一株酸棗內(nèi)生菌的鑒定及其抗菌活性物質(zhì)的初步分離

鄧振山 高飛 劉玉珍 魏婷婷 李靜 李征霆

摘 要：為了從酸棗中篩選出內(nèi)生菌并分析其代謝產(chǎn)物中的活性成分，用于開發(fā)和生產(chǎn)藥物，該研究通過組織塊分離法和劃線分離法，從陜北野生酸棗植株體內(nèi)分離得到內(nèi)生菌，采用平板對峙法測定其對7株供試指示菌的抗菌活性，以心神寧片提取液為對照，對各拮抗菌株的發(fā)酵液進行薄層層析和高效液相色譜分析。結(jié)果表明：從野生酸棗中共分離得到121株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細菌49 株，內(nèi)生放線菌6株，內(nèi)生真菌66株;通過抗菌試驗，發(fā)現(xiàn)54株內(nèi)生菌（細菌33株，真菌21株）對1～7種指示菌具有抗菌活性，占分離菌株總菌數(shù)的44.63%，其中A-04、A-05、B-03、C-03、C-06和D-04共6株菌株的抗菌譜較廣，對7種供試指示菌均具有抑菌活性;薄層層析檢測結(jié)果顯示菌株B-03 發(fā)酵產(chǎn)物在Rf值為0.46處有與酸棗提取液層析帶遷移率相同的顯色帶，液相色譜分析結(jié)果顯示其屬于黃酮類物質(zhì);通過16S rRNA基因序列分析結(jié)果顯示菌株B-03與Bacillus axarquiensis的相似性為99%。菌株B-03能發(fā)酵產(chǎn)生黃酮類或產(chǎn)生與黃酮類類似的化合物，表明酸棗內(nèi)生菌具有合成黃酮類藥物的潛力。

關(guān)鍵詞：酸棗， 內(nèi)生菌， 代謝產(chǎn)物， 黃酮類物質(zhì)

中圖分類號：Q946

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）11-1486-07

Abstract：The purpose of this study was to identify endophytic strains from Ziziphus jujube and analyze the active components of their metabolites for the development and production of drugs. Wild Ziziphus jujube plants from North Shaanxi were adopted as experimental materials， and endophyte strains were isolated by approaches of tissue separation and streak plate， then they were screened and tested on the bacteriostatic activity by adopting indicators of seven strains from face-to-face cultivation in PDA media. The fermentation liquor of antagonistic strain was detected using thin layer， chromatography（TLC） and high performance liquid chromatography （HPLC） . The experimental results showed that a total number of 121 strains of endophytes were isolated from Ziziphus jujube， including 49 strains of endophytic bacteria， 6 strains of endophytic actinomycetes， and 66 strains of endophytic fungi. Among of them， 54 strains （33 bacteria and 21 fungi） had obvious antagonistic activity against 1-7 indicative bacteria， accounting for 44.63% of the total， and six strains （A-04， A-05， B-03， C-03， C-06 and D-04） had a broad spectrum of antibacterial and antibacterial activity against seven strains of indicator microbes. Results from the analysis of TLC and HPLC showed that liquor in B-03 strain has the same color band with the migration rate of Ziziphus jujube extract in Rf value of 0.46， and its belonged to flavonoids. According to 16S rRNA gene sequences analysis. The similarity between strain B-03 and Bacillus axarquiensis was 99%. The strain of B-03 could produce flavonoids or similar compounds， which showed that the endophytes from Ziziphus jujube had the potential ability to produce new drugs of flavonoids.

Key words：Ziziphus jujube var. spinosa， endophyte， product of metabolism， flavonoids

植物內(nèi)生菌是定植于健康植物組織內(nèi)，不引起明顯外觀病癥的一類微生物（Chihaoui et al，2015;Mufti et al，2015）。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生菌普遍存在于高等植物中，主要包括三類即內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌（Pandya et al，2015）。內(nèi)生菌與藥用植物在長期的協(xié)同進化過程中一方面形成了特殊的互惠共生關(guān)系，內(nèi)生菌對藥用植物的生長、道地性、產(chǎn)量、質(zhì)量、功效成分、抗逆性等方面都產(chǎn)生了重要影響;另一方面，藥用植物內(nèi)生菌自身產(chǎn)生的一些藥用活性物質(zhì)，在新藥研發(fā)、菌肥開發(fā)、生防菌研發(fā)、工業(yè)化酶生產(chǎn)應用等方面都顯示出巨大的開發(fā)潛力。我國藥用植物資源極為豐富，其中蘊含著大量不為人知的內(nèi)生菌類群，這一寶貴資源亟待人們?nèi)ヌ剿髋c開發(fā)（邢曉科，2018）。Stierle et al（1993）的研究結(jié)果表明內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的藥用活性物質(zhì)。之后，陸續(xù)有相關(guān)的研究報道如從植物內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)抑菌、抗腫瘤等活性物質(zhì)。從植物內(nèi)生菌中分離得到的活性物質(zhì)約有51%為新化合物（羅紅麗等，2012）。由此可見，藥用植物內(nèi)生菌在活性物質(zhì)分離方面具有重要的研究價值。

酸棗（Ziziphus jujube var. spinosa），為鼠李科棗屬植物，果肉、種仁、葉和根均可入藥，具有養(yǎng)肝靜心、安神斂汗的作用，經(jīng)濟與藥用價值極高（鄭強卿等，2014）。近年來，關(guān)于酸棗仁生物堿及脂肪酸類成分的研究很多，如從酸棗種仁中分離出環(huán)肽類生物堿 jubanine（Pandey & Sin，2008）。迄今為止，大多對酸棗的研究主要集中在酸棗仁的藥理藥效和化學成分方面（曹琴和王凱偉，2009），而關(guān)于酸棗產(chǎn)生藥用活性成分內(nèi)生菌的報道則鮮見有報道。因此，本研究以陜北野生酸棗植株為材料，從中分離篩選出具有抗菌活性的菌株，并對其次生代謝產(chǎn)物進行初步研究，以期為尋找新型化合物產(chǎn)生菌和開發(fā)利用新型活性物質(zhì)提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 新鮮野生酸棗植株體（包括根在內(nèi)），于2013年4—11月份采自陜西省延安市延安大學文匯山和鳳凰山，取樣后避光保存于4 ℃下，2 d內(nèi)處理完畢。

1.1.2 指示菌株 本研究所用的指示菌株均由延安大學醫(yī)學院提供，保藏于延安大學生命科學學院微生物實驗室中，具體見表1。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 固體分離培養(yǎng)基：（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;（2）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基;（3）高氏Ⅰ號培養(yǎng)基;（4）察氏培養(yǎng)基;（5）水瓊脂培養(yǎng)基;（6）改良無機鹽淀粉培養(yǎng)基（可溶性淀粉2 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，KNO3 1 g，NaCl 0.4 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2）;（7）酵母膏培養(yǎng)基（酵母浸膏0.25 g，K2HPO4 0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2）;（8）液體發(fā)酵培養(yǎng)基（PDA不加瓊脂）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離與純化

1.2.1.1? 內(nèi)生真菌的分離純化 內(nèi)生真菌的分離采用組織塊法（張新國等，2016）。分離材料用自來水沖洗，進行預處理，然后依次用95%的酒精浸泡1～5 min后無菌水沖洗4～5次，0.1%的升汞浸泡3～8 min后無菌水沖洗7～8次，75%的酒精浸泡3～5 min，無菌水沖洗4～5次進行表面消毒。最后在無菌狀態(tài)下切成0.2 cm×0.2 cm的小塊，接到PDA固體培養(yǎng)基中，每平板接2～4個組織，于（27±1）℃恒溫靜置培養(yǎng)2～3 d;觀察材料切口處菌絲（菌落），挑取切口處菌絲，轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，然后對所分離的內(nèi)生真菌進行純化，純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面上編號并保存。同時，將最后一次淋洗的無菌水涂布在培養(yǎng)基上作為對照，于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，檢驗表面消毒效果。

1.2.1.2? 內(nèi)生細菌的分離純化 采用組織塊分離法和劃線分離法對酸棗中的內(nèi)生細菌進行篩選（劉學周等，2014），在超凈工作臺下對酸棗植株體表面進行消毒，表面消毒方法同內(nèi)生真菌。將表面消毒好的材料在無菌狀態(tài)下切成0.2 cm×0.2 cm的小塊，接到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和高氏I號培養(yǎng)基中，每平板接2～4個組織，于（27±1）℃恒溫靜置培養(yǎng)2～3 d。待培養(yǎng)基中有可見菌落時，挑取周圍菌落移入相應培養(yǎng)基純化，并進行菌落形態(tài)描述和編號，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩⒆詈笠淮螞_洗的無菌水涂布于培養(yǎng)基上作為對照，于恒溫靜置培養(yǎng)，檢驗消毒效果。

1.2.2 內(nèi)生菌抗菌活性測定 采用打孔注入法測定上述分離得到的內(nèi)生菌的抗菌活性。將分離純化好的內(nèi)生菌菌種和7株供試指示菌分別接種于PDA平板上，待菌株生長旺盛后，用接種環(huán)挑取少量菌體，接種于已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速160 r·min-1，振蕩培養(yǎng)時間1～2 d后，用已滅菌的棉簽將供試指示菌均勻涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，在涂好的培養(yǎng)基上用已滅菌的打孔器（r=0.5 cm）在四周打上四個孔，用移液槍將待測的內(nèi)生菌發(fā)酵液注入孔中，以注入無菌水為對照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，觀察各菌株的抑制作用，待抑菌圈不再變化時，用刻度尺測量抑菌圈大?。ㄠ囌裆降?，2016;鄭艷等，2016）。

1.2.3 活性菌株液體發(fā)酵及產(chǎn)物的提取 從斜面挑取純化拮抗菌種接種于PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)，溫度（27±1）℃，轉(zhuǎn)速160 r·min-1，振蕩培養(yǎng)6～7 d后，用16層紗布過濾，分為菌體和發(fā)酵液兩部分，發(fā)酵液先后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至5 mL 左右，再用5 mL 甲醇溶解，所得液體經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜過濾，濃縮后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ㄒ粤岬龋?014）。

1.2.4 薄層層析（TLC）分析 對上述分離得到的樣品進行TLC分析，展開劑為氯仿∶甲醇（8∶1，v/v），用碘粉熏蒸顯色，并通過紫外光下的顯色反應作進一步驗證（梅宇飛等，2012）。

1.2.5 高效液相色譜（HPLC）分析 分別取少量蘆丁甲醇溶液、菌株發(fā)酵液和心神寧片提取液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，再進行HPLC分析。HPLC分析的檢測條件：Shimadzu ODS C18 色譜柱（150 mm ×4. 6 mm，5 μm），柱溫25 ℃，流動相為甲醇：0.2%磷酸溶液（v∶v）=1∶1，進樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1，檢測波長260 nm（張仁堂等，2012）。

1.2.6 菌株B-03的鑒定 （1）形態(tài)特征觀察：將菌株B-03劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄單菌落形態(tài);采用革蘭氏染色法判斷是革蘭氏陰性還是陽性菌。（2）分子鑒定：對B-03菌株16S rRNA基因片段進行PCR擴增（正向引物Pl：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′，反向引物P6：5′-TACGGCJ′ACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′），PCR反應體系及條件見圖2和圖3。將PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序，所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析菌株的系統(tǒng)發(fā)育學特征，獲得GenBank登錄號（王艷等，2017）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗內(nèi)生菌的分離結(jié)果

對酸棗植株體進行內(nèi)生菌分離，得到121個菌株。其中從葉中分離到38株，分別為C-01～C-38，占分離總菌數(shù)的31.40%，從根中分離到34株，占分離總菌數(shù)的28.10%，從莖中分離到29株，占分離總菌數(shù)的23.97%，從果實中分離到20株。可見酸棗葉中分離的內(nèi)生菌最多，果實中的最少。分離得到內(nèi)生真菌66株，占總菌數(shù)的54.55%，細菌49株，占總菌數(shù)的40.50%，放線菌6株，占總菌數(shù)的4.96%，可見本研究從酸棗中分離的的內(nèi)生真菌最多，細菌次之，放線菌最少見。

2.2 抗菌活性的測定結(jié)果

抗菌活性結(jié)果表明，從酸棗植株體分離的121株內(nèi)生菌中有54株對一種或多種指示菌具有一定的抑制作用，占篩選菌株的44.63%。表3列舉了15株不同內(nèi)生菌的抗菌測試結(jié)果，它們多數(shù)具有廣譜抗性。由表5可知，A-04、A-05、B-03、C-03、C-06和D-04這6株內(nèi)生菌對7種指示菌均有不同程度的抑制效果，占篩選菌株的13.33%，結(jié)果表明這6株內(nèi)生菌具有較廣的抗菌譜和較高的抗性。其中菌株B-03抑菌效果最明顯，最大抑菌圈直徑達到35 mm，因此將其選作進一步研究的菌株。

2.3 TLC分析結(jié)果

薄層層析（TLC）檢測結(jié)果表明，菌株B-03在Rf為0.46處有與心神寧片提取液顏色相同，遷移率相當?shù)娘@色斑，紫外光下顯黃色熒光，初步判斷B-03菌株具有能夠發(fā)酵產(chǎn)生與心神寧片中相似的部分化學物質(zhì)的能力。

2.4 HPLC分析結(jié)果

經(jīng)過分離純化的發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC圖譜顯示，蘆丁標準品在保留時間Rf=5.015 min處有一主要吸收峰， 心神寧片提取液出峰順序依次為組分A在保留時間Rf=2.015，組分B在保留時間Rf=2.375，組分C在保留時間Rf=2.952，組分D在保留時間Rf=3.394，組分F在保留時間Rf=4.986各有一主要吸收峰。 菌株B-03的發(fā)酵產(chǎn)物的出峰順序依次為組分a在保留時間Rf=2.023，組分b在保留時間Rf=3.398，組分c在保留時間Rf=3.932，組分d在保留時間Rf=5.782各有一主要吸收峰。由此可知，組分a與A、b與D的保留時間接近，組分d與蘆丁標準品主要吸收峰保留時間接近，初步判斷該菌株能夠發(fā)酵產(chǎn)生與心神寧片成分相似的黃酮類物質(zhì)。

2.5 菌株B-03的鑒定

2.5.1 形態(tài)特征觀察 菌株B-03在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成的菌落呈淡黃色，不透明，不粘稠，邊緣整齊;通過光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性。

2.5.2 分子鑒定 菌株B-03的16S rRNA序列（登陸號KY848236）與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，與其同源性較高的菌株均屬于芽孢桿菌屬，其中與Bacillus axarquiensis同源性最高（99.3%）。

3 討論

本研究結(jié)果表明酸棗根、莖、葉、果實組織中均存在大量內(nèi)生菌，其中一部分內(nèi)生菌對人體7種常見致病菌具有不同程度的活性抑制作用，這與畢江濤等（2012）植物內(nèi)生菌具有抗菌活性的結(jié)果是一致的，表明藥用植物酸棗內(nèi)生菌具有廣泛的抗菌活性，為篩選具有廣譜性和選擇性的抗菌藥物提供了資源。然而，在篩選優(yōu)勢內(nèi)生菌方面，對傳統(tǒng)的篩選條件還有待于進一步改進，采用新型的篩選方法和技術(shù)，從而充分挖掘優(yōu)勢植物內(nèi)生菌資源。

王梅霞等（2003）發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)生菌可以產(chǎn)生黃酮類化合物;楊曉軍等（2006）從湖北恩施蛇足中分離到1株真菌，并從其發(fā)酵液中得到一種異黃酮。這進一步證明了藥用植物內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與宿主活性成分相同或相似化合物的能力。然而，由于實驗過程中提取方法、展開劑、顯色劑、柱壓等條件的限制，菌株B-03的次級代謝產(chǎn)物也并非僅限于黃酮類化合物，故仍需利用其它生物化學手段進行提取、純化、鑒定，從而充分挖掘該菌株次級代謝產(chǎn)物的多樣性。

本研究采用薄層層析、高效液相色譜等方法對產(chǎn)與心神寧片化學成分相同或相似化合物的內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物進行分析，但并未涉及其他拮抗菌株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的研究。因此，

還需要從以下幾個方面對酸棗內(nèi)生菌進行研究：（1）對供試菌有較強抑制作用的內(nèi)生菌生物防治方面的進一步研究;（2）菌株B-03發(fā)酵液中所含成分的進一步鑒定，發(fā)酵條件和提取方法的優(yōu)化;（3）菌株是否具有藥用活性，以便為今后利用內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)天然藥用活性成分提供有利的理論依據(jù)。相對于已經(jīng)有很多研究的其它微生物來說，藥用植物內(nèi)生菌作為一類新的微生物資源具有很好的開發(fā)潛力及潛在的商業(yè)價值。