普魯蘭多糖/槐糖脂抑菌保鮮膜的制備

葛 晨,商夢(mèng)潔,陶雙雙,李俊峰,梁生康,李紅芳,*

(1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院,山東青島 266042;2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266100)

傳統(tǒng)不可再生的塑料保鮮膜難以降解,可食用生物保鮮膜作為其替代品,逐漸成為保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]?？墒秤媚ぐ磥?lái)源可分為多糖類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)、脂質(zhì)類(lèi)、復(fù)合型可食用膜等。一般而言,多糖類(lèi)可食用膜較蛋白質(zhì)類(lèi)、脂質(zhì)類(lèi)更為穩(wěn)定,且阻水性和抗氧性好,可延長(zhǎng)食品的貨架期,應(yīng)用于保鮮領(lǐng)域[2]。多糖中,普魯蘭多糖較其他多糖粘度低,與塑料合成膜性質(zhì)相似[3],同時(shí)可生物降解,作為成膜材料綠色環(huán)保。目前已有研究者制備出普魯蘭多糖-海藻酸鈉-羧甲基纖維素復(fù)合膜[4],普魯蘭多糖-殼聚糖復(fù)合膜[5]和普魯蘭多糖-明膠復(fù)合膜[6]。單獨(dú)使用普魯蘭多糖制作的薄膜脆而軟[7],卻能大大節(jié)約成本,簡(jiǎn)化保鮮膜的生產(chǎn)工藝。加入甘油作為增塑劑[8],可增加膜的柔韌性,但會(huì)降低膜對(duì)水蒸汽和氣體的阻隔性能[9]?；碧侵锉砻婊钚詣┛梢欢ǔ潭葟浹a(bǔ)甘油的不足,在成膜過(guò)程中起關(guān)鍵作用?；碧侵粌H具有食品保鮮[10]和抑菌功能[11],還具有清潔劑和乳化劑的功效[12],其作為成膜材料國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以普魯蘭多糖、甘油、槐糖脂為原料制備抗菌保鮮膜,采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定保鮮膜各方面性能最佳的配方,通過(guò)水果保鮮實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證保鮮膜在實(shí)際應(yīng)用中的保鮮能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普魯蘭多糖 食品純,本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵制備(以廢糖蜜為發(fā)酵原料);C18槐糖脂 生物純,本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵制備(以廢糖蜜和煎炸廢油為發(fā)酵底物);甘油 分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;櫻桃 當(dāng)天采摘的新鮮水果;大腸桿菌(EscherichiacoliTop10)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)、白色假絲酵母菌(CandidaalbicansATCC 10321) 青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保藏。

ME204E分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2102 PCS型紫外可見(jiàn)光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海驚宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;NDJ-8S旋轉(zhuǎn)粘度計(jì) 上海平軒科學(xué)儀器有限公司;外經(jīng)千分尺 無(wú)錫錫工量具有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 保鮮膜的制備 取一定量甘油、槐糖脂溶于25 mL水中,加入一定量普魯蘭多糖,加熱溶解并攪拌均勻,60 ℃超聲波(40 kHz,200 W)去氣泡30 min,然后在玻璃板上倒入一定量的膜液,涂抹均勻。由于成膜溫度對(duì)膜性能會(huì)產(chǎn)生影響[4],分別在40、60、80 ℃的溫度下處理2 h,冷卻至室溫后揭膜。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以普魯蘭多糖、槐糖脂、甘油為基準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):槐糖脂為3.2 g/L,甘油為10 g/L,普魯蘭多糖濃度為8、12、16、20、24 g/L;普魯蘭多糖為16 g/L,甘油為10 g/L,槐糖脂濃度為0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 g/L;普魯蘭多糖為16 g/L,槐糖脂為3.2 g/L,甘油濃度為5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g/L;按照上述配方配制不同膜液,成膜后進(jìn)行性能測(cè)定,確定適宜正交實(shí)驗(yàn)水平。

1.2.3 厚度測(cè)定 從制成的完整膜上隨機(jī)選取5個(gè)2 cm×2 cm的膜,測(cè)其厚度。

1.2.4 透光率測(cè)定 將膜樣品貼于比色皿外,置于波長(zhǎng)為600 nm的紫外可見(jiàn)光光度計(jì)中,測(cè)其透光率[6]。

1.2.5 水溶性測(cè)定 取裁剪成規(guī)格為2 cm×2 cm的膜樣品,室溫下攪拌溶解,記錄樣品溶解時(shí)間[6]。

1.2.6 透油性測(cè)定 將膜置于濾紙上,在膜不同位置滴的植物油,觀察并測(cè)量油滴在濾紙上擴(kuò)散圈的直徑。

1.2.7 透水蒸汽性測(cè)定 按照GB 1037-88[13]中透水蒸汽性的測(cè)定方法,在試管底部裝入適量已經(jīng)烘干至恒重的無(wú)水氯化鈣,控制內(nèi)部恒定的濕度,將保鮮膜覆蓋于試管口,2 d后根據(jù)公式(1)計(jì)算透水蒸汽性。

式(1)

式中:A為有效測(cè)定面積,m2;t為測(cè)量間隔時(shí)間,d;L為膜的厚度,mm;ΔP為膜兩側(cè)的水蒸汽壓差,kPa;m1為膜+試管+無(wú)水氯化鈣的原始重量,g;m2為2 d后膜+試管+無(wú)水氯化鈣的重量,g。

1.2.8 粘度測(cè)定 采用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)進(jìn)行膜液的粘度測(cè)定,具體步驟:先對(duì)粘度計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn),隨后潤(rùn)洗轉(zhuǎn)子,將轉(zhuǎn)子置于膜液中,設(shè)置轉(zhuǎn)速為6 r/min,待讀數(shù)穩(wěn)定時(shí),記錄數(shù)據(jù)。

1.2.9 抑菌實(shí)驗(yàn) 將指示菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色假絲酵母菌均劃線(xiàn)活化,挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用移液槍分別移取0.1 mL菌液,轉(zhuǎn)接到含不同濃度槐糖脂的液體培養(yǎng)基中,適宜溫度,160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。采用稀釋平板涂布法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),具體步驟:吸取0.5 mL培養(yǎng)液,進(jìn)行10倍梯度稀釋,選擇3個(gè)合適的稀釋度,分別吸取0.1 mL稀釋液進(jìn)行平板涂布,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌放置37 ℃,白色假絲酵母菌放置30 ℃,恒溫培養(yǎng)24 h,觀察生長(zhǎng)情況并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。抑菌率M0可用下式表示[14]:

式(2)

式中,y0表示未加槐糖脂的菌落數(shù),y1表示加槐糖脂的菌落數(shù)。抑菌率越大,抑菌效果越好。

1.2.10 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.11 水果感官評(píng)價(jià) 參照GB T23351-2009[15]制定出櫻桃感官評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(表2)。將櫻桃隨機(jī)分為5組,每組10個(gè),分別進(jìn)行不同的保鮮處理:第1組:將櫻桃置于培養(yǎng)皿上,用稀釋10倍的膜液涂抹果皮,自然風(fēng)干;第2組:將櫻桃置于培養(yǎng)皿上,用原膜液涂抹果皮,自然風(fēng)干;第3組:將櫻桃置于錐形瓶中,用制得的保鮮膜覆蓋瓶口;第4組:將櫻桃置于保鮮袋中,密封保存;第5組:不作任何包裹,放置在培養(yǎng)皿上。將上述5組櫻桃室溫貯藏,24 h為周期觀察,記錄櫻桃的形態(tài)變化及腐爛程度,并根據(jù)感官評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分,每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行,按下列公式計(jì)算新鮮指數(shù)[16]:

表2 櫻桃感官評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of cherries

式(3)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)采用Origin 9.0作圖軟件,SAS 9.4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 普魯蘭多糖量對(duì)成膜性能的影響 由表3可得,當(dāng)普魯蘭多糖濃度為16 g/L時(shí),膜的各項(xiàng)性能良好,低濃度時(shí),膜的厚度變小,膜硬而脆,不易揭下,透水蒸汽性高,性能不穩(wěn)定,高濃度時(shí),透水蒸汽性有所下降,這是由普魯蘭多糖致密的結(jié)構(gòu)所決定的[7],但膜的厚度、粘度增加,膜的成本也相應(yīng)增加,且透光率下降,故選擇普魯蘭多糖的濃度為16 g/L。

表3 不同濃度普魯蘭多糖對(duì)成膜性能的影響Table 3 Effects of different concentrations of pullulan on film performance

2.1.2 甘油量對(duì)成膜性能的影響 甘油濃度低于10 g/L時(shí),所成膜較軟,不利于揭膜,濃度的增加可增加膜的柔韌性,利于揭膜,同時(shí),對(duì)粘度、水溶性影響不大。甘油是親水物質(zhì),與普魯蘭多糖和槐糖脂混合時(shí),嵌入分子中間,降低了分子間作用力,甘油濃度過(guò)大,透水蒸汽性增加,膜的穩(wěn)定性降低[17],甘油濃度為10 g/L時(shí),厚度和透光率最大,性能穩(wěn)定,故選擇此濃度為甘油的添加濃度,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同濃度甘油對(duì)成膜性能的影響Table 4 Effects of different concentrations of glycerol on film performance

2.1.3 槐糖脂量對(duì)成膜性能的影響 當(dāng)槐糖脂濃度為2.4 g/L時(shí),膜的水溶性和透水蒸汽性最小,此時(shí)膜的致密性和溶解性最好,濃度的改變對(duì)厚度、透光率影響較小,當(dāng)濃度減少時(shí),透水蒸汽性增加,膜性能不穩(wěn)定,隨著濃度的增加,粘度呈增大趨勢(shì),膜與界面張力不斷減小[18],揭膜容易,原因是槐糖脂由親水的槐糖與親油的羥基脂肪酸以縮醛形式結(jié)合而成,高濃度槐糖脂使揭膜過(guò)程中,膜易與成膜介質(zhì)分離(表5)。

表5 不同濃度槐糖脂對(duì)成膜性能的影響Table 5 Effects of different concentrations of sophorolipids on film performance

2.1.4 槐糖脂量對(duì)抑菌性能的影響 本文研究了不同濃度槐糖脂的抑菌效果,結(jié)果如表6所示,當(dāng)槐糖脂濃度為0.8 g/L時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率達(dá)到94.34%,當(dāng)濃度增加到2.4 g/L時(shí),金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)幾乎完全被抑制,具有良好的抑制效果。對(duì)大腸桿菌和白色假絲酵母菌也有一定的抑制作用(表6),當(dāng)槐糖脂濃度為4.0 g/L時(shí),對(duì)大腸桿菌的抑菌率為28.75%;對(duì)白色假絲酵母菌的抑制效果達(dá)14.53%的抑菌率,且在顯微鏡下觀察不到白色假絲酵母菌的菌絲(表6)。有文獻(xiàn)報(bào)道,槐糖脂濃度達(dá)到3.0 g/L時(shí),可以抑制95%以上空氣中的微生物[19],與本文的研究結(jié)果相近。Zhang等[20]研究了不同結(jié)構(gòu)槐糖脂對(duì)E.coliO157∶H7的抑制作用時(shí),發(fā)現(xiàn)內(nèi)酯型較自由酸型、C18較C16的抑菌效果更明顯,與本實(shí)驗(yàn)采用的內(nèi)酯型含量為70%～80%的C18槐糖脂研究結(jié)果一致。金黃色葡萄球菌引起的食品污染僅次于大腸桿菌,與乳制品變質(zhì)、果蔬腐爛有關(guān)[21],胡靜等[22]研究表明,槐糖脂對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理主要作用于菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期,破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的形成?；碧侵瑢?duì)水果的主要腐敗菌霉菌、酵母菌的抑制效果較好[9],可用于果蔬易受感染的生長(zhǎng)發(fā)育期,在運(yùn)輸過(guò)程中延長(zhǎng)保質(zhì)期。Haque等[23]研究表明,槐糖脂可抑制白色假絲酵母菌細(xì)胞膜的合成,同時(shí)阻礙菌絲的合成,改變細(xì)胞形態(tài)。綜合膜的性能分析及對(duì)不同菌株的抑菌效果考慮,選擇槐糖脂的濃度為3.2 g/L。

表6 不同濃度槐糖脂的抑菌情況Table 6 Antimicrobial activity of different concentrations of sophorolipid

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

由于正交實(shí)驗(yàn)中所測(cè)指標(biāo)較多,不同性能最佳時(shí)成膜條件存在差異(表7),故采用加權(quán)求和法來(lái)確定膜液配方[4]。由于本文目的是獲得可涂抹于水果表面成膜的膜液,因此對(duì)粘度、水溶性和透水蒸汽性的極差結(jié)果加權(quán)求和,其中透水蒸汽性對(duì)膜性能影響最大,故分別賦予權(quán)重0.3、0.3、0.4,通過(guò)極差分析獲得最佳的成膜配方(表8)。

表7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of orthogonal tests

表8 極差分析Table 8 Range analysis

由表8可知,影響保鮮膜性能的主要因素為普魯蘭多糖和槐糖脂的含量。為保證保鮮膜的保鮮和易水洗的性能,應(yīng)控制透水蒸汽性和水溶性處于較低水平,較低的膜液粘度可以降低膜成本,故選擇粘度、水溶性、透水蒸汽性總體水平最低的配方A3B3C1,即普魯蘭多糖18 g/L、槐糖脂3.6 g/L、甘油8.75 g/L。此時(shí)膜的性能為:厚度0.423 mm,粘度5.668 Pa·s,溶解時(shí)間130.5 s,透水蒸汽性57.426 g·mm/(kPa·d·m2),透光率34.7%,且不透油(圖1)。

圖1 透油性結(jié)果Fig.1 The result of oil transmission rate注:a:抗菌保鮮膜,b:濾紙。

與肖茜等[4]制備的普魯蘭多糖/海藻酸鈉/羧甲基纖維素復(fù)合膜相比,膜的厚度基本一致,而膜實(shí)際厚度與干燥前的膜液量有關(guān),可根據(jù)保鮮需要增減膜液量以達(dá)到不同的厚度;溶解時(shí)間基本相同,膜的原料都可溶于水,因此覆蓋于蔬果表面時(shí)更易洗去。膜液的粘度明顯小于肖茜等[4]制備的復(fù)合膜液,分別為普魯蘭糖18 g/L時(shí)5.4 Pa·s和20 g/L時(shí)18.0 Pa·s。膜液脫氣泡更加容易,降低了生產(chǎn)成本。較于陳達(dá)佳等[24]制備的膠原蛋白/殼聚糖復(fù)合膜,透水蒸汽性相差不大,阻隔性能較好,且本實(shí)驗(yàn)所制得的膜同樣不透油,可用于含脂類(lèi)食品的保鮮。與高丹丹等[6]制備的普魯蘭多糖/明膠復(fù)合膜相比,膜的透光率有所降低。綜上所述,與其他多糖保鮮膜相比,利用普魯蘭多糖、槐糖脂和甘油為原料的膜液粘度更小,且所成膜不透油,透水蒸汽性和水溶性均達(dá)到相同水平。

2.3 感官測(cè)評(píng)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組和稀膜液組的櫻桃72 h時(shí)出現(xiàn)個(gè)別霉變現(xiàn)象,原膜液、抗菌保鮮膜和塑料保鮮袋組在120 h內(nèi)保鮮效果較好,水果未出現(xiàn)霉變。以新鮮指數(shù)為指標(biāo),得到水果的感官評(píng)分(圖2)。從圖中可以看出,隨著保鮮時(shí)間的延長(zhǎng),各組櫻桃的新鮮指數(shù)隨之降低,反映水果的新鮮度下降。96 h后,本實(shí)驗(yàn)制得的抗菌保鮮膜和市面上的塑料保鮮袋無(wú)顯著差異,而保鮮膜、原膜液、保鮮袋與對(duì)照組之間差異極顯著(p<0.01),稀釋10倍的膜液與對(duì)照組差異不顯著(p>0.05)。說(shuō)明原膜液及所制抗菌保鮮膜均與塑料保鮮袋的保鮮效果相當(dāng),可用于水果的短期保鮮。顯著性分析顯示,120 h后,保鮮袋、保鮮膜和原膜液的新鮮指數(shù)與稀釋膜液和對(duì)照組之間差異極顯著(p<0.01)。結(jié)果說(shuō)明,將水果放在同一環(huán)境中處理相同的時(shí)間,相對(duì)于直接暴露在空氣中的水果,所制膜液及抗菌保鮮膜都有明顯的保鮮效果。張艷梅等[16]在低溫條件下利用魔芋葡甘聚糖復(fù)合膜對(duì)青椒保鮮30 d的實(shí)驗(yàn)中,15 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組保鮮效果明顯優(yōu)于常溫對(duì)照組,30 d時(shí)涂膜組青椒的衰老指數(shù)(新鮮指數(shù))與對(duì)照相差34.5%。本實(shí)驗(yàn)中處理時(shí)間為120 h時(shí),原膜液、保鮮膜、保鮮袋新鮮指數(shù)與對(duì)照組相差40%～50%,說(shuō)明原膜液和保鮮膜均有良好的保鮮效果。

圖2 不同保鮮處理的櫻桃新鮮指數(shù)隨時(shí)間的變化Fig.2 The freshing index of different cherry preservation treatment

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)分析,得到抗菌保鮮膜的最佳原料配比,普魯蘭多糖18 g/L、槐糖脂3.6 g/L、甘油8.75 g/L,干燥成膜溫度60 ℃,在此條件下,所得保鮮膜的性能最佳?；碧侵瑢?duì)大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、白色假絲酵母菌(C.albicans)都有一定的抑制效果,其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最為明顯,當(dāng)槐糖脂濃度大于2.4 g/L時(shí),幾乎完全抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

櫻桃通過(guò)涂抹保鮮膜膜液和抗菌保鮮膜覆蓋的新鮮指數(shù)明顯較高,衰老腐爛的速度較慢,可能所制抗菌保鮮膜在鎖住水分、阻隔氧氣方面有一定的作用。與傳統(tǒng)的塑料保鮮膜相比,由微生物發(fā)酵所得的普魯蘭多糖和槐糖脂及甘油為原料制得的抗菌保鮮膜,生物可降解性、食品保鮮性、抑菌性均有較好的改善和提高,可直接涂抹在果蔬表面成膜,便于果蔬的日常保鮮貯藏,延長(zhǎng)保鮮期,具有廣闊的發(fā)展前景。

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