羧甲基殼聚糖包裹椰子油脂質(zhì)體 制備的工藝優(yōu)化

呂方方,陳 華,宋 菲,李艷南

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430061;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所,海南文昌 571339;3.海南省椰子深加工工程技術(shù)研究中心,海南文昌 571339)

椰子(CocosnuciferaL.)是棕櫚科椰子屬植物,是熱帶地區(qū)主要的木本油料作物和食品能源作物,有“生命之樹”之稱。椰子果實(shí)中含油率約36%,天然椰子油中富含月桂酸(C12)、辛酸、癸酸等中短鏈脂肪酸,具有抑制細(xì)菌、抑制病毒、提高人體免疫力等功能[1]。脂質(zhì)體是一種新型的微膠囊化技術(shù),具有提高被包封物的穩(wěn)定性、利用率,并使其具有靶向性等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。由于椰子油油膩的口感和水溶性差,極大程度限制了椰子油的發(fā)展,因此為改善椰子油口感和水溶性,保護(hù)營養(yǎng)成分并使其實(shí)現(xiàn)靶向輸送,提高利用率,也為椰子油在食品工業(yè)及日用化學(xué)工業(yè)等方面的廣泛應(yīng)用提供一種方法,拓寬了椰子油的使用范圍。對于椰子油的研究除了其本身性質(zhì)外,利用不同的方法或者不同的膜材進(jìn)行微膠囊的制備也是熱點(diǎn)之一。

近十幾年來,羧甲基殼聚糖因其具有很好的生物相容性、可降解性、水溶性和保濕性等優(yōu)點(diǎn),在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)等領(lǐng)域被廣泛研究并取得一定的成果。如:在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⑵溆米靼鷤?、人造骨骼和藥物控緩釋載體。在化妝品中可替代價格昂貴且具有保濕性的透明質(zhì)酸,在食品工業(yè)上作為一種良好的保鮮劑,應(yīng)用于水果、蔬菜的保鮮。

國內(nèi)外對于脂質(zhì)體在化妝品、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域取得很大的進(jìn)展,特別是作為有效成分載體的研究和應(yīng)用[4]。目前,對于椰子油微膠囊的報(bào)道較為普遍,而關(guān)于椰子油脂質(zhì)體的研究至今未見任何報(bào)道。本文首次對椰子油脂質(zhì)體進(jìn)行制備,擬采用薄膜-超聲分散法[5-8]制備椰子油脂質(zhì)體,以包封率為指標(biāo),優(yōu)化脂質(zhì)體制備的工藝和配方,還對其進(jìn)行了顯微鏡觀察,檢測了包封率、MDA和釋放度,旨在制備出包封率高、穩(wěn)定性好和實(shí)現(xiàn)延緩釋放的椰子油脂質(zhì)體。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

椰子油 純度100%,文昌椰村人家椰子加工專業(yè)合作社;大豆卵磷脂(SPC) 純度>92%,浙江高茂生物科技;氫化大豆卵磷脂(HSPC) 純度>93%,河南華悅化工產(chǎn)品;膽固醇(CHO) 河南合生源化工有限公司;石油醚(60～90 ℃)、無水乙醇 分析純,海南宏遠(yuǎn)達(dá)科技有限公司。

XHF-D高速分散器 生物科技股份有限公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司;超聲波清洗機(jī) 深圳市超藝達(dá)科技有限公司;AL204-IC電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;UV752N紫外分光光度計(jì) 北京利康達(dá)圣科技發(fā)展有限公司;PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羧甲基殼聚糖(CMCT)包裹椰子油脂質(zhì)體的制備 取一定比例的磷脂(SPC和HSPC混合物,且質(zhì)量比為9∶1[9])、CHO、椰子油,加入50 mL無水乙醇，在8000 r/min高速分散器上分散溶解3 min,溶解后置于圓底燒瓶中，55 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去無水乙醇,直至在圓底燒瓶底部形成均勻薄膜后繼續(xù)蒸發(fā)30 min除去殘余乙醇;加入80 mL磷酸鹽(0.05 mol/L,pH6.5)緩沖液,在減壓條件下旋轉(zhuǎn),水合、洗膜30 min,之后在一定超聲強(qiáng)度下超聲一定時間,即得椰子油脂質(zhì)體。

將不同比例的羧甲基殼聚糖水溶液置于35 ℃水浴下,用電動攪拌器以600 r/min攪拌,同時緩慢滴加剛制備的椰子油脂質(zhì)體,待所有椰子油脂質(zhì)體懸浮液全部滴加進(jìn)入羧甲基殼聚糖溶液后,繼續(xù)攪拌30 min,調(diào)節(jié)pH至一定值,存于4 ℃冰箱中,所得羧甲基殼聚糖包裹椰子油脂質(zhì)體,表示為CMCT-椰子油脂質(zhì)體[10-11]。

1.2.2 工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 固定電動攪拌速度600 r/min,溫度35 ℃,磷脂與膽固醇質(zhì)量比4∶1,磷脂與椰子油質(zhì)量比1∶2.5,pH6.5,超聲強(qiáng)度為600 W,超聲時間10 min,分別以CMCT與磷脂質(zhì)量比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16)、磷脂與CHO質(zhì)量比(2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1)、磷脂與椰子油質(zhì)量比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)、介質(zhì)pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)、超聲強(qiáng)度(600、650、700、750、800 W)、超聲時間(10、20、30、40、50 min)6個因素為影響因素,考察各因素對包封率的影響。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2.2 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取CMCT與磷脂質(zhì)量比(A)、磷脂與CHO質(zhì)量比(B)、磷脂與椰子油質(zhì)量比(C)、介質(zhì)pH(D)、超聲強(qiáng)度(E)和超聲時間(F)6個因素,采用正交實(shí)驗(yàn)L18(63)對工藝進(jìn)行優(yōu)化,得出最優(yōu)配方并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得出最優(yōu)組合。各因素和水平見表1。

表1 因素實(shí)驗(yàn)水平表Table 1 Factor test level table

1.2.3 CMCT-椰子油脂質(zhì)體質(zhì)量評價

1.2.3.1 CMCT-椰子油脂質(zhì)體的微觀形態(tài) 將上述CMCT-椰子油脂質(zhì)體和經(jīng)無水乙醇稀釋40倍的椰子油用電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.3.2 包封率(Entrapment Efficiency,EE)的測定 配制一定濃度的椰子油-無水乙醇溶液,以無水乙醇為空白對照,經(jīng)紫外分光光度計(jì)在200～400 nm范圍內(nèi)掃描,獲得椰子油的最大吸收波長為225 nm。配制成一系列濃度梯度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過紫外可見分光光度計(jì)在225 nm處測定不同濃度下的椰子油-無水乙醇溶液的吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

精密量取1 mL CMCT-椰子油脂質(zhì)體,按占總體積比例計(jì)算其中所含椰子油量為m總,加入2 mL石油醚,3000 r/min離心5 min,萃取游離椰子油,分離石油醚與脂質(zhì)體,相同操作5次,殘留物用無水乙醇定容10 mL,于225 nm處測吸光度并計(jì)算其所對應(yīng)的椰子油的量作為m游[12-13]。

1.2.3.3 丙二醛(MDA)測定 分別通過測定4 ℃和24 ℃在0、3、5、7、14 d的MDA含量,來判斷所制備的CMCT-椰子油脂質(zhì)體磷脂的氧化情況。測定MDA含量的具體操作方法參考Xia S Q等[14]和鄭會娟[15]方法。

1.2.4 脂質(zhì)體體外釋放度研究 紫外檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線:精密稱取椰子油10 mg,用無水乙醇配成濃度為1 mg/mL的儲備液。用0.9% NaCl分別稀釋成濃度為30、5、80、160、320 μg/mL的溶液,以0.9%NaCl為空白對照,225 nm為檢測波長,測定吸收值A(chǔ),以吸收值A(chǔ)對質(zhì)量濃度ρ(μg/mL)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線[16-17],此標(biāo)曲用于釋放度的測定。

釋放度測定方法:精密移取0.5 mL CMCT-椰子油脂質(zhì)體,加入透析袋中,用透析夾夾緊,放入盛有100 mL 0.9% NaCl的燒杯中,置于37 ℃,100 r/min的水浴恒溫振蕩器中,分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h取5 mL外液,同時補(bǔ)充5 mL等量新鮮0.9% NaCl。以0.9% NaCl為空白對照,在225 nm處測定吸收值A(chǔ)。將吸收值A(chǔ)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算釋放的游離藥物總量,計(jì)算各時間點(diǎn)脂質(zhì)體的釋放度[16-17]。

以下式計(jì)算累積釋放度:

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

文中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn),測試結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p<0.05表示差異顯著。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見表2,方差分析結(jié)果見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 椰子油標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

如圖1所示,以質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo),以吸光度Abs為縱坐標(biāo)制作的椰子油標(biāo)準(zhǔn)曲線,其R2為0.9994,表明線性關(guān)系良好。(A=0.1681ρ+0.0066)。

圖1 椰子油標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Coconut oil standard curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 CMCT與磷脂質(zhì)量比對包封率的影響 由圖2可以看出,隨著CMCT含量的減少,包封率先增加后降低,當(dāng)CMCT與磷脂質(zhì)量比為1∶14時,包封率最高達(dá)74.56%±0.20%。這可能是最初CMCT含量高、粘度大并且呈絮狀物纏繞在脂質(zhì)體周圍,并未對脂質(zhì)體進(jìn)行有效的包埋,當(dāng)CMCT的量減少到一定程度后,使其在脂質(zhì)體周圍形成一層致密的保護(hù)層進(jìn)而提高了包封率。這與白春清[18]研究結(jié)果所述原因一致。在CMCT與磷脂質(zhì)量比為1∶14基礎(chǔ)上若再次減少CMCT含量則使其不能完全包封脂質(zhì)體導(dǎo)致包封率的降低。

圖2 CMCT與磷脂質(zhì)量比對包封率的影響Fig.2 Effect of CMCT to PC ratio on the encapsulation efficiency of coconut oil注:不同字母表示顯著性差異(p<0.05);相同字母表示顯著性差異(p>0.05),圖3～圖7同。

2.2.2 磷脂與CHO質(zhì)量比對包封率的影響 由圖3可知,隨著CHO含量的減少,包封率先增加后減少,當(dāng)磷脂與CHO質(zhì)量比為6∶1時包封率最高,達(dá)84.78%±0.10%。這是因?yàn)镃HO可以改變磷脂在脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中的排列次序及流動性[19],增加膜強(qiáng)度,提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,而當(dāng)磷脂與CHO質(zhì)量比為6∶1時,二者產(chǎn)生較好的協(xié)同作用,得到了較高的包封率,并起到穩(wěn)定脂質(zhì)雙分子層的作用。

圖3 磷脂與CHO質(zhì)量比對包封率的影響Fig.3 Effect of phospholipid to cholesterol ratio on encapsulation efficiency

2.2.3 磷脂與椰子油質(zhì)量比對包封率的影響 由圖4可以看出,隨著椰子油含量的增加,包封率先增加后降低,當(dāng)磷脂和椰子油質(zhì)量比為1∶3時包封率最高,達(dá)91.65%±0.40%。這表明在磷脂含量一定時,增加椰子油的量可使雙分子層內(nèi)部非極性尾端的含量上升,即提高包封率,但繼續(xù)增加含量,膜材料磷脂不足以包封造成包封率下降及椰子油的浪費(fèi)。

圖4 磷脂與椰子油質(zhì)量比對包封率的影響Fig.4 Effect of lipid to coconut oil ratio on encapsulation efficiency

圖5 介質(zhì)pH對包封率的影響Fig.5 Effect of dielectric pH on encapsulation efficiency

2.2.5 超聲強(qiáng)度對包封率的影響 由圖6可以看出,隨著超聲強(qiáng)度的增加,包封率先增加后減小,超聲強(qiáng)度為700 W時,包封率最高,達(dá)到90.21%±0.20%。這是因?yàn)槌晱?qiáng)度越高,提供的能量越大,強(qiáng)度較低時促進(jìn)粒子分散,并且保證羧甲基殼聚糖層對傳統(tǒng)椰子油脂質(zhì)體的均勻包封[18]。但當(dāng)超聲強(qiáng)度過高時,導(dǎo)致芯材泄露,造成脂質(zhì)體包封率下降,同時,造成分散開的粒子間發(fā)生融合聚集,導(dǎo)致粒徑變大,由此可以說明適當(dāng)?shù)某晱?qiáng)度可以提高包封率。

圖6 超聲強(qiáng)度對包封率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic strength on encapsulation efficiency

2.2.6 超聲時間對包封率的影響 由圖7可以看出,超聲時間為20 min時,包封率最高,達(dá)到98.27%±0.20%,繼續(xù)延長超聲時間包封率反而降低。這是因?yàn)槌晻r產(chǎn)生的振蕩作用可使脂質(zhì)體粒徑變小,從而使各粒徑之間的大小差距變得更小且更加均勻,其懸液更加穩(wěn)定,但超聲時間過短,粒徑過大,脂質(zhì)體不穩(wěn)定,最終導(dǎo)致脂質(zhì)體發(fā)生沉淀。超聲時間過長會通過改變局部水化介質(zhì)的溫度引起脂膜發(fā)生相變,破壞脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu),使得包封的椰子油泄露,引起包封率的下降[21]。因此,只有達(dá)到適當(dāng)?shù)某晻r間,分散作用發(fā)揮出最佳效果。

圖7 超聲時間對包封率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time on encapsulation efficiency

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2、表3可知,最佳組合為:A3B3C2D1E3F2即:為8∶1,磷脂與椰子油質(zhì)量比為1∶3,pH為4.5,超聲強(qiáng)度為750 W,超聲時間為20 min。對此組合條件下進(jìn)行多次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),包封率可以達(dá)到96.94%±0.20%。由表2分析可知各因素對CMCT-椰子油脂質(zhì)體制備的影響程度依次為:磷脂與椰子油質(zhì)量比>超聲時間>CMCT與磷脂質(zhì)量比>介質(zhì)pH>超聲強(qiáng)度>磷脂與膽固醇質(zhì)量比,由表3分析可知在p=0.05水平上,CMCT與磷脂質(zhì)量比、磷脂與椰子油質(zhì)量比、介質(zhì)pH和超聲時間的影響達(dá)到了顯著水平(p<0.05)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment design and results

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2.3.1 質(zhì)量評定

2.3.1.1 椰子油脂質(zhì)體的微觀形態(tài) 由圖8可以看出,經(jīng)無水乙醇稀釋的椰子油形狀不規(guī)則,而經(jīng)薄膜-超聲分散法制備的CMCT-椰子油脂質(zhì)體呈圓形或者橢圓形,雙分子膜呈指紋結(jié)構(gòu),形態(tài)完整,該結(jié)果說明將椰子油包封在脂質(zhì)體中使其均勻分散,能更好地發(fā)揮椰子油的作用。

圖8 顯微鏡圖片F(xiàn)ig.8 Microscope picture注:(左圖:無水乙醇稀釋的椰子油,40×;右圖:CMCT-包裹椰子油脂質(zhì)體,250×)。

2.3.1.2 丙二醛的測定 由圖9可以看出,隨著放置時間的延長丙二醛的含量呈現(xiàn)先上升后下降,且第3 d的MDA最高,這是因?yàn)榉胖玫某跗?燒瓶內(nèi)上部空間或混懸液中殘留的氧加速了過氧化物的生成,而分解速度較低,導(dǎo)致丙二醛含量增加;放置一段時間后,由于氧的消耗,使過氧化物的生成速度明顯降低,從而使測得的氧化值丙二醛值下降。結(jié)果表明,4 ℃的MDA值均低于24 ℃且都小于0.1 μg/mg,說明MDA值對溫度具有依賴性。Ulmius J等[22]提出MDA含量小于0.1 μg/mg時,不會發(fā)生溶血。

圖9 MDA隨時間的變化曲線Fig.9 MDA with time curve

2.3.1.3 CMCT-椰子油脂質(zhì)體體外釋放度 以質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo),以吸光度Abs為縱坐標(biāo)制作釋放度紫外檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線,R2為0.9952,線性關(guān)系良好。(A=0.0012ρ+0.2052)

圖10 釋放度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備Fig.10 Preparation of standard curve of release

CMCT-椰子油脂質(zhì)體釋放度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示,CMCT-椰子油脂質(zhì)體在0.9%NaCl中的釋放過程為:0.5～1 h較緩慢;1～24 h屬于均速釋放的過程。其中1 h的累積釋放度為6.86%±0.20%,24 h的累積釋放度為41.28%±0.30%。得出結(jié)論:薄膜-超聲分散法制備的CMCT-椰子油脂質(zhì)體具有很好的緩釋效果。

圖11 CMCT-椰子油脂質(zhì)體累積釋放度曲線Fig.11 CMCT-coconut oil liposome cumulative release curve

3 結(jié)論

薄膜-超聲分散法制備CMCT-椰子油脂質(zhì)體的最佳制備條件為CMCT與磷脂質(zhì)量比為1∶16,磷脂與CHO質(zhì)量比為8∶1,磷脂與椰子油量比為3∶1,pH4.5,超聲強(qiáng)度750 W,超聲時間20 min,此條件下實(shí)際包封率為96.94%±0.20%。MDA含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明薄膜-超聲分散法制備CMCT-椰子油脂質(zhì)體穩(wěn)定性好。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明24 h后CMCT-椰子油脂質(zhì)體累積釋放度可達(dá)到41.28%±0.30%。以上結(jié)果表明:該實(shí)驗(yàn)制備的CMCT-椰子油脂質(zhì)體具有包封率高、穩(wěn)定性好、延緩釋放效果好。本文對椰子油脂質(zhì)體的制備方法和理化性質(zhì)及其體外釋放性能進(jìn)行了初步研究,為脂質(zhì)體的制備提供了一定的理論依據(jù),并對脂質(zhì)體在食品行業(yè)和日化工業(yè)應(yīng)用提供了參考。

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