促進(jìn)桉樹焦枯病菌大量產(chǎn)孢的方法

郭朦朦，丁 奕，楊澤慧，張清華，馮麗貞，宋 漳

（福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002）

麗赤殼屬（Calonectria）為廣譜寄生真菌，可致多種植物病害，引起木本植物根腐、莖腐、葉斑以及焦枯等癥狀[1-3]。桉樹焦枯病菌（Cylindrocladium leaf blight）是熱帶及亞熱帶桉樹種植區(qū)內(nèi)危害最嚴(yán)重的病害之一，也是我國林業(yè)檢疫性病害[4-8]。其主要癥狀為受害葉片頂端開始呈現(xiàn)焦枯狀、在枯葉表面形成黑色小點，病健交接處有淡黃色暈圈，并使嫩枝梢枯，病害嚴(yán)重時可造成樹冠光禿、枝干腐爛，個體生長勢衰弱，林分蓄積量下降，嚴(yán)重阻礙桉樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，引起福建省桉樹焦枯病病害發(fā)生的主要病原主要有 Ca.kyotensis、Ca.pseudocolhounii、Ca.pseudoreteaudii[7]，其中Ca.pseudoreteaudii YA51為致病性強的優(yōu)勢種。

植物的病原學(xué)研究以及抗病性鑒定等工作的重要環(huán)節(jié)之一是誘導(dǎo)促使真菌產(chǎn)生分生孢子[9]。通常促進(jìn)分生孢子產(chǎn)生的方法主要有近紫外光照射、菌落劃傷、菌絲涂斷、更換培養(yǎng)基或在培養(yǎng)基中加入植物煎汁或組織、某種營養(yǎng)成分等[9-16]。課題組前期對桉樹焦枯病菌研究中發(fā)現(xiàn)，Ca.pseudoreteaudii YA51在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （potato dextrose agar medium，PDA）中產(chǎn)孢量少且菌絲旺盛，不利于后期進(jìn)行孢子原生質(zhì)體的制備以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化試驗。隨著桉樹的大規(guī)模種植，桉樹焦枯病的危害日益加重[17]。如何通過人工的方式快速、高效的獲得大量孢子成為該病害研究的瓶頸。有鑒于此，本試驗以查彼德培養(yǎng)基（Czapek-Dox Medium）為基礎(chǔ)，添加不同組分旨在尋找促進(jìn)Ca.pseudoreteaudii YA51高效產(chǎn)孢的培養(yǎng)基配方，為后續(xù)研究奠定堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用菌株分離自福建福州地區(qū)桉樹焦枯病病樣葉片，為實驗室期鑒定的為Ca.pseudoreteaudii YA51[7]。

1.2 培養(yǎng)基

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA ），加水定容至 1 L[18]。

表1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基Table 1 Potato glucose agar medium

（2）查彼特培養(yǎng)基（czapek-dox medium，Czapek），加水定容至1 L[18]。

表2 查彼特培養(yǎng)基Table 2 Chapel medium

（3）Czapek-Dox Medium+桉樹葉煎汁 （Czapek+ELA），Czapek-Dox Medium中以3 g桉樹葉煮沸的煎汁取代純水。

（4）Czapek-Dox Medium+桉樹葉煎汁+維生素 B1+維生素 B6（CzapekE+VB1+VB6）

（5）Czapek-Dox Medium+ 南美蟛 蜞 菊 （Wedelia trilobata（L.）Hitchc.）煎汁（Czapek+WTLA），其中以 3 g蟛蜞菊葉片煮沸的煎汁代替純水。

（6）Czapek-Dox Medium+桉樹葉煎汁+維生素 B1（CzapekE+VB1），設(shè)置維生素 B1的濃度梯度為 0.10、0.20、0.30、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、3.00、4.00、5.00 g·L-1。

各培養(yǎng)基110 kpa,121℃滅菌20 min，備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基對Ca.pseudoreteaudii YA51生長的影響

將菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，置于黑暗條件下，28℃恒溫培養(yǎng)10 d，待菌落長至培養(yǎng)皿邊緣時，用接種針挑取邊緣新鮮菌絲，分別接種與上述（1.2培養(yǎng)基）不同平板（直徑9 cm）中央，黑暗無光，28℃培養(yǎng)7 d[9]。測量菌落直徑，觀察并比較不同培養(yǎng)基之間菌落特征以及生長速度的異同。以PDA培養(yǎng)基作為對照。每種培養(yǎng)基重復(fù)3皿。

1.3.2 培養(yǎng)基對Ca.pseudoreteaudii YA51產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)率的影響

接菌方式與培養(yǎng)條件和1.3.1相同。培養(yǎng)7 d后，先用移液槍槍頭輕輕刮掉菌絲，再以2 mL無菌水清洗全皿，并用槍頭輕輕刮洗培養(yǎng)皿表面，并反復(fù)用菌液清洗，確保分生孢子沒有粘附在培養(yǎng)基上，吸取200μL置于血球計數(shù)儀板上計算和統(tǒng)計單位菌落面積的產(chǎn)孢量。以PDA培養(yǎng)基為對照。每種培養(yǎng)基重復(fù)3皿。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS和Excel對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對菌落形態(tài)、生長的影響

不同培養(yǎng)基對菌株直徑具有一定影響，其中CzapekE+VB1的平均直徑最小，為4.2 cm，CzapekE+VB1+VB6最大直徑為6.42 cm。PDA直徑居中（圖1）。說明復(fù)合維生素營養(yǎng)有宜菌落直徑的生長。由圖2可看出，不同培養(yǎng)基對菌落形態(tài)影響較大，PDA和CzapekE+VB1+VB6菌絲厚重，且菌落周邊偏白，中央?yún)^(qū)域呈現(xiàn)淡褐色，但產(chǎn)孢較少，說明營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有利于菌絲生長。Czapek和Czapek+WTLA菌落呈現(xiàn)深褐色，菌絲較稀疏，其中Czapek有菌株老化的趨勢，且產(chǎn)孢不明顯，表明營養(yǎng)匱乏，僅能維持菌落基本生長，無法為后期生長提供充足養(yǎng)分。Czapek+ELA和Czapek+VB1菌落整體顏色偏白。CzapekE+VB1可明顯看出產(chǎn)孢區(qū)，菌絲稀疏。因此，以上試驗結(jié)果說明在可維持基本生長的Czapek基礎(chǔ)上，CzapekE+VB1+VB6菌絲過勝，不利于后期分生孢子液的制作，CzapekE+VB1的組合菌絲稀少，且具有促進(jìn)產(chǎn)孢的作用。

圖1 不同培養(yǎng)基對Ca.pseudoreteaudii YA51直徑的影響Figure 1 Effects of different culture media on mycelial growth of Ca.pseudoreteaudii YA51

圖2 不同培養(yǎng)基對Ca.pseudoreteaudii YA51形態(tài)和直徑的影響Figure 2 Effects of different culture media on mycelial growth and shape of Ca.pseudoreteaudii YA51

2.2 不同培養(yǎng)基對產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)率的影響

Czapek+ELA 、CzapekE+VB1、CzapekE+VB1+VB6、Czapek+WTLA均對菌株產(chǎn)孢有促進(jìn)作用，產(chǎn)孢量依次為 1.33×106、1.17×106、7.00×105、1.43×106個/mL，分別為對照組的2倍、2倍、1倍、3倍。但不同培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)率影響不大，萌發(fā)率均在95%以上，表明不同組分不會造成菌落突變或死亡。

圖3 不同培養(yǎng)基對Ca.pseudoreteaudii YA51產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響Figure 3 Effects of different culture media on sporulation and conidia germination of Ca.pseudoreteaudii YA51

2.3 不同濃度維生素B1對菌落形態(tài)、生長速度的影響

對VB1促進(jìn)產(chǎn)孢最佳濃度篩選試驗表明。不同濃度VB1對菌落直接影響不大（圖4），但菌落形態(tài)有明顯差異（圖5）。添加桉樹葉煎汁和VB1的菌落菌絲稀疏，肉眼可以明顯觀察到產(chǎn)孢區(qū)。然而，隨著濃度的增加，菌落中間黃色區(qū)域明顯變多，可見產(chǎn)孢區(qū)減少，有衰老趨勢，因此，高濃度VB1對于Ca.pseudoreteaudii YA51具毒害作用。

圖4 不同維生素B1濃度對Ca.pseudoreteaudii YA51直徑的影響Figure 4 Effects of different vitamin B1’s concentration on mycelial growth of Ca.pseudoreteaudii YA51

圖5 不同維生素B1濃度對Ca.pseudoreteaudii YA51形態(tài)和直徑的影響Figure 5 Effects of different vitamin B1’s concentration on mycelial growth and shape of Ca.pseudoreteaudii YA51

2.4 不同濃度維生素B1對產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)率的影響

隨著VB1濃度的增加，產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率的趨勢為先增加后減少（圖6），在VB1濃度為0.4 g·L-1時達(dá)到巔峰，產(chǎn)孢量為3.23×106個/mL，是對照組的6倍，自0.4 g·L-1高峰后，產(chǎn)孢量極速下降，孢子萌發(fā)率也隨著濃度的增高而降低，因此，高濃度VB1對Ca.pseudoreteaudii YA51有抑制作用，最適產(chǎn)孢VB1濃度為 0.4 g·L-1。

圖6 不同維生素B1濃度對Ca.pseudoreteaudii YA51產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率的影響Figure 6 Effects of different vitamin B1’s concentration sporulation and conidia germination of Ca.pseudoreteaudii YA51

3 小結(jié)與討論

Ca.pseudoreteaudii YA51在PDA培養(yǎng)過程中，一般需要10 d才會大量產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量低，無法滿足1.00×106個/mL的需求[19-20]。本試驗中，在Czapek的基礎(chǔ)上添加桉樹葉煎汁和VB1可在培養(yǎng)7 d時達(dá)到1.00×106個/mL，既節(jié)約了時間，又滿足試驗需求量。

草莓炭疽病菌 （Colletotrichum theobromicola）、葡萄潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）等采用涂斷菌絲或者刮傷菌落的方法進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)孢[9,21-23]，但此類方法不適宜Ca.pseudoreteaudii YA51，本菌株在PDA培養(yǎng)基過程中易被青霉菌（Penicillium）污染，刮傷菌落后再培養(yǎng)，極大的增加了污染率。雖然在PDA基礎(chǔ)上添加葉片煎汁等也可達(dá)到提高產(chǎn)孢量的作用[24]。但Ca.pseudoreteaudii YA51因營養(yǎng)物質(zhì)的變化可引起可觀的形態(tài)改變，我們在培養(yǎng)Ca.pseudoreteaudii YA51中發(fā)現(xiàn)，不同批次的PDA中菌落形態(tài)也有差異，這是由于不同批次土豆的營養(yǎng)物質(zhì)含量不同。

為了避免非可控因素，本試驗采用主要營養(yǎng)物質(zhì)成分來源明確的Czapek培養(yǎng)基，通過自主改變其中某種元素進(jìn)而達(dá)到改變菌落形態(tài)的目的。添加桉樹葉煎汁的目的在于模擬和提供自然環(huán)境下菌株的生長環(huán)境。本試驗結(jié)果表明，Czapek+ELA產(chǎn)孢量為1.33×106個/mL，確有提高產(chǎn)孢量的作用，在其基礎(chǔ)上再添加VB1可進(jìn)一步提高產(chǎn)孢量，最高可達(dá)3.23×106個/mL。何書婷等2017年發(fā)現(xiàn)入侵植物對某些真菌具有抑制作用[25]，其中相關(guān)研究表明蟛蜞菊不僅可抑制植物生長，也對致病真菌菌的生長和活力具一定影響[26-28]。因福建本省南美蟛蜞菊居多，參照桉樹葉煎汁的方式嘗試南美蟛蜞菊煎汁，發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)Ca.pseudoreteaudii YA51產(chǎn)孢，此方法原材料豐富，成本廉價，操作簡單。

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