菊苣多糖體外抗氧化能力 及抗疲勞作用

付愛葉,王俏娜,吳雨龍,*,周 峰,汪振炯,王仁雷,華 春,*

(1.南京師范大學生命科學學院,江蘇南京210046;2.南京曉莊學院食品科學學院,江蘇南京 211171;3.江蘇省高?！疤厥馍镔|(zhì)廢棄物資源化利用”重點建設實驗室，江蘇南京 211171;4.江蘇第二師范學院生命科學與化學化工學院,江蘇南京 210013)

現(xiàn)代社會快節(jié)奏的生活方式及高強度的工作壓力使得人們長期處于疲勞狀態(tài)。疲勞被定義為有機體的生理過程不能使其機能繼續(xù)在一特定水平工作或各器官不能再保持穩(wěn)定的工作能力。當長期處于疲勞狀態(tài)時,機體內(nèi)氧化還原平衡被打破,過量產(chǎn)生自由基導致機體組織的損傷,從而引起各種機能下降,嚴重時還會誘發(fā)免疫、血液、風濕、心臟、腎臟、內(nèi)分泌等疾病[1-4]。迄今為止,臨床上常用的具有較好抗氧化作用且能夠有效緩減疲勞的藥物尚不能滿足人們的需求。因此,尋求具有較好的抗氧化作用能力、能夠提高運動、延緩疲勞以及加速人體疲勞消除的無毒副作用的天然的活性成分的研究越來越受到人們重視[5]。目前,植物多糖被認為是一種新的天然的抗氧化、抗疲勞活性物質(zhì)。李晶等[6]研究表明姬松茸多糖能延長小鼠常壓耐缺氧時間和負重游泳時間,提高小鼠血清中SOD活性,降低MDA含量,同時能顯著提高小鼠脾臟和胸腺指數(shù),從而達到抗疲勞和增強免疫的作用。王維[7]指出,黃蘑多糖可延長小鼠負重力竭游泳時間,降低機體運動后血乳酸的積累,增加肝糖原含量而提高機體運動能力,同時提高小鼠血液中SOD活性,因而具有較好的抗疲勞和抗氧自由基作用。Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)玉米須多糖可以顯著延長力竭小鼠游泳時間,降低血尿素氮、乳酸水平,提高乳酸脫氫酶活性,由此體現(xiàn)抗疲勞作用。Jing等[9]從瑪咖中提取的兩種瑪咖多糖組分(MPS-1和MPS-2)均具有較好的抗疲勞活性,其中MPS-2的抗疲勞活性優(yōu)于MPS-1。

菊苣(CichoriumintybusL.)是菊科菊苣屬多年生藥食兩用草本植物,在我國的北京、黑龍江、福建、山西等省市分布廣泛[10]。在國外,菊苣地上部分常被用作色拉和牧草以及作為生產(chǎn)果糖和香料的原料,而菊苣根被用來制作口香糖[11-12]。在我國,菊苣除了作為蔬菜、牧草和飼料添加劑外,還常作為藥材用于治療濕熱黃疸、胃痛食少、水腫尿少等癥,是維吾爾族和蒙古族常用藥材[13-14]。菊苣富含多糖、甙類、鞣質(zhì)、萜類等多種功能活性物質(zhì)[15-16],而菊苣多糖(CP)具有多種藥理作用,如降血糖[17]、降血脂[18]、抗腫瘤[19]、保肝[20]、延緩衰老[21]、降血壓、利尿[22]等,但有關菊苣多糖抗疲勞作用的研究尚未見報道。本研究采用體外抗氧化實驗和耐力實驗評價菊苣多糖抗氧化和抗疲勞作用,以期為菊苣資源的合理開發(fā)利用提供科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊苣根 湖北黃石；ICR雄性小鼠 動物合格證號:SCXK(蘇)2017-0004,體質(zhì)量18～22 g,揚州大學比較醫(yī)學中心;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-dipheny 1-2-picryl-hydrazyl,DPPH自由基)、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、甲硫氨酸、核黃素 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、三氯乙酸(TCA)、VC、三氯化鐵(FeCl3) 國藥集團化學試劑有限公司;血尿素氮(BUN)試劑盒、血清乳酸(BSLA)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、肝糖原(HG)和肌糖原(MG)試劑盒 南京建成生物工程研究所;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

T6型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;IEC1010-1型臺式冷凍干燥機 美國Labconco公司;SILFA型酶標儀 美國BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CP的制備 參照許芳等[23]報道方法并加以改進。菊苣經(jīng)烘干后粉碎,過60目篩后除脂,稱取一定量的菊苣粉末加入蒸餾水,經(jīng)超聲波酶法處理后,離心取上清,醇沉后離心取沉淀,沉淀溶于水后,經(jīng)纖維素柱和葡聚糖柱洗脫,收集洗脫曲線同一峰洗脫液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得CP。

1.2.2 CP對羥自由基的清除作用 分別取2 mL不同濃度的CP溶液(0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg/mL)于試管中,然后各管分別加入2 mL的硫酸亞鐵(9 mmol/L)和2 mL水楊酸(9 mmol/L),搖勻后各管加入2 mL的H2O2(20 mmol/L)混勻,37 ℃水浴30 min,以蒸餾水為空白對照,以VC為陽性對照,在510 nm波長下測定各反應溶液的吸光度并計算清除率[24]。實驗重復三次。

式中,A1為蒸餾水的吸光度值;A2為待測樣品的吸光度值。

1.2.3 CP對超氧陰離子自由基的清除作用 在試管中分別加入0.3 mL不同濃度的CP溶液,再分別依次加入0.5 mL磷酸緩沖液(pH7.8),1.5 mL甲硫氨酸(0.026 mol/L),0.3 mL NBT(0.078 mol/L),0.3 mL核黃素(0.02 mmol/L),混勻,將反應體系置于日光下照射30 min 后,以蒸餾水作空白,以VC為陽性對照,在波長560 nm處測定各反應溶液的吸光度,清除率按1.2.2公式計算[25]。實驗重復三次。

1.2.4 CP對DPPH自由基清除率的測定 參照Wang等[26]對DPPH自由基清除活性的方法稍作改進。在試管中分別加入2 mL不同濃度的CP溶液,再分別加入2 mL的DPPH自由基乙醇溶液(0.2 mmol/L),在渦旋振蕩器上搖勻,室溫下靜置避光反應30 min,以無水乙醇為陰性對照,以VC為陽性對照,測定517 nm處吸光度,按下式計算清除率。實驗重復三次。

式中,A1為待測樣品與DPPH自由基混合液的吸光度值;A2為待測樣品與無水乙醇混合液的吸光度值;A3為DPPH自由基與無水乙醇混合液的吸光度值。

1.2.5 CP還原力的測定 分別在試管中加入1 mL不同濃度的CP溶液中,依次加入2.5 mL的PBS(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL鐵氰化鉀(1%,W/V),混勻后在50 ℃水浴鍋中孵育20 min,立即加入2.5 mL的TCA(10%,W/V)終止反應,離心(3000 r/min,10 min)。取上清液2 mL于試管中,依次加入2 mL無水乙醇和0.25 mL(0.1%,W/V)的FeCl3溶液,混勻后測定700 nm處吸光度。以蒸餾水為陰性對照,以VC為陽性對照[27]。實驗重復三次。

1.2.6 CP抗疲勞作用研究

1.2.6.1 實驗設計 根據(jù)Li等[9]關于抗疲勞測定方法稍作改進。60只ICR雄性小鼠適應性飼養(yǎng)5 d后,隨機分為4組(15只/組):空白對照組(蒸餾水)、CP低劑量組(50 mg/kg)、CP中劑量組(100 mg/kg)和CP高劑量組(200 mg/kg)。每天上午9點按對應劑量對各組小鼠進行灌胃,連續(xù)灌胃30 d。

1.2.6.2 小鼠負重游泳實驗 第30 d時,對各組小鼠進行稱重,淘汰各組中與平均體重差距較大的小鼠,每組保留10只體重相近的小鼠。對各組小鼠進行灌胃,30 min后,進行負重游泳實驗。在各組小鼠尾巴上系上體質(zhì)量7%的鉛絲,置于游泳箱內(nèi)(水深35 cm,水溫(25±1) ℃)游泳,以小鼠頭部沒入水中7 s不能浮出水面為體力耗盡,記錄力竭時間。

1.2.6.3 生化指標的分析 各組小鼠力竭游泳實驗后,從游泳箱中撈出、擦干,放回鼠籠休息,60 min后,各組小鼠眼眶采血后頸椎脫臼法處死,取肝臟和大腿肌肉組織。用試劑盒測定BUN、BSLA、MDA、SOD、HG和MG。

2 結果與分析

2.1 CP對羥自由基的清除率

羥基自由基是活性氧自由基中毒性最大的自由基,如果人體內(nèi)有過多的羥基自由基會影響細胞膜而產(chǎn)生過氧化氫和活性氧,進而導致諸如易疲勞、動脈硬化、老化、突變等癥狀,對人體的健康造成嚴重危害[28]。由圖1可知,在0.1～2.4 mg/mL范圍內(nèi),CP表現(xiàn)出明顯的羥自由基清除活性,其羥自由基的清除能力隨添加濃度的升高而逐漸增強。當濃度為2.4 mg/mL時,CP對羥自由基清除率達40.93%,但CP的羥自由基清除能力顯著(p<0.05)低于同濃度的VC。

圖1 CP對羥自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of CP against hydroxyl free radicals

2.2 CP對超氧陰離子自由基的清除率

超氧陰離子自由基是人體代謝過程中產(chǎn)生的未配對電子的原子團,雖然其氧化性與其他氧自由基相比較弱,但它在代謝過程中會分解成氧化性很強的單線態(tài)氧自由基或羥自由基,從而造成細胞組織損傷或生物大分子結構的變化,使人體產(chǎn)生疲勞[24]。從圖2可知,在0.1～2.4 mg/mL范圍內(nèi),CP表現(xiàn)出明顯的超氧陰離子自由基清除活性,且隨著CP濃度的升高,對超氧陰離子自由基的清除力逐漸增強。當CP濃度在2.4 mg/mL時,超氧陰離子自由基清除率達67.11%,但CP的超氧陰離子自由基清除能力低于同濃度的VC。

圖2 CP對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of CP against superoxide anion

2.3 CP對DPPH自由基的清除作用

根據(jù)圖3可知,CP對DPPH的清除率隨CP濃度的增加而升高。當濃度為2.4 mg/mL時,CP對DPPH自由基的清除率達到58.17%,但低于同濃度的VC。

圖3 CP對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of CP against DPPH free radicals

2.4 CP的還原力

抗氧化活性的機制主要包括還原力機制,鏈引發(fā)的抑制機制,過渡金屬離子催化劑的折疊機制,過氧化物的分解和自由基清除機理。因此,一種化合物的還原能力可以作為具有潛在抗氧化活性的一個重要指標[12]。通過圖4可知,隨著CP濃度的升高,總的還原力也越來越強,在CP濃度為2.4 mg/mL時,CP還原力達到最大(吸光度為0.453)。何年武等[27]在測定黃瓜多糖還原力時發(fā)現(xiàn),當黃瓜多糖濃度為4 mg/mL時其在700 nm處的吸光度為0.350,而本研究中CP在濃度為2.4 mg/mL時其吸光度為0.453,還原力高于黃瓜多糖,由此說明CP具有較好的還原能力。

圖4 CP的還原力Fig.4 Reducing power of CP

2.5 CP的抗疲勞功效

2.5.1 CP對小鼠負重游泳時間的影響 游泳時間的長短可以體現(xiàn)運動耐力的強弱,可以反映抗疲勞的程度[29]。由圖5可知,與空白組小鼠相比,CP各劑量組小鼠均延長了負重游泳時間,且隨著給藥劑量的增加小鼠負重游泳的時間也顯著增加。表明CP具有較好的抗疲勞功效。

圖5 CP對小鼠力竭游泳時間的影響Fig.5 Influences of CP on exhaustive swimming time of mice.注:與空白組比較,*差異顯著(p<0.05)，**差異極顯著(p<0.01)；圖6～圖7同。

2.5.2 CP對小鼠血清生化指標的影響 作為機體中蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝產(chǎn)物,BSLA是一種無氧條件下糖酵解的產(chǎn)物,兩者均是評價疲勞的重要參數(shù)之一[9]。當機體能量缺乏時,蛋白被消耗,同時BUN水平升高,導致運動性疲勞增加[30]。

由圖6-A和圖6-B可知,與空白組相比,CP各劑量組小鼠血清BUN和BSLA水平均顯著降低(p<0.05,p<0.01)。在生物體內(nèi),自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應,氧化的最重要的終產(chǎn)物之一為MDA,其會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,且具有細胞毒性[3]。

圖6 CP對小鼠血清BUN、BSLA、MDA和SOD的影響Fig.6 Influences of CP on BUN,BSLA,MDA,and SOD in serum of mice

圖6-C表明,CP能夠降低機體中MDA的含量,且CP中劑量及高劑量組與空白組相比能顯著降低機體中MDA的含量(p<0.05),提示CP能夠降低自由基氧化過程,具有較好的抗疲勞作用。

SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶,能夠有效清除體內(nèi)超氧陰離子自由基,對提高運動能力,減輕疲勞和損傷具有重要意義[31]。如圖6-D所示,與空白組相比,CP能夠提高機體內(nèi)SOD的活性,尤其是中(p<0.05)、高劑量組(p<0.01)能夠顯著提高SOD的活性。結果表明,CP能夠提高機體SOD活性來清除自由基,能有效抵抗脂質(zhì)過氧化損傷,緩減疲勞。

2.5.3 CP對小鼠肌糖原和肝糖原的影響 研究表明,肌糖原、肝糖原等儲能物質(zhì)的耗竭是產(chǎn)生疲勞的重要原因之一[32]。機體在初始運動時首先消耗的是肌糖原,隨著肌糖原消耗殆盡,機體則動用肝糖原以維持血糖水平[33]。由圖7可知,與空白組相比,CP各劑量組均能夠明顯提高機體中肝糖原和肌糖原的含量。以上結果表明,CP可能通過增加機體肌糖原和肝糖原的儲備等途徑發(fā)揮抗疲勞作用。

圖7 CP對小鼠肝糖原和肌糖原的影響Fig.7 Effects of CP on HG and MG in mice

3 結論

體外抗氧化實驗結果表明,CP能夠較好的清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基,且具有較強的還原能力;抗疲勞實驗結果表明,CP能明顯延長小白鼠負重游泳時間,顯著降低負重游泳后血清中BUN、BSLA和MDA的含量,明顯提高了血清SOD活性以及肌糖原和肝糖原的儲備量,表明CP具有較好的抗氧化和抗疲勞作用。當然,有關CP對抗氧化和抗疲勞作用的機制有待進一步深入研究,為發(fā)揮菊苣的資源優(yōu)勢,利用CP開發(fā)保健食品和治療藥物等深加工產(chǎn)品提供理論基礎。

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