牛欄山大曲可培養(yǎng)微生物多樣性分析

朱婷婷

（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

中國白酒作為世界六大蒸餾酒之一，具有悠久的歷史和深厚的酒文化內(nèi)涵[1]，其釀造過程以大曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)糖化、發(fā)酵、蒸餾和貯存等步驟制得。白酒制曲技術(shù)是我國特有的民族遺產(chǎn)，代表了一個時(shí)代的進(jìn)步，當(dāng)制曲技術(shù)出現(xiàn)后，酒業(yè)就得到了規(guī)模化、規(guī)范化的發(fā)展，從此酒就離不開曲，曲決定酒[2]。俗語說“有美酒必有佳曲[3]”“曲為酒之骨[4]”，可見酒曲在白酒釀造中的重要性。

大曲是一種富含微生物菌系、酶系和曲香物質(zhì)的微生態(tài)制品，具有糖化、發(fā)酵、生香等功能[5]。牛欄山二鍋頭屬于清香型白酒，采用低溫大曲進(jìn)行釀造生產(chǎn)，其大曲主要以豌豆、大麥、小麥為原料，粉碎混合后加水踩曲制成曲塊，經(jīng)過臥曲、上霉、晾霉、潮火、干火、后火、養(yǎng)曲、貯曲等環(huán)節(jié)[6]。其生產(chǎn)過程是依靠從自然界中帶入的各種微生物在淀粉質(zhì)原料中進(jìn)行富集生長并繁殖擴(kuò)大，不同的微生物形成了大曲的菌系結(jié)構(gòu)，因此認(rèn)識大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)與差異，對于研究牛欄山二鍋頭白酒發(fā)酵具有十分重要的意義。

本研究利用傳統(tǒng)分離方法，對大曲中酵母菌、絲狀真菌、乳酸菌、芽孢桿菌、放線菌這5類微生物進(jìn)行系統(tǒng)分離，確定了大曲微生物比例關(guān)系，同時(shí)結(jié)合PCR測序及鑒定，獲得大曲中微生物多樣性分布。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

牛欄山酒廠清香型大曲。

1.2 主要儀器與試劑

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；梯度C1000快速梯度基因擴(kuò)增儀，美國BIORAD公司；基礎(chǔ)型水平電泳儀，美國BIORAD公司；全自動凝膠成像儀，美國BIORAD公司；1-14k高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；YXQ-LS-75Ⅱ型數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅；SPX-320型生化培養(yǎng)箱，寧波江南；PLR-100 64℃實(shí)驗(yàn)室冰箱，賽墨飛世爾。

1.3 分離培養(yǎng)基

酵母分離培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基：yeast extract 10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。

乳酸菌分離培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，酪蛋白胨30 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二胺，吐溫80 1 mL，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·H2O 0.25 g，瓊脂 12 g，水1 L。

芽孢桿菌分離培養(yǎng)基：肉汁培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水1 L。

放線菌分離培養(yǎng)基：ISP2培養(yǎng)基：Yeast extract 4 g，Malt extract 5 g，Dextrose 4 g，Agar 18 g，水1 L，pH 7.3。

孫學(xué)峰[36]提出目前有關(guān)“帖學(xué)”和“碑學(xué)”的界定很多，論說也不盡相同，總的說來，二者的區(qū)別在于是否取法魏晉名家書跡，尤其是二王書跡，是否追求傳統(tǒng)的“中和”審美情趣。

常規(guī)絲狀真菌分離培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基，奧博興外購。

耐高溫絲狀真菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸提液500 mL，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水500 mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 微生物分離、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及保藏

分離：稱取牛欄山大曲10 g于90 mL無菌水混勻，擬定為10-1濃度，吸取1 mL于9 mL無菌水中，為 10-2，依次稀釋為 10-3、10-4、10-5、10-6梯度。吸取不同梯度液0.1 mL，分別涂布相應(yīng)平板中，涂布梯度見表1。

表1 微生物分離方法

培養(yǎng)：根據(jù)分離微生物的不同設(shè)定不同培養(yǎng)條件，酵母28℃，常規(guī)絲狀真菌30℃，耐高溫絲狀真菌50℃，芽孢桿菌、常規(guī)細(xì)菌、乳酸菌及放線菌均為35℃。培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)菌落的生長情況而定,一般為24～48 h。

計(jì)數(shù)及挑菌：根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果挑選菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算不同微生物的種群數(shù)量。為獲得大曲內(nèi)可培養(yǎng)微生物準(zhǔn)確數(shù)量關(guān)系，挑菌方法：挑選菌落數(shù)在10～100之間的梯度平板，挑取平板內(nèi)所有微生物，其余梯度隨機(jī)挑選多樣性菌落。挑取的菌落接種到相應(yīng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d后進(jìn)行分子鑒定。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

表2 PCR引物及反應(yīng)條件

酵母和細(xì)菌DNA提取方法：挑取少量活化的菌體，于已滅過菌的1.5 mL離心管內(nèi)；加入100 μL裂解液（100 mM Tris，30 mM EDTA，0.5%SDS，pH 8.0，15磅滅菌30 min備用）；100℃水浴15 min；加入100 μL 2.5 M的醋酸鉀溶液，冰浴60 min；4℃下13000 r/min離心5 min，取上清液200 μL至0.5 mL離心管中；加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），劇烈振蕩 10 min，13000 r/min離心15 min，移取100 μL上清液至0.5 mL離心管中；加入100 μL預(yù)冷的異丙醇，混勻后-20℃下放置20 min；13000 r/min離心15 min，棄去上清液；用70%的酒精洗滌沉淀2次；沉淀過夜自然干燥；加入50 μL已滅菌的超純水，室溫下溶解1 h，-20℃冰箱儲藏備用。

絲狀真菌DNA提取方法：FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取。PCR產(chǎn)物及反應(yīng)條件見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲微生物數(shù)量關(guān)系

采用傳統(tǒng)微生物分離方法，獲得酵母菌、絲狀真菌、乳酸菌、芽孢桿菌和放線菌的菌群數(shù)量，由于酵母菌形態(tài)差異較大，根據(jù)形態(tài)特征及數(shù)量分布，將大曲酵母菌分為扣囊覆膜酵母和其余酵母（釀酒酵母和生香酵母）兩類進(jìn)行分析[7-8]，見表3和圖1。

表3 牛欄山大曲微生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)

圖1 牛欄山二鍋頭大曲菌系分布情況

由表3和圖1可看出，在大曲微生物組成中，扣囊覆膜酵母可占大曲微生物總數(shù)的59%，是大曲中最多的微生物，乳酸菌和芽孢桿菌屬于細(xì)菌類微生物，分別占大曲微生物總數(shù)的22%和12%，絲狀真菌可占大曲微生物總數(shù)7%，其余酵母和放線菌雖然能夠分離出來，但數(shù)量相對較少。

2.2 大曲微生物多樣性

2.2.1 酵母菌多樣性（表4）

表4 大曲酵母菌種類

大曲中酵母菌主要以扣囊覆膜酵母為主，而除扣囊覆膜酵母外，大曲中還存在一些其余酵母（生香酵母及釀酒酵母），這些酵母在大曲中含量較低，只能在10-3或10-4梯度才能夠分離到。

如表4所示，本研究從大曲中共分離出101株酵母菌（由于扣囊覆膜酵母可用肉眼鑒定，故未進(jìn)行挑菌及分子鑒定），分別為東方伊薩酵母、異常漢遜酵母、弗比恩畢赤酵母和釀酒酵母。其中東方伊薩酵母數(shù)量較多，為55株，其次為異常漢遜酵母，弗比恩畢赤酵母和釀酒酵母數(shù)量較少。

2.2.2 絲狀真菌多樣性（表5）

本研究從大曲中共分離絲狀真菌41株，其中常溫絲狀真菌36株，耐高溫絲狀真菌5株。

如表5所示，常溫絲狀真菌主要由4種組成，分別為分支橫梗霉、微小根毛霉、產(chǎn)黃青霉、傘枝橫梗霉，其中分支橫梗霉數(shù)量較多，是大曲中主要常溫絲狀真菌，其次是微小根毛霉及傘枝橫梗霉，產(chǎn)黃青霉數(shù)量較少，而耐高溫絲狀真菌中只分離到嗜熱子囊菌一種耐高溫絲狀真菌。

表5 大曲絲狀真菌種類

2.2.3 芽孢桿菌多樣性（表6）

表6 大曲芽孢桿菌種類

如表6所示，牛欄山大曲中共分離到119株芽孢桿菌，分為7個種，其中地衣芽孢桿菌和沙福芽孢桿菌為主要芽孢桿菌，分離數(shù)量分別為85株和20株，而其余芽孢桿菌數(shù)量相對較少。

2.2.4 乳酸菌（表7）

表7 大曲乳酸菌種類

牛欄山大曲中乳酸菌優(yōu)勢較為明顯，見表7。如表7所示，從牛欄山大曲中共分離到102株乳酸菌，由8種組成，其中戊糖片球菌數(shù)量較多，占85株，是牛欄山大曲中的主要乳酸菌，其余乳酸菌，如希氏乳酸菌、植物乳桿菌等所占數(shù)量較少。

2.2.5 放線菌（表8）

表8 大曲放線菌種類

放線菌是細(xì)菌家族中的一個獨(dú)特的分支，因菌體呈放射線狀生長而得名，如表8所示，大曲中共分離49株放線菌，種類較少，只分離到白色鏈霉菌和可可鏈霉菌兩類鏈霉菌，數(shù)量較為接近，

3 結(jié)論

本研究利用傳統(tǒng)分離方法結(jié)合PCR測序技術(shù)，從酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、絲狀真菌、放線菌5個方面入手，系統(tǒng)分析了牛欄山大曲微生物的群落組成及多樣性。

結(jié)果表明，扣囊覆膜酵母是牛欄山大曲的主要微生物，可占大曲整體微生物數(shù)量的59%，芽孢桿菌和乳酸菌同屬于細(xì)菌類，可占整體微生物的34%，絲狀真菌數(shù)量較少可占7%，放線菌、生香酵母、釀酒酵母雖然能夠分離到，但數(shù)量相對較少。

在微生物多樣性方面，共從牛欄山大曲中獲得27種微生物，在真菌方面，酵母菌除主體扣囊覆膜酵母外，還分離到了4種酵母菌，主要以東方伊薩酵母和異常漢遜酵母為主，釀酒酵母數(shù)量較少；絲狀真菌共分離到5種，主要為分支橫梗霉、微小根毛霉，同時(shí)分離到少量嗜熱真菌——嗜熱子囊菌；細(xì)菌方面乳酸菌、芽孢桿菌和放線菌共分離出17種微生物，雖然種類較多，但主體較為明顯，其中地衣芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌，戊糖片球菌，白色鏈霉菌和可可鏈霉菌分別為芽孢桿菌、乳酸菌和放線菌的主體微生物，占據(jù)明顯的數(shù)量優(yōu)勢。

大曲作為白酒釀造的主要菌群來源，在白酒釀造過程中具有重要作用，系統(tǒng)研究大曲微生物的數(shù)量關(guān)系和微生物多樣性，有助于解析白酒釀造微生物的變化規(guī)律，同時(shí)也為今后菌劑的選取和添加提供指導(dǎo)作用。

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