ASA處理對(duì)采后蘋果霉心病控制 及活性氧代謝的誘導(dǎo)

鄧惠文,趙 磊,王錦鋒,王應(yīng)強(qiáng)

(1.隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院,甘肅慶陽(yáng) 745000;2.隴東學(xué)院機(jī)械工程學(xué)院,甘肅慶陽(yáng) 745000)

霉心病是嚴(yán)重的蘋果采后侵染性病害,分為腐爛型、霉心型和褐變型[1]。霉心病在果實(shí)成熟期和貯藏期以粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)侵染引起的腐爛型為主,主要癥狀表現(xiàn)為蘋果胴部出現(xiàn)褐色、水漬狀和不規(guī)則濕腐斑,斑塊逐漸相連成片,果實(shí)心室組織和部分果組織腐爛[2]。富士蘋果是我國(guó)種植面積最大的蘋果品種,也是極易感霉心病的品種[1,3]。由T.roseum侵染引起的霉心病明顯降低富士蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì),造成果實(shí)采后貯藏期間爛損[4]。目前,主要通過化學(xué)合成殺菌劑控制霉心病,但長(zhǎng)期使用,其殺菌功效降低[5-6],還會(huì)引起環(huán)境污染,影響人類健康等[7]。

乙酰水楊酸(ASA)是水楊酸(SA)的衍生物,在植物體內(nèi)很容易轉(zhuǎn)化為SA,可提高植物對(duì)多種非生物脅迫的抗性[8]。SA能夠作為一種信號(hào)分子參與植物系統(tǒng)性抗病反應(yīng),誘導(dǎo)多種植物獲得抗病性[9-10]。近年來,SA被廣泛應(yīng)用于提高果蔬采后抗病性,例如SA可有效控制厚皮甜瓜的粉霉病[11]、芒果的炭疽病[12]、蘋果的輪紋病[13]。目前為止,尚未見到ASA處理對(duì)T.roseum引起的富士蘋果霉心病控制的相關(guān)報(bào)道。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)采用0.5、1、2、4 mmol/L ASA處理蘋果觀察其對(duì)霉心病的控制效果,結(jié)果表明，2 mmol/L ASA處理對(duì)創(chuàng)傷接種T.roseum蘋果的果心和果肉的控制效果較好。

本實(shí)驗(yàn)以“紅富士蘋果”為材料,研究采后ASA浸泡處理對(duì)富士蘋果果肉部分損傷接種T.roseum之后的病斑直徑、自然發(fā)病率的影響,探索ASA處理對(duì)活性氧代謝相關(guān)酶活性及代謝產(chǎn)物積累的影響,旨在為ASA在采后蘋果霉心病病害控制中的應(yīng)用及其作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅富士蘋果 于2016年9月采自甘肅省慶陽(yáng)市西峰區(qū)溫泉鄉(xiāng),挑選無機(jī)械和病蟲害傷、大小均一、7～8成熟度的果實(shí)于常溫(22±2) ℃、相對(duì)濕度50%下貯藏待用;供試粉T.roseum分離于自然發(fā)病的富士蘋果,在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)上保存待用;ASA 分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn);聚乙烯吡咯烷酮(PVPP) 上海寶曼生物技術(shù)有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 北京普博斯生物有限公司;NADPH、α-萘胺、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、四氯化鈦、XTT、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、丙酮、H2O2、氨水、硫酸、鹽酸 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2550紫外可見分光光度計(jì) 日本島津;Thermo8600超低溫冰箱 杭州明凱科技有限公司;TGL-16低溫離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司;SW-CT-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ASA浸泡處理 參照Bi等[14]方法稍作修改。將蘋果果實(shí)分別用自來水和0.02%次氯酸鈉沖凈并晾干,置于2 mmol/L的ASA溶液中浸泡10 min,取出晾干后,放入紙箱,作為處理組,于常溫(22±2) ℃、相對(duì)濕度55%左右條件下貯藏待用。以自來水處理的果實(shí)作對(duì)照組。

1.2.2 取樣方法 參照Bi等[15]方法并修改。分別在處理后0、2、4、6、8和10 d取健康組織和發(fā)病組織交界處果肉皮下3 mm處的果肉組織3.0 g,錫箔紙包好后液氮冷凍,保藏于-80 ℃超低溫冰箱中待測(cè)。每個(gè)處理時(shí)間取樣用9個(gè)果實(shí),重復(fù)3次。

1.2.3 病斑直徑及自然發(fā)病率測(cè)定

1.2.3.1 病斑直徑 參照葛永紅[16]的方法并稍作修改。取ASA處理后常溫貯藏2 d的果實(shí),經(jīng)75%酒精表面消毒后,用直徑3 mm滅菌鐵釘在果實(shí)表面等距離刺孔4個(gè)。分別接種30 μLT.roseum孢子懸浮液(1×106個(gè)/mL)于孔內(nèi)。晾干后放入聚乙烯塑料袋中,于室溫(22±2) ℃、相對(duì)濕度85%條件下貯藏,分別在3、6、9和12 d后測(cè)量病斑直徑,無菌水處理作為對(duì)照。

1.2.3.2 自然發(fā)病率 ASA處理和對(duì)照組果實(shí)放置于20 ℃、相對(duì)濕度85%條件下貯藏,定期統(tǒng)計(jì)果實(shí)自然腐爛情況并計(jì)算腐爛率。每個(gè)處理組用果實(shí)10個(gè),重復(fù)3次。

1.2.5 H2O2含量 參照Prochazkova等[18]方法并稍作修改。取3.0 g果肉組織(ASA處理和對(duì)照組),加入2 mL冷丙酮,冰浴磨成漿后于4 ℃,9000 r/min條件下離心20 min,取1 mL上清液,加入200 μL濃氨水和200 μL 10%四氯化鈦溶液,混勻反應(yīng)5 min后離心15 min,沉淀部分用冷丙酮洗滌5次后溶于2 mL 1 mmol/L H2SO4溶液,于410 nm測(cè)定溶液的吸光度值。H2O2含量以ΔOD410/g FW-1表示。

1.2.6 NADPH氧化酶(NOX)活性 參照Sagi等[19]方法并稍作修改。取300 μL的細(xì)胞膜微膜囊依次加入2 mL 100 mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.5),0.5 mmol/L XTT,100 μmol/L NADPH,最后加入NADPH啟動(dòng)酶促反應(yīng),以蒸餾水作參照,記錄2 min內(nèi)反應(yīng)體系在470 nm處吸光度值的變化,NOX活性表示為ΔOD470·min-1·mg-1protien。

1.2.7 超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性 SOD的活性測(cè)定:參照Oberley等[20]方法并稍作修改。取5 mL指形管4支,2支為測(cè)定管,另2支為對(duì)照管,依次加入2 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液、0.3 mL 150 mmol/L甲硫氨酸(MET)溶液、0.3 mL 750 μmol/L氮藍(lán)四唑(NBT)溶液、0.3 mL 100 μmol/L EDTA-Na2溶液、0.3 mL粗酶液,0.3 mL 20 μmol/L核黃素。對(duì)照管以緩沖液代替酶液,混勻后將1支置于暗處,其它各管于4000 LUX日光燈下反應(yīng)15 min。至反應(yīng)結(jié)束后,以不照光管做空白參比,于560 nm處分別測(cè)定其它各管的吸光度值。SOD活性以U/mg protein表示。

CAT的活性:參照Clairbone等[21]方法并稍作修改。取2 mL 10 mmol/L H202和200 μL粗酶液反應(yīng)液在240 nm處測(cè)吸光度值,連續(xù)測(cè)定2 min,以每分鐘吸光度值變化0.01為1個(gè)CAT活力單位(U),以U/mg Protein表示其活性。重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.8 POD活性 參照Liu等[22]方法并稍作修改。取冷凍的果肉組織3.0 g,加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的100 mmol/L磷酸緩沖液,冰浴下研磨成漿,在4 ℃ 11250 r/min條件下離心20 min,取200 μL上清液加入200 μL 250 mmol/L H2O2和2.5 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚,15 s后開始記錄反應(yīng)體系在470 nm處2 min內(nèi)吸光度值變化,以每分鐘吸光度值變化0.01為1個(gè)POD活力單位(U),酶活性表示為U/mg protein。重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析,Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASA處理對(duì)蘋果果實(shí)損傷接種T. roseum后病斑直徑和發(fā)病率的影響

ASA處理組與對(duì)照組果實(shí)損傷接種T.roseum后,ASA處理能夠明顯降低(p<0.05)果實(shí)的病斑直徑。接種后第9和12 d分別較對(duì)照組降低17.39%和16.29%(圖1A)。同樣,ASA處理果實(shí)的自然發(fā)病率明顯低于對(duì)照(p<0.05)。在貯藏1周后,對(duì)照果實(shí)開始發(fā)病,貯藏第2、3和4周時(shí),經(jīng)ASA處理的果實(shí)發(fā)病率分別為對(duì)照組果實(shí)的18.75%、31.57%和56.18%(圖1B)。

圖1 ASA處理對(duì)富士蘋果損傷接種T. Roseum 后病斑直徑(A)和自然發(fā)病率(B)的影響Fig.1 Effect of ASA treatment on the lesion diameter(A) and natural disease incidence(B)of apple fruit inoculated with T. Roseum注:圖中ASA處理組和對(duì)照組相同字母時(shí)表示差異不顯著(p>0.05),不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 ASA處理對(duì)富士蘋果果實(shí)H2O2含量和產(chǎn)生速率影響

圖2 ASA處理對(duì)富士蘋果果實(shí) 產(chǎn)生速率(A)和H2O2含量(B)的影響。Fig.2 Effect of ASA treatment on the rate of production(A)and the content of H2O2(B)in apple(Fuji)fruit

2.3 ASA處理對(duì)富士蘋果果實(shí)NADPH氧化酶和SOD活性的影響

采后ASA浸泡處理可以有效提高果實(shí)NOX活性(圖3A)。貯藏過程中,NOX活性總體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。從貯藏第2 d 起,ASA處理果實(shí)明顯高于對(duì)照(p<0.05),處理后第4 d和第6 d,分別較對(duì)照組高64.43%和26.68%。同樣,ASA處理也明顯增強(qiáng)了SOD活性(p<0.05)(圖3B),處理后第8 d和第10 d分別較對(duì)照組果實(shí)高14.2%和24.42%。

圖3 ASA處理對(duì)富士蘋果果實(shí) NOX(A)和SOD(B)活性的影響。Fig.3 Effects of ASA treatment on NOX(A) and SOD(B)activities in apple(Fuji)fruit

2.4 ASA處理對(duì)富士蘋果果實(shí)POD和CAT活性的影響

隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng),處理組與對(duì)照組果實(shí)POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在貯藏第8 d活性達(dá)到最大值。ASA處理可提高果實(shí)POD的活性,處理后第8 d時(shí),存在顯著性差異(p<0.05),處理組較對(duì)照高41.58%(圖4A)。處理與對(duì)照果實(shí)的CAT活性均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),但ASA處理抑制了果實(shí)CAT活性,處理后第6 d時(shí)差異顯著(p<0.05),處理組較對(duì)照低42.9%(圖4B)。

圖4 ASA處理對(duì)富士蘋果果實(shí) POD(A)和CAT(B)活性的影響。Fig.4 Effects of ASA treatment on POD(A) and CAT(B)activities in apple(Fuji)fruit

3 結(jié)論與討論

本研究表明,ASA處理能夠有效抑制損傷接種T.Roseum后富士蘋果果實(shí)果肉部分霉心病發(fā)病率和病斑直徑的擴(kuò)展。馬凌云等[23]研究發(fā)現(xiàn)ASA處理能夠抑制采后油桃果實(shí)冷藏條件的發(fā)病率,在葡萄[24]和芒果[12]上的研究也發(fā)現(xiàn)ASA處理能夠有效抑制葡萄霜霉病和綠芒果炭疽病的病斑直徑。

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