鹽雞鹵汁酶解工藝優(yōu)化及 氨基酸組成分析

王海丹,成亞斌,宋賢良,葉盛英,羅樹燦

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642)

鹽焗雞是具有嶺南特色的傳統(tǒng)風(fēng)味熟肉制品,具有皮爽脆、肉嫩滑的特點(diǎn),深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1-2]。鹽焗雞在傳統(tǒng)干法手工制作的基礎(chǔ)上,通過(guò)工藝革新逐步實(shí)現(xiàn)以濕法加工為主的工業(yè)化生產(chǎn)。鹵制是鹽焗雞工業(yè)化加工的重要工序,在此過(guò)程中,鹵汁會(huì)反復(fù)多次使用,每次鹵制時(shí)雞肉中雞油、蛋白質(zhì)(主要是膠原蛋白)和一些可溶性物質(zhì)會(huì)溶入鹵汁中,與香辛料和各種其他添加劑的風(fēng)味成分溶于一體,使鹵汁中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)十分豐富,風(fēng)味獨(dú)特[3-4]。但同時(shí)也會(huì)造成蛋白質(zhì)富集。本課題組前期研究表明[5-6],當(dāng)鹵制達(dá)到7次后,鹵汁中可溶性蛋白達(dá)到飽和,會(huì)影響鹽焗雞的加工品質(zhì),如蛋白質(zhì)會(huì)附著在雞肉表面,冷卻后形成蛋白胨,使其口感受到影響。因此鹽焗雞生產(chǎn)中,鹵汁經(jīng)多次使用后往往當(dāng)作廢棄物排放,這不僅造成大量營(yíng)養(yǎng)成分流失,而且也會(huì)引起環(huán)境污染問(wèn)題。

目前,關(guān)于熟肉制品(鹽水鴨、鹽焗雞、鹵鴨等)鹵汁的研究主要是集中于其營(yíng)養(yǎng)成份和風(fēng)味物質(zhì)的分析方面[7-10],而對(duì)鹵汁的酶水解和回收利用技術(shù)的研究則鮮見(jiàn)報(bào)道。鹽焗雞鹵汁中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸及風(fēng)味物質(zhì),特別是游離氨基酸含量非常高[11]。游離氨基酸不僅直接形成滋味,而且還是很多風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)[12-14]。雞肉中膠原蛋白含量豐富,提取溶出率高,因此鹵汁中膠原蛋白含量也很高,但是膠原蛋白在溫度較低時(shí)結(jié)成胨狀,使得鹵汁難以利用。通過(guò)酶水解可將鹵汁中的膠原蛋白降解成為氨基酸和多肽,不僅能豐富鹵汁的風(fēng)味,發(fā)揮出獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)功效和功能特性[15-20],而且也為鹵汁的回收利用創(chuàng)造條件。

本文采用動(dòng)物復(fù)合蛋白酶對(duì)經(jīng)7次鹵制后的鹽焗雞鹵汁進(jìn)行酶解并優(yōu)化其酶解工藝,進(jìn)一步分析了酶解后鹵汁中氨基酸組成,以期為鹽焗雞鹵汁的回收利用奠定基礎(chǔ)并提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白羽雞中翅 帶皮,雞齡52 d,廣州卜蜂蓮花超市某批次冷凍雞翅;鹵料 廣東好味來(lái)食品有限公司;動(dòng)物復(fù)合蛋白酶(包括內(nèi)切蛋白酶、外切蛋白酶,風(fēng)味酶等) 酶活力12萬(wàn)U/g,廣西龐博生物科技有限公司;其他試劑 均為分析純,廣州化學(xué)試劑廠。

L-8800型全自動(dòng)氨基酸分析儀、855-350型色譜柱(4.6 mm×60 mm) 日本Hitachi公司;AL204電子分析天平 瑞士Metter-Toledo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹵汁配制 將鹵料以沙姜0.5%,小茴香0.2%,香葉0.4%的比例配制,加水煮沸,慢火熬煮60 min,再添加調(diào)味料(NaCl的加入量為1%,乙基麥芽酚為1%,味精為0.4%,核苷酸二鈉(I+G)為0.021%,紅曲黃色素添加量為0.025 mg/mL)調(diào)配成鹵汁原汁。每次以料液質(zhì)量比1∶5的比例將焯水的雞翅置于80 ℃鹵汁原汁中鹵煮45 min,經(jīng)7次鹵制后得到鹵汁回收液。

1.2.2 鹵汁回收液酶解工藝 鹵汁回收液→過(guò)濾→取過(guò)濾液→調(diào)節(jié)pH→加酶水解→攪拌→滅酶→離心→取上清液測(cè)定氨基酸態(tài)氮和總氮含量。

操作要點(diǎn):

過(guò)濾:采用定性濾紙濾掉鹵汁中的碎骨肉及香辛料殘?jiān)?

調(diào)節(jié)pH:取25 mL濾液,滴加1.0 mol/L的氫氧化鈉或鹽酸溶液,將鹵汁的pH調(diào)至設(shè)一定值(5～9);

加酶水解:往鹵汁中加入一定量的動(dòng)物復(fù)合蛋白酶,置于一定溫度的怛溫水浴鍋中進(jìn)行水解反應(yīng);

滅酶:反應(yīng)完成后將水解液置于沸水浴中加熱15 min,使酶失活;

離心:將滅酶后的水解液于轉(zhuǎn)速為5000 r/min離心15 min,取上清液進(jìn)行測(cè)試。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)方案 固定酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間為6 h,pH為7.0,考察酶用量為0、2400、4800、7200、9600、12000、14400、16800 U對(duì)鹵汁回收液水解度的影響;固定酶用量為12000 U,酶解時(shí)間為6 h,pH為7.0,考察酶解溫度為30、40、50、60、70 ℃對(duì)鹵汁回收液水解度的影響;固定酶用量為12000 U,酶解溫度為50 ℃,pH為7.0,考察酶解時(shí)間為2、4、6、8、10、12 h對(duì)鹵汁回收液水解度的影響;固定酶用量為12000 U,酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間為6 h,考察pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0對(duì)鹵汁回收液水解度的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以水解度(DH)為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用Box-Behnken進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),采用Design-Expert(Version 8.0.5b)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析,對(duì)鹽焗雞鹵汁的酶法水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)因素水平編碼值見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface test

1.2.5 氨基酸態(tài)氮和總氮含量測(cè)定 氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定,參照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》;總氮測(cè)定,參照GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》進(jìn)行;水解度(DH)計(jì)算:

式中:A為水解后的氨基酸態(tài)氮含量,g/100 g;A0為水解前的氨基酸態(tài)氮含量,g/100 g;N為總氮含量,g/100 g。

1.2.6 游離氨基酸含量測(cè)定 取稀釋后的鹵汁溶液1 mL,加入等體積的濃度為6 g/100 mL的5-磺基水楊酸,反應(yīng)1 h后于14000 r/min離心15 min。取上清液,過(guò)濾后采用氨基酸分析儀進(jìn)行分析。測(cè)試條件:855-350型色譜柱(4.6 mm×60 mm);柱溫134 ℃;雙通道紫外檢測(cè)波長(zhǎng)440和570 nm;進(jìn)樣量20 μL,時(shí)間148 min。根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度與峰面積的關(guān)系,外標(biāo)法定量鹵汁樣品中的氨基酸組分,單位以g/100 g表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,采用Origin 8.5軟件進(jìn)行作圖分析,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,結(jié)果均以平均值(標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Duncan’s新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)(SSR法)檢驗(yàn)在0.05水平下的差異顯著性(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1可知,不加蛋白酶時(shí),由于雞肉蛋白中具有少量?jī)?nèi)源性蛋白酶[20],蛋白質(zhì)有所水解,但水解度不高。加入蛋白酶后,水解度顯著增大(p<0.05),隨著蛋白酶用量的增加,酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解作用增強(qiáng),水解度呈不斷上升的趨勢(shì)。當(dāng)加酶量超過(guò)12000 U時(shí),水解度無(wú)明顯增加(p>0.05)。可能原因是當(dāng)加酶用量達(dá)到一定值時(shí),酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和[21],再繼續(xù)增大酶用量,水解反應(yīng)速度幾乎沒(méi)有變化。在實(shí)際生產(chǎn)中,從經(jīng)濟(jì)性考慮,確定加酶量為12000 U。

圖1 酶添加量對(duì)鹵汁酶水解度的影響Fig.1 Influence of proteinase dosage on the degree of hydrolysis注:不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖2～圖4同。

圖2表明,鹵汁初始pH在5.0～7.0之間時(shí),水解度隨著pH升高,呈逐漸上升趨勢(shì);pH為7.0時(shí),鹵汁水解度達(dá)到最大,為15.37%;此后繼續(xù)增大初始pH,水解度下降。這是由于pH是決定酶催化活性的重要參數(shù)之一,它可以影響酶與底物的結(jié)合與催化,且動(dòng)物復(fù)合蛋白酶有其最適的pH范圍,當(dāng)pH過(guò)大時(shí),部分蛋白酶的構(gòu)象發(fā)生改變,使其活性降低[22]。

圖2 pH對(duì)鹵汁酶水解度的影響Fig.2 Influence of pH on the degree of hydrolysis

從圖3可看出,當(dāng)酶解溫度低于50 ℃時(shí),水解度隨著溫度升高顯著增大(p<0.05),當(dāng)溫度為50 ℃時(shí),水解度達(dá)到最大(15.27%),此時(shí)再升高溫度,水解度降低?？梢?jiàn),在酶解過(guò)程中,適當(dāng)提高溫度可增加酶的活力;但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí),酶受熱使其構(gòu)像被破壞,酶的穩(wěn)定性下降,酶解效率也隨之降低[23]。

圖3 酶解溫度對(duì)鹵汁酶解的影響Fig.3 Influence of temperature on the degree of hydrolysis

圖4為酶解時(shí)間對(duì)鹵汁水解度的影響。隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng),鹵汁的水解度逐漸增大,當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到6 h后,水解度增加幅度趨于平緩。這是因?yàn)榈鞍追肿由系拿缸饔梦稽c(diǎn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少,同時(shí)酶解產(chǎn)物的累積抑制酶促反應(yīng)的進(jìn)行[24]。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)鹵汁酶解的影響Fig.4 Influence of time on the degree of hydrolysis

2.2 酶解工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從實(shí)際生產(chǎn)出發(fā),選取合適的溫度和時(shí)間對(duì)于節(jié)能減排和經(jīng)濟(jì)效益的意義較大,故選擇酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間3個(gè)因變量為考察因素,以DH為評(píng)價(jià)指標(biāo),酶用量為12000 U,對(duì)鹵汁酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。表2是17個(gè)實(shí)驗(yàn)組合點(diǎn)以及對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)包括12個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)。酶解工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以鹵汁水解度為響應(yīng)值(R),利用Design Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到了回歸方程模型方差分析(表3)及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)(表4)。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance Test of Coefficient of Regression Equation

由表3、表4可知,通過(guò)Design Expert8.0.5b軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸二次多項(xiàng)式擬合,得到預(yù)測(cè)模型為:

R=15.29-0.099A+0.085B+0.51C-1.59A2-1.44B2-0.33C2-0.22AB-0.17AC-0.37BC。

由表4亦可知,酶解時(shí)間、酶解初始pH 2個(gè)因素對(duì)鹵汁酶解效果的影響均顯著(p<0.05),其中酶解初始pH對(duì)鹵汁酶解效果的影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。酶解時(shí)間和酶解溫度、酶解時(shí)間與酶解pH及酶解溫度和酶解pH有顯著交互作用。交互作用響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5～圖7。

從圖5可以看出,當(dāng)pH一定時(shí),在選定的條件范圍內(nèi),鹵汁水解度較高值在酶解溫度45～55 ℃,酶解時(shí)間為5～7 h的范圍內(nèi),當(dāng)酶解溫度小于50 ℃,酶解時(shí)間小于6 h時(shí),隨著酶解溫度升高,酶解時(shí)間延長(zhǎng),鹵汁水解度大幅度上升,表現(xiàn)為響應(yīng)面圖的陡峭上升趨勢(shì);當(dāng)酶解溫度大于50 ℃,酶解時(shí)間大于6 h時(shí),隨著溫度升高,時(shí)間延長(zhǎng),水解度呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明最佳酶解溫度和最佳酶解時(shí)間都在實(shí)驗(yàn)選定范圍內(nèi)。

圖5 酶解時(shí)間與酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.5 Influence of enzymolysis time and temperature on the degree of hydrolysis

圖6表明,當(dāng)酶解溫度一定時(shí),在選定的條件范圍內(nèi),鹵汁水解度較高值在酶解初始pH7.0～7.5,酶解時(shí)間為6 h左右的范圍內(nèi),當(dāng)pH大于6.0,酶解時(shí)間小于6 h時(shí),隨著pH升高,酶解時(shí)間延長(zhǎng),響應(yīng)面圖呈陡峭上升趨勢(shì),當(dāng)pH大于7.5時(shí),增速減緩,酶解時(shí)間大于6 h時(shí),鹵汁水解度不斷下降。

圖6 酶解初始pH和酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.6 Influence of initial pH and enzymolysis time on the degree of hydrolysis

由圖7可知,當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí),隨著pH增大,酶解溫度升高,水解度呈先上升后下降的變化趨勢(shì),鹵汁水解度較高值在pH7.0～7.5,酶解溫度為45～55 ℃的范圍內(nèi)。

圖7 酶解初始pH與酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.7 Influence of initial pH and enzymolysis temperature on the degree of hydrolysis

采用Design Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行分析,可以求得水解度預(yù)測(cè)值為15.46%的優(yōu)化酶解條件為:酶解pH7.60、酶解時(shí)間5.90 h、酶解溫度48.37 ℃。為了方便實(shí)際生產(chǎn)時(shí)容易控制,設(shè)定實(shí)際操作中酶解pH為7.6、酶解時(shí)間為6 h、酶解溫度為48 ℃,進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得鹵汁水解度平均值為14.73%±0.63,與預(yù)測(cè)結(jié)果相近,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證了鹵汁酶解的最優(yōu)條件。

2.3 酶解工藝對(duì)鹵汁回收液中氨基酸成分的影響

對(duì)酶解前后的鹵汁回收液中氨基酸成分進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 酶解前后鹵汁回收液中氨基酸組分及其含量(mg/L)Table 5 Amino acids composition and their contents in marinade before and after enzymatic hydrolysis(mg/L)

續(xù)表

由表5可知,酶解前的鹵汁中氨基酸種類為25種,其中包含有八種人體必需氨基酸、各種鮮味氨基酸及藥效氨基酸,氨基酸主要來(lái)源于雞肉、香辛料及添加的鮮味劑等方面。酶解后的鹵汁中氨基酸種類增加為30種,增加了磷酸絲氨酸、磷酸乙醇胺、α-氨基已二酸、α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、胱氨酸,與陳怡穎等[25]研究結(jié)果相符,而乙醇胺則沒(méi)有在酶解后的鹵汁中檢測(cè)出,這是由于在酶解前使用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)鹵汁的pH以保證酶的催化活性,而乙醇胺會(huì)與其反應(yīng)生成其他非氨基酸類物質(zhì)[26]。α-氨基已二酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品工業(yè)等領(lǐng)域,也被用作合成特殊化學(xué)物質(zhì)的中間體,如低熱質(zhì)甜味劑、鰲合劑以及多肽,此外,它還是賴氨酸合成途徑的一個(gè)代謝中間產(chǎn)物,并與由瓜氨酸向精氨酸的氨基化有關(guān)。α-氨基丁酸和β-氨基丁酸是酶解的中間產(chǎn)物,由谷氨酸脫羧后生成。胱氨酸為氨基酸類藥物,能促進(jìn)細(xì)胞氧化還原功能,使肝臟功能旺盛,并能中和毒素、促進(jìn)白細(xì)胞增生、阻止病原菌發(fā)育[27]。

酶解后的鹵汁中不僅氨基酸的種類增加,各類氨基酸的含量出現(xiàn)了較大的增長(zhǎng)。酶解后的氨基酸總量相比于酶解前增加了3.67倍,必需氨基酸含量增加了9.56倍,鮮味氨基酸和藥效氨基酸由于包含了谷氨酸,基數(shù)較大,增加幅度相對(duì)較小,其中鮮味氨基酸增加了2.7倍,藥效氨基酸增加了3.06倍。

酶解鹵汁中具備功能活性的非蛋白氨基酸含量也有明顯增加,如γ-氨基丁酸、肌肽等。其中,γ-氨基丁酸增加幅度較小,僅增加2.76倍。而肌肽含量增加較多,酶解后的肌肽含量由41.66 mg/mL增加至327.10 mg/mL,增加了6.98倍。γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然活性成分,為非蛋白質(zhì)氨基酸,具有鎮(zhèn)靜神經(jīng)、抗焦慮、降血壓、改善腦機(jī)能,具增強(qiáng)記憶力、改善失眠等功效[28-29]。與劉玉凌等[30]研究結(jié)果相符,酶解后制得的雞肉湯所含的低分子揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類和含量遠(yuǎn)比未經(jīng)水解的雞肉制得的多。肌肽是一種天然的生物活性肽,它廣泛存在于動(dòng)物的肌肉中,主要組成是β-丙氨酰和L-組氨酸。研究表明肌肽不僅能夠影響食品風(fēng)味的形成,還具備抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗癌等多種活性功能[31-32]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,確定鹽焗雞鹵汁酶法水解的最優(yōu)工藝條件為:酶用量12000 U,酶解溫度48 ℃,pH7.6,酶解時(shí)間6 h,此條件下鹵汁水解度為14.73%,模型預(yù)測(cè)值為15.46%,誤差為0.73%。表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的水解工藝參數(shù)可靠,有較好的實(shí)用價(jià)值。

酶解后鹵汁中游離氨基酸種類達(dá)到30種,主要包含有8種人體必需氨基酸、鮮味氨基酸和藥效氨基酸,與酶解前相比,新增氨基酸5種,氨基酸總量增加了3.67倍,必需氨基酸含量增加了9.56倍,鮮味氨基酸、藥效氨基酸及肌肽含量分別增加了2.7倍、3.06倍、6.98倍。

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