洋蔥皮不同溶劑提取物的體外抗氧化、 抑制α-糖苷酶活性研究

劉世馨,杜詠梅,侯小東,劉新民,付秋娟,張曉敬

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,山東青島 266101;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081)

洋蔥(AlliumcepaL.)是食用最廣泛的蔬菜之一,具有預(yù)防癌癥、抗氧化、降血脂、降血糖等多種保健功效[1]。除鮮食外,洋蔥還被加工成洋蔥粉、洋蔥醋、洋蔥黃酮膠囊等高附加值產(chǎn)品[2]。在洋蔥食用或產(chǎn)品加工過程中,洋蔥皮則作為廢棄物而浪費。

洋蔥皮含有豐富的黃酮、多酚類物質(zhì)[3],其含量是內(nèi)部鱗莖的2～6倍[3-5],槲皮素及其糖苷是洋蔥皮黃酮類化合物的主要成分[5],據(jù)Bhimanagouda S. Patil 報道,洋蔥皮槲皮素含量比洋蔥鱗莖高達5倍[6]。研究表明,洋蔥皮提取物具有較好的抗氧化[7]、減肥[8]、抗血栓[9]、抗炎癥作用[10]。Gawlik-Dziki等人將洋蔥皮槲皮素和多酚分別作為食品添加劑,提高了面包的抗氧化性[11],抑制胃癌細(xì)胞,預(yù)防消化道癌癥[12]。研究表明,植物多酚、黃酮類化合物具有較好的降血糖作用,通過抑制α-糖苷酶活性以延緩腸道糖類吸收是其降低餐后血糖的主要機制之一[13-14]。目前有關(guān)洋蔥皮提取物抑制α-糖苷酶活性的研究報道較少。

白明生等[15]研究了洋蔥皮總黃酮的超聲波提取工藝,陳佳等[16]研究了洋蔥皮總黃酮纖維素酶法提取及其抗氧化特征,蔣少華等[17]比較了乙醇回流提取法、超聲提取法和微波提取法對洋蔥皮總黃酮的提取效果。目前,有關(guān)不同提取溶劑對洋蔥皮總黃酮、槲皮素的提取效果及其提取物抗氧化、抑制α-糖苷酶活性研究還未見報道。本研究以洋蔥皮為材料,研究不同溶劑對洋蔥皮總多酚、總黃酮、槲皮素的提取效果及其提取物抗氧化、抑制α-糖苷酶活性,為洋蔥資源的梯次高效利用及高附加值功能食品開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洋蔥皮樣品 山東洋蔥食品加工廠;槲皮素對照品 純度95%,Adamas公司;維生素E(VE)對照品 純度97%，ALDRICH公司;1,1-二苯基-2-三硝基苦肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二銨鹽(ABTS) TCL公司;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ) 阿拉丁公司;吩嗪硫酸甲酯(PMS)、beta-煙酰胺腺嘌呤二核苷二鈉(NADH) SIGMA公司;氯化硝基四氮唑藍(NBT) BIOBEST公司;α-糖苷酶 來源于酵母,750U，SIGMA公司;阿卡波糖 純度95%，源葉生物公司;對-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(PNPG)、Folin-Ciocalteu 試劑 SIGMA公司;甲醇、醋酸 為色譜純;過硫酸鉀、NaNO2、AlCl3、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等 均為分析純。

BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;SBL-30DT超聲波恒溫清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Re100-pro 旋蒸儀 SCILOGEX公司;Multiskan Fc酶標(biāo)儀 Thermo賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)、UV檢測器 美國Waters公司;其他為實驗室常規(guī)設(shè)備。

1.2 實驗方法

1.2.1 洋蔥皮提取方法 將紫洋蔥皮烘干粉碎至60目備用,參照文獻[18]分別精密稱取20 g粉末8份,按1∶12 (g/mL)比例加入石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇、95%、80%、60%、40%乙醇和水,40 ℃超聲浸提20 min,抽濾,濾渣分別用200、180 mL上述溶劑重復(fù)提取2次,每次20 min,三次濾液合并,50 ℃減壓濃縮至干,稱取獲得提取物的質(zhì)量,獲得的提取物用DMSO溶解,配制成質(zhì)量濃度為2%的溶液,該溶液為提取物母液。

1.2.2 洋蔥皮提取物總多酚、總黃酮及槲皮素含量測定 根據(jù)相關(guān)化合物測定方法要求,將1.2.1獲得的洋蔥皮提取物母液分別用甲醇稀釋至適宜濃度,獲得總多酚、總黃酮及槲皮素待測液。

1.2.2.1 總多酚的測定 總多酚的測定采用Folin-Ciocalteu比色法,參照Singleton的方法[19],并做一些修改,以沒食子酸作標(biāo)樣,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。移取25 μL稀釋后的Folin-Ciocalteu試劑(用水稀釋10倍),分別加入25 μL 10～100 μg/mL的沒食子酸溶液,充分混勻后室溫反應(yīng)5 min,依次加入100 μL蒸餾水和25 μL 20% Na2CO3溶液,充分混勻,黑暗條件室溫反應(yīng)30 min,760 nm測定吸光度,每處理3次重復(fù),得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度Y(μg/mL)與吸光度A的線性回歸方程為y=6.0088x+0.0171,R2=0.9969。根據(jù)回歸方程計算洋蔥皮提取物中總多酚含量,結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示,單位為mg/g,洋蔥皮提取物總多酚純度和提取率計算方法:

式中:M1表示提取物質(zhì)量,單位為g,M表示稱取洋蔥皮粉末質(zhì)量,單位為g。

1.2.2.2 總黃酮的測定 總黃酮的測定采用氯化鋁比色法,參照J(rèn)ia,Zhishen的方法[20],以槲皮素作標(biāo)樣,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取100 μL 0.066 mol/L的NaNO2于96孔板中,分別加入50 μL 100～800 μg/mL的槲皮素溶液,充分混勻后室溫反應(yīng)5 min后,加入15 μL 10% AlCl3,充分混勻室溫反應(yīng)6 min,最后加入100 μL 1 mol/L的NaOH終止反應(yīng),在510 nm測定吸光度,每處理3次重復(fù),得到槲皮素質(zhì)量濃度y(μg/mL)與吸光度A的線性回歸方程為y=2.0324x+0.0585,R2=0.9991。根據(jù)回歸方程計算提取物中總黃酮含量,結(jié)果以槲皮素當(dāng)量表示,單位為mg/g,洋蔥皮提取物總黃酮純度及提取率計算方法與1.2.2.1同。

1.2.2.3 槲皮素的測定 洋蔥皮提取物槲皮素含量參照崔濤的方法[21],用液相色譜測定。稱取適量槲皮素對照品,配制成20、30、40、60、80 μg/mL的對照品工作溶液。提取物待測液過0.22 μm微孔濾膜,用液相色譜分離、檢測,外標(biāo)法定量,每處理3次重復(fù)。洋蔥皮提取物槲皮素純度及提取率計算方法與1.2.2.1同。

液相色譜條件為:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)柱溫為35 ℃;流速為0.3 mL/min;進樣體積為5 μL;流動相A為純甲醇,流動相B為含0.5%(V/V)醋酸水溶液;程序梯度為:0～2 min,35% A;2～4 min,35%～60% A;4～6 min,60%～80% A;6～8 min,80%～100% A;8～10 min,100%～80% A;10～12 min,80%～60% A;12～13 min,60%～35% A;檢測波長為370 nm。

1.2.3 洋蔥皮提取物體外抗氧化活性實驗 將1.2.1獲得的洋蔥皮不同溶劑提取物母液(濃度為2%)分別用甲醇稀釋,配制成濃度為20、40、80、100、200、400、800、1000 μg/mL的待測溶液。

1.2.3.1 總還原能力測定 總還原能力測定參考Ang,LZP的方法[22],準(zhǔn)確吸取150 μL FRAP試劑于96微孔板中,加入50 μL不同濃度(20～1000 μg/mL)的洋蔥皮提取物待測液,反應(yīng)10 min后在593 nm下測吸光值,以槲皮素甲醇溶液作陽性對照,50 μL甲醇代替樣品加入FRAP試劑中作空白對照,每個處理重復(fù)3次。還原力用樣品反應(yīng)后的吸光值A(chǔ)i表示。

1.2.3.2 DPPH·清除能力測定 DPPH·清除能力測定參考 Fabrizia Brisdelli的方法[23],吸取50 μL不同濃度(20～400 μg/mL)的洋蔥皮提取物待測液加入到150 μL 0.3 mmol/L DPPH·甲醇溶液中,混勻后于暗處30 ℃反應(yīng)30 min,用酶標(biāo)儀517 nm波長下測定吸光度值,以槲皮素/VE甲醇溶液作陽性對照,50 μL甲醇代替樣品加入到DPPH·甲醇溶液中作為空白對照,每個處理重復(fù)3次。DPPH·清除率按照以下公式進行計算:

式中:Ao為空白的吸光度值,Ai為樣品反應(yīng)溶液的吸光度值。

IC50指待測樣品抑制率達到50%時對應(yīng)的提取物濃度。其計算方法為:以待測樣品濃度為自變量(X),抑制率為因變量(Y),獲得待測樣品濃度與其清除DPPH·能力的關(guān)系線性方程,根據(jù)線性方程,計算待測樣品抑制率達到50%時對應(yīng)的提取物濃度IC50值。

1.2.3.3 ABTS+·清除能力測定 ABTS+·清除能力測定參考Ang,LZP的方法[22],將1.1 mg/mL的ABTS+·甲醇溶液和0.68 mg/mL的過硫酸鉀水溶液等體積混合,暗室靜置過夜,制備ABTS+·工作液;調(diào)整吸光度0.7左右,取150 μL以上試劑于96孔板中,加入50 μL不同濃度(20～400 μg/mL)的洋蔥皮提取物待測液,室溫暗處反應(yīng)30 min。用酶標(biāo)儀734 nm波長測定吸光度。以槲皮素/VE甲醇溶液作陽性對照,50 μL甲醇代替樣品加入ABTS+·工作液中作為空白對照,每個處理做3次重復(fù)。ABTS+·清除率和IC50值計算方法與1.2.3.2相同。

1.2.4 洋蔥皮提取物抑制α-糖苷酶活性實驗α-糖苷酶抑制活性測定參照Masao Hattori的方法[25],并做調(diào)整。實驗分為對照空白組、對照反應(yīng)組、樣品空白組和樣品反應(yīng)組,在96孔板中進行加樣。依次加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH為6.8)、不同濃度(100～1000 μg/mL)的洋蔥皮提取物待測液和2.0 mmol/L PNPG底物,混合均勻,于37 ℃水浴保溫10 min,取出,加入37 ℃水浴的0.9 U/mL酶溶液,充分混勻,于37 ℃水浴反應(yīng)20 min,加入150 μL 1.0 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應(yīng),405 nm測定吸光度,以槲皮素/阿卡波糖甲醇溶液作陽性對照,每處理3個重復(fù)。α-糖苷酶的IC50值計算方法與1.2.3.2相同。根據(jù)以下公式計算α-糖苷酶的抑制率:

式中:Ab為對照空白吸光度值,Ac為對照反應(yīng)吸光度值,As為樣品空白吸光度值,Asb為樣品反應(yīng)吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和DPS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析,結(jié)果用平均值±SD表示,采用最小顯著差異法(LSD)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥皮提取物總多酚、總黃酮、槲皮素的提取率及純度

由表1看出,石油醚提取物總多酚、總黃酮、槲皮素的提取率及純度均較低,乙酸乙酯提取物總多酚、總黃酮、槲皮素純度較高,但其提取率較低。水及乙醇溶液對洋蔥皮總多酚、總黃酮及槲皮素的提取率均顯著高于石油醚、乙酸乙酯,隨乙醇濃度升高,總多酚、總黃酮、槲皮素提取率及純度均呈先升高后降低趨勢,其中,60%乙醇提取物總多酚、總黃酮、槲皮素提取率最高,分別達5.5%、9.87%、3.25%,60%乙醇提取物總多酚、總黃酮的純度分別高達(33.12%±0.39%)、(59.44%±0.38%),均顯著高于水及其他濃度乙醇溶液提取物。綜合考慮不同溶劑對洋蔥皮總多酚、總黃酮、槲皮素提取率及純度,60%乙醇溶液效果最好。

表1 不同溶劑洋蔥皮提取物總多酚、總黃酮、槲皮素提取率和純度Table 1 The extraction rate and purity of the total polyphenols,total flavonoids and quercetin of different solvent onion peel extracts

2.2 洋蔥皮提取物體外抗氧化活性

2.2.1 總還原能力 由表2可見,在20～1000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),同一溶劑洋蔥皮提取物隨其質(zhì)量濃度的增加,其還原能力呈逐漸增加趨勢(吸光度越大,還原能力越強)。在提取物質(zhì)量濃度一致的情況下,隨乙醇濃度的增加,其總還原力呈先增加后降低的趨勢,其中40%～80%乙醇提取物總還原力顯著高于其他溶劑提取物。

表2 不同溶劑洋蔥皮提取物總還原力(A593)Table 2 Total reducing power absorbance of different solvent onion peel extracts(A593)

表3 不同溶劑洋蔥皮提取物DPPH·清除率及其IC50值Table 3 DPPH· scavenging rate and IC50 value of different solvent onion peel extracts

表4 不同溶劑洋蔥皮提取物ABTS+·清除率及其IC50值Table 4 ABTS+· scavenging rate and IC50 value of different solvent onion peel extracts

表5 不同溶劑洋蔥皮提取物清除率及其IC50值Table scavenging rate and IC50 value of different solvent onion peel extracts

2.3 洋蔥皮提取物抑制α-糖苷酶活性

由表6看出,在同樣質(zhì)量濃度條件下,洋蔥皮不同溶劑提取物對α-糖苷酶活性抑制率均顯著高于同濃度的阿卡波糖(p<0.05),說明洋蔥皮提取物對α-糖苷酶具有較好的抑制作用。在100～1000 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),同一溶劑洋蔥皮提取物隨著提取物質(zhì)量濃度增加,其對α-糖苷酶活性抑制率逐漸增大。在提取物質(zhì)量濃度一致的情況下,隨乙醇濃度增加,其提取物對α-糖苷酶活性抑制率呈先增高后降低趨勢,其中,40%、60%乙醇溶液提取物抑制α-糖苷酶活性IC50值顯著小于其他溶劑提取物(p<0.05),其IC50值分別為(329±3.12)、(364±2.72) μg/mL。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達到1000 μg/mL時,40%、60%乙醇溶液提取物對α-糖苷酶活性抑制率分別達84.4%、83.0%,與槲皮素對α-糖苷酶活性抑制率接近。

表6 不同溶劑洋蔥皮提取物α-糖苷酶活性抑制率及其IC50值Table 6 Inhibition rate of α-glucosidase activities and IC50 value of different solvent onion peel extracts

2.4 洋蔥皮提取物抗氧化、抑制α-糖苷酶活性與其總多酚、總黃酮、槲皮素含量的相關(guān)性分析

表7 洋蔥皮提取物的抗氧化、抑制α-糖苷酶活性與總多酚、總黃酮、槲皮素含量的相關(guān)性Table 7 The correlation between antioxidant,inhibition of α-glucosidase activities and contents of the total polyphenols,total flavonoids and quercetin of onion peel extracts

3 結(jié)論與討論

本研究分別以水、40%～100%乙醇溶液、乙酸乙酯、石油醚為溶劑提取洋蔥皮活性成分,綜合分析不同溶劑提取物總多酚、總黃酮及槲皮素的提取率和純度,以60%乙醇作為溶劑對洋蔥皮活性成分的提取效果最好。綜合考慮不同溶劑提取物對總多酚、總黃酮及槲皮素的提取率和純度以及其體外抗氧化、抑制α-糖苷酶活性,以60%乙醇作為溶劑最好。通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),不同溶劑提取物總黃酮、槲皮素含量與其抗氧化、抑制α-糖苷酶活性相關(guān)性均達極顯著水平,尤其槲皮素含量與提取物生物活性相關(guān)性最高。

根據(jù)研究結(jié)果,洋蔥皮60%乙醇溶液提取物中總多酚、總黃酮、槲皮素的含量(或純度)分別達33.1%、59.4%、19.7%,槲皮素屬于黃酮類化合物,因此,洋蔥皮乙醇提取物活性成分主要為多酚及黃酮類化合物,由于多酚及黃酮類化合物均具有酚羥基,二者含量的測定結(jié)果中可能存在交叉,從而使提取物中多酚、黃酮類物質(zhì)總量的測定結(jié)果(達92.5%)可能比實際值偏高。當(dāng)然,洋蔥皮還含有多糖等其他活性成分,下一步還需加強研究。

有大量研究表明總多酚和總黃酮是抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ),多酚和類黃酮含量較高的樣品顯示出更高的抗氧化活性[3],孫霽寒等[26]、劉曦等[18]、張偉等[27]研究表明豆腐柴、藍莓葉和黑莓籽提取物的抗氧化活性和總黃酮、總多酚含量有關(guān)。總黃酮和槲皮素的抗氧化作用更是受到人們的重視,枇杷葉、小麥胚芽中黃酮都有較好的清除自由基能力[28-29]。Myung-Hee Kim等[30]研究了洋蔥皮提取物的抗氧化和降糖活性。洋蔥皮富含黃酮類化合物,尤其槲皮素含量豐富,因此,洋蔥皮提取物可作為天然強抗氧化劑和α-糖苷酶抑制劑的來源。

王菲等[31]、陳海龍等[32]、韓強等[33]采用響應(yīng)面法分別對金花葵花總黃酮、黃蜀葵花槲皮素、楊梅渣槲皮素的提取工藝進行了優(yōu)化,Wiestaw Wiczkowski等[34]探討了洋蔥皮槲皮素及其衍生物的生物利用度,In Seong Choi等[35]利用酶水解法和納米模型高效回收了廢棄洋蔥皮中的黃酮槲皮素。為更好地利用洋蔥皮農(nóng)業(yè)廢棄物資源,在本研究基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法進一步將洋蔥皮總黃酮和槲皮素提取工藝優(yōu)化,并進行純化,將純化后的產(chǎn)物進行應(yīng)用性研究,為洋蔥保健食品和天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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