.23 g，最低值為118.62 g，平均值為149.92 g。在測試小樣本中，2/3樟樹個(gè)體種子千粒重在140～180 g之間，方差為16.92，呈類“正態(tài)”分布。測試樣本出油率最高為76.78%，最低為42.48%，均值為57.37%。出油率高于60%的有15株，低于50%的有12株，介于50%～60%之間的有3株，分布呈“兩極化”。脂肪酸成分分析表明，測試樟樹種仁中中鏈脂肪酸相對含量平均為95.71%，除個(gè)別單株外都介于94%～97%之間，分布較集中。中鏈脂肪酸當(dāng)中癸酸含量（平均為62.36%）顯著高于月桂酸含量（平均為33.35），二者呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.86，P<0.01）。在5個(gè)調(diào)查指標(biāo)中，方差值表現(xiàn)為千粒重>出油率>癸酸相對含量>月桂酸相對含量>大于中鏈脂肪酸相對含量。

2.2 樟樹LACS9基因篩選與cDNA序列克隆

在樟樹葉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索到5條Unigenes或Contings序列（表1），可能為擬南芥LACS9基因直系同源序列。借助軟件CAP3對5條Unigenes或Contings序列進(jìn)行拼接，獲得了包含完整開放閱讀框的樟樹LACS9基因電子克隆。根據(jù)電子克隆設(shè)計(jì)引物，分別以樟樹莖、葉、根、花和種仁五種組織cDNA為模板、通過PCR法進(jìn)行全長cDNA序列特異擴(kuò)增，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得了清晰的單一條帶（圖1）。經(jīng)單克隆測序顯示，擴(kuò)增條帶大小為2 356 bp，包含2 094 bp的編碼區(qū)序列、編碼697個(gè)氨基酸多肽，命名為CcLACS9。EditSeq軟件預(yù)測顯示，CcLACS9大小為86.83 kDa，等電點(diǎn)為7.39、生理中性條件下略偏堿性。ProtParam軟件在線分析顯示CcLACS9含有多個(gè)較強(qiáng)的親水區(qū)域，為親水性蛋白。提交GeneBank數(shù)據(jù)庫，獲得登入號MF966481。

2.3 樟樹LACS9序列鑒定及進(jìn)化分析

AMP綁定結(jié)構(gòu)域（PROSITE PS00455）[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]-[KR]是植物ACS家族的標(biāo)志性標(biāo)簽。為了鑒定CcLACS9是否屬于植物ACS家族成員，利用Scanprosite Results viewer軟件分析了其保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示（圖2：A），在CcLACS9蛋白序列第256～267和第452～462位分別存在12個(gè)和10個(gè)氨基酸殘基（圖中*標(biāo)記）組成的高度保守的AMP綁定結(jié)構(gòu)域;第531～560位包含由30個(gè)氨基酸（圖中☆標(biāo)記）組成高度保守的ACS信號序列，表明CcLACS9屬于典型的植物ACS基因家族成員。此外，介于AMP綁定結(jié)構(gòu)域和ACS信號序列之間，還存在一段包含71個(gè)氨基酸殘基組成的保守結(jié)構(gòu)域（第354～424，圖中◆標(biāo)記）即為LACSs亞家族特殊的linker結(jié)合域，該結(jié)合域在不同物種與不同成員中序列長度有所差異。綜上所述，CcLACS9既具備 ACS 家族的共同特征，又具有真核生物 LACSs專有的linker結(jié)合域，可基本確認(rèn)其為樟樹所含有的LACSs亞家族成員之一。將CcLACS9與其它植物L(fēng)ACSs亞家族同源基因進(jìn)行了多序列比對，結(jié)果顯示AMP綁定結(jié)構(gòu)域、ACS信號序列和linker結(jié)合域都具有極強(qiáng)的保守型（圖2：B）。

CcLACS9與油棕（Elaeis guineensis）、蓮花（Nelumbo nucifera）、無油樟（Amborella trichopoda）、二倍體棉花（Gossypium raimondii）、芝麻（Sesamum indicum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、麻楓樹（Jatropha curcas）、油菜（Brassica napus）、玉米（Zea mays）、蓖麻（Ricinus communis）等物種中同源基因序列相似性分別為80%、81%、80%、78%、78%、75%、78%、75%、75%和76%，表明在植物進(jìn)化中LACS9極為保守，可能在不同植物中都具有相同或相似的功能。LACS9譜系發(fā)生分析顯示，CcLACS9進(jìn)化上介于單子葉植物和雙子葉植物L(fēng)ACS9之間、與蓮LACS9較為相似，該結(jié)果與樟樹在陸生植物中的進(jìn)化地位相符。SignalP 4. 1Server和Predictprotein等亞細(xì)胞定位預(yù)測軟件都預(yù)測CcLACS9定位于質(zhì)體，暗示其極可能與AtLACS9一樣，執(zhí)行了將生物合成后脂肪酸運(yùn)出質(zhì)體的任務(wù)且進(jìn)而對種仁中油脂合成調(diào)控具有重要作用。

2.4 樟樹LACS9基因表達(dá)具有組織特異性

提取樟樹花、葉、莖、根和種仁等組織total RNA，以樟樹Actin基因?yàn)閮?nèi)參、通過熒光定量PCR法分析了CcLACS9基因在不同組織中的表達(dá)情況。從圖3可以看出，CcLACS9基因在花、葉、莖、根和種仁中均有表達(dá)，但表達(dá)豐度具有明顯的差異性。其中，CcLACS9基因在花、種仁中優(yōu)勢表達(dá)最為明顯，葉組織次之，在三者中表達(dá)量遠(yuǎn)高于其它組織。將根中CcLACS9基因表達(dá)量設(shè)定為1，在莖、葉、花和發(fā)育種仁等四個(gè)組織中相對表達(dá)量分別是其 4.75、9.31、15.82和17.74倍。

2.5 樟樹種仁發(fā)育前期油脂含量與CcLACS9基因表達(dá)量正相關(guān)

根據(jù)種仁含油量，將供試樟樹小樣本群體劃分為上（>60%）、 中（50%～60%）和下（<50%）三個(gè)品級。每個(gè)品級隨機(jī)抽樣3棵樟樹進(jìn)行各發(fā)育時(shí)期種仁含油量分析。2016年6—11月逐月采集樟樹種子、剝?nèi)》N仁，陰干后用于油脂提取。從圖6可以看出，樟樹種子發(fā)育前期（6—8月），隨著種子個(gè)體不斷發(fā)育膨大、種仁油脂含量（出油率）呈快速增長態(tài)勢;9—11月，隨著種子逐漸發(fā)育至成熟階段，種仁中油脂含量增長緩慢至趨于停滯。各品級樟樹油脂含量在8月開始呈現(xiàn)顯著差異并保留至成熟期（11月），所有單株不同脂肪酸比例在整個(gè)發(fā)育時(shí)期大體穩(wěn)定。

對應(yīng)地，我們通過熒光定量PCR方法測定了各品級樟樹種仁發(fā)育過程中CcLACS9基因的變化情況，以及研究該基因表達(dá)量與種仁含油量之間的關(guān)系。從圖6可以看出，相比較于5月初種子剛出現(xiàn)時(shí)期，6—11月時(shí)期種仁中CcLACS9基因都呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達(dá)態(tài)勢，其中表達(dá)高峰出現(xiàn)在8月份。同一時(shí)期，CcLACS9基因相對表達(dá)量在不同品級各單株間無明顯的差異且具有相似的時(shí)空表達(dá)模式。應(yīng)用SPSS Statistics 19.0軟件分析二者關(guān)聯(lián)情況，結(jié)果表明在種子發(fā)育前期（6—8月）、種仁含油量與CcLACS9基因相對表達(dá)量呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性（r=0.96）;后半期（9—11月）、種仁含油量與CcLACS9基因無明顯的相關(guān)性（r=0.13），但二者都維持高水平。

2.6 樟樹LACS9可恢復(fù)缺陷型酵母YB525正常生長

通過酶切連接的方法將CcLACS9基因CDS區(qū)插入表達(dá)載體pYES2多克隆位點(diǎn)，重組質(zhì)粒通過酶切鑒定和測序驗(yàn)證正確。將對照原始質(zhì)粒pYES2和重組質(zhì)粒pYES2-CcLACS9分別轉(zhuǎn)化缺陷型酵母YB525菌株，挑選陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于含有C18∶1（油酸）作為唯一碳源的缺省尿嘧啶液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期中期（約84 h）。OD600值測定顯示，轉(zhuǎn)化了pYES2-CcLACS9重組質(zhì)粒的缺陷型酵母細(xì)胞可以正常生長，而轉(zhuǎn)化了原始pYES2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子不能生長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 CcLACS9能夠互補(bǔ)酵母缺陷型，證明其具有脂酰CoA合成酶活性（圖7）。

3 討論

據(jù)調(diào)查，樟、沉水樟、毛豹皮樟、山橿、大葉木姜子、舟山木姜子、海南木姜子等多種樟科植物種仁平均含油量超過50%，是我國潛在的重要的生物質(zhì)能源開發(fā)樹種之一（祝必琴等，2014）。然而，目前相關(guān)資源還未獲得有效利用與開發(fā)，樟樹大量種子脫落甚至作為行道綠化時(shí)的“負(fù)產(chǎn)物”而難以處理，缺乏有競爭力的良種是其主要原因之一，需要開展針對性的高含油量的品種選育。在本研究所測試的30棵小樣本樟樹群體中，單株間種子千粒重和種仁出油率差異明顯，差異極值分別為65.61克和34.3%，表明在自然界中樟樹油脂良種篩選中具有很大的選育空間。千粒重和出油率之間無明顯相關(guān)性，在選育過程中二者應(yīng)綜合被考慮。

植物脂肪酸從頭合成始于質(zhì)體中，在脂肪酸合成酶催化下以丙二酰-ACP和乙酰-CoA作為起始底物進(jìn)行連續(xù)聚合反應(yīng)，以每個(gè)循環(huán)增加2個(gè)碳的頻率延伸?；兼溨敝梁铣?6～18個(gè)碳的飽和脂肪酰-ACP（Brown et al，2006）。依次在Δ9硬脂酰去飽和酶和?；?ACP水解酶作用下形成游離非飽和脂肪酸（Kachroo et al，2007）。為完成諸如三酰甘油、蠟質(zhì)、角質(zhì)及軟木質(zhì)等物質(zhì)合成，一大部分游離非飽和脂肪酸需以酰基-CoA激活形式運(yùn)出質(zhì)體，該反應(yīng)過程由LACSs介導(dǎo)完成。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明AtLACS9在擬南芥種仁油脂合成和累積過程中起重要作用（Schnurr et al，2002）。在本研究中，CcLACS9基因序列與AtLACS9基因相似性為75%，亞細(xì)胞定位預(yù)測其定位于質(zhì)體中且在種子中優(yōu)勢表達(dá)，暗示其極可能作為AtLACS9直系同源基因在樟樹籽油合成與累積過程中起重要作用。4月底樟樹開始掛果，5—8月是果實(shí)快速膨脹期和籽油合成累積高峰期，9月之后逐漸過渡到成熟期。CcLACS9在種子發(fā)育過程前期（5—8月）處于持續(xù)上調(diào)表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)量與種仁油脂含量呈正相關(guān)，再次暗示了其在樟樹籽油合成和累積過程中起了重要作用。種子成熟后（9月后），CcLACS9表達(dá)量與種仁油脂含量無明顯相關(guān)性，其維持較高表達(dá)水平可能主要在于彌補(bǔ)呼吸作用等引起的能量消耗、維持種仁油脂含量動(dòng)態(tài)平衡。不同單株中，CcLACS9基因表達(dá)量差異性與油脂含量差異性無明顯相關(guān)性，暗示還有其它因素參與了籽油合成調(diào)控。

樟樹籽油富含中鏈脂肪酸成分，是研究中鏈脂肪酸生物合成機(jī)制的好材料。酰基-ACP水解酶是調(diào)控樟樹合成中鏈脂肪?；年P(guān)鍵基因之一（Yuan et al，1995），然CcLACS9激活游離脂肪酸是否具有鏈長選擇性還未可知。在本研究中，我們特意比較了UFA（unusual fatty acid）植物包括樟樹、油棕和蓖麻與普通植物如擬南芥、大豆、芝麻等LACS9序列特征，結(jié)果顯示植物L(fēng)ACS9為一類較保守的LACSs亞家族成員，所有物種間該同源基因序列相似性介于75%～81%之間，且無明顯差異性motifs存在。利用MEGA6.0構(gòu)建植物L(fēng)ACS9譜系發(fā)生樹，結(jié)果顯示CcLACS9系統(tǒng)發(fā)育介于油棕、玉米等單子葉植物L(fēng)ACS9和芝麻、油茶等雙子葉植物L(fēng)ACS9之間，恰與樟樹作為基底被子植物的進(jìn)化地位相符，來源于UFA植物的LACS9并未特異聚集在一個(gè)進(jìn)化分支上。在微生物、動(dòng)物相關(guān)研究中（Lindner et al，2006; Kasuya et al，2009; Meng et al，2010），中鏈脂肪酸酰基CoA合成酶（MACS）可專一性地“活化”中鏈脂肪酸。楊樹MACS在體外實(shí)驗(yàn)中亦對己酸、壬酸和癸酸具有明顯的活性（曹山等，2016）。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)定位于質(zhì)體中的MACS，對其具有將植物體內(nèi)中鏈脂肪酸轉(zhuǎn)入/出質(zhì)體功能存疑。樟樹中是否存在特異MACS介導(dǎo)中鏈脂肪酸轉(zhuǎn)入/出質(zhì)體需要進(jìn)一步研究。