miR-152靶向Mirk/Dyrk1B調(diào)控人卵巢癌干細胞紫杉醇敏感性的研究

倪莎，郭綺璇，汪玲，歐陽玲，周欣

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，晚期卵巢癌的5年生存率長期徘徊于20%～30%。化療耐藥是造成卵巢癌預后不佳的主要原因之一，深入研究卵巢癌的化療耐藥機制對提高卵巢癌的化療療效、改善患者預后具有重大意義。

腫瘤干細胞被認為是腫瘤耐藥的根源，深入研究腫瘤干細胞化療耐藥的分子機制有助于深入認識腫瘤耐藥的機理并尋找相應的治療靶點。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-152在卵巢癌干細胞球中低表達，過表達miR-152可以影響卵巢癌細胞的增殖活性，提示其可能與卵巢癌干細胞化療耐藥有關。為進一步探討miR-152在卵巢癌干細胞化療耐藥中的作用，本研究檢測了miR-152差異表達對人卵巢癌干細胞球紫杉醇敏感性的影響，并初步驗證了其靶基因，為深入理解卵巢癌耐藥機制、尋找新的治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵巢癌干細胞培養(yǎng)

將人卵巢癌細胞株OVCAR3接種于DMEM-High Glu完全培養(yǎng)基 （美國GIBCO公司） 中，置于5%CO2、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)消化貼壁細胞，將細胞沉淀重懸于無血清培養(yǎng)基，置于超低吸附培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)體系：DMEM-F12為基礎培養(yǎng)基，包括40 ng/mL重組表皮細胞生長因子、20 ng/mL重組成纖維細胞生長因子、10 ng/mL重組白血病抑制因子、4 μ g/mL肝素、5%牛血清蛋白、1%青鏈霉素、50%無血清腫瘤細胞培養(yǎng)基。觀察細胞球形態(tài)、大小及折光性等，評估干細胞球生長狀態(tài)。

1.2 建立miR-152差異表達體系

實驗分組：實驗組 （轉(zhuǎn)染miR-152 mimics） 、反義鏈組 （轉(zhuǎn)染miR-152 inhibitor） 、陰性對照組 （轉(zhuǎn)染miR-152對應的陰性對照序列） 、空白對照組 （不轉(zhuǎn)染任何序列） 。miR-152 mimics、miR-152 inhibitor、陰性對照均由蘇州吉瑪生物有限公司合成。按Lipo2000 （美國Invitrogen公司） 說明書進行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染48 h后移去培養(yǎng)基，加入Trizol RNA Isolation Reagent （美國Invitrogen公司） ，按照說明書步驟提取RNA。使用PrimeScript RT reagent Kit with GDNA Erase （日本TaKaRa公司） 進行cDNA合成。實時PCR以管家基因U6作為內(nèi)參照，miR-152、U6上下游引物均由上海生工生物有限公司合成。使用SYBR PremixEx Taq （Tli RNaseH Plus） （日本TaKaRa公司） 進行擴增，反應條件：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.3 CCK-8實驗

常規(guī)消化、計數(shù)卵巢癌干細胞球，以DMEM-F12培養(yǎng)基重懸于低吸附96孔板，每孔接種細胞5×103個；轉(zhuǎn)染后24 h加入紫杉醇，濃度分別為5、10、20、40、80、160、320、640 nmol/L （每個濃度設3個復孔） ，加藥后48 h移去培養(yǎng)基，每孔加入90 μ L DMEM-F12培養(yǎng)基與10 μ L CCK-8溶液，混勻后置入細胞培養(yǎng)箱；4 h后通過酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

根據(jù) Mirk/Dyrk1B 3’-UTR和miR-152的序列預測二者的結(jié)合位點，構(gòu)建Mirk/Dyrk1B 3’-UTR pmir-GLO野生型及突變型載體，由江蘇吉瑪公司合成。采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng) （美國Promega公司） 檢測熒光素酶活性。

1.5 蛋白免疫印跡實驗

常規(guī)消化、離心后取細胞沉淀，提取蛋白并測濃度；用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳進行免疫印跡實驗，一抗Mirk/Dyrk1B 1∶1 000稀釋，GAPDH 1∶5 000稀釋 （美國Abcam公司） ，用Quantiy One軟件進行灰度值分析，以目的條帶與GAPDH條帶的灰度比值作為相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析

實時PCR采用2-ΔΔCt相對定量法，以U6的表達量作為內(nèi)參照，分別計算實驗組與對照組的ΔCt，根據(jù)公式ΔΔCt= （實驗組目的基因Ct-內(nèi)參照Ct） - （對照組目的基因Ct-內(nèi)參照Ct） ，相對表達量=2-ΔΔCt。計量資料用x-±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OVCAR3細胞在無血清懸浮培養(yǎng)條件下形成干細胞球并連續(xù)傳代

通過無血清懸浮培養(yǎng)法由人卵巢癌細胞系OVCAR3中獲得干細胞球，可在無血清培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代5代以上，且隨著培養(yǎng)時間延長，細胞球逐漸富集 （圖1） 。

2.2 OVCAR3卵巢癌干細胞球低表達miR-152，上調(diào)miR-152的表達可增強卵巢癌干細胞球?qū)ψ仙即嫉拿舾行?/h3>

圖1 卵巢癌干細胞球在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長并逐漸富集Fig.1 Ovarian cancer stem cell spheres growed in serum-free medium and enriched over time

卵巢癌干細胞球組和OVCARE貼壁細胞組ΔCt值分別為18.98±0.137和14.58±0.98，卵巢癌干細胞球中miR-152的表達量相對于貼壁細胞中miR-152的表達量為0.13，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） ，提示miR-152在卵巢癌干細胞球中的表達水平明顯低于貼壁細胞 （圖2A） 。轉(zhuǎn)染miR-152 mimics的實驗組細胞miR-152的表達量明顯高于陰性及空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.01） ，證明轉(zhuǎn)染成功 （圖2B） 。不同濃度紫杉醇處理后，實驗組卵巢癌干細胞球的存活率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.05） （圖3） 。

圖2 miR-152 在卵巢癌干細胞球中的表達情況Fig.2 The expression level of miR-152 in ovarian cancer stem cell spheres

圖3 上調(diào)miR-152表達可增強卵巢癌干細胞球?qū)ψ仙即嫉拿舾行訤ig.3 Upregulation of miR-152 enhanced the sensitivity of ovarian cancer stem cells to paclitaxel

2.3 過表達miR-152可下調(diào)Mirk/Dyrk1B的表達

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，實驗組熒光素酶活性顯著低于各對照組 （P ＜ 0.01） ，提示miR-152可與Mirk/Dyrk1B野生型質(zhì)粒結(jié)合進而降低熒光素酶活性，證實miR-152能夠特異性結(jié)合Mirk/Dyrk1B 3’-UTR區(qū)域 （圖4） 。

圖4 miR-152可與Mirk/Dyrk1B野生型質(zhì)粒結(jié)合并降低熒光素酶活性Fig.4 miR-152 could bind to the Mirk/Dyrk1b 3’-UTR and reduced the relative luciferase

Western blotting結(jié)果 （圖5） 顯示，實驗組與siRNA-Mirk/Dyrk1B組中Mirk/Dyrk1B表達量均較對照組明顯降低 （P ＜ 0.01） 。

2.4 miR-152與Mirk/Dyrk1B差異表達影響卵巢癌干細胞球?qū)ψ仙即嫉拿舾行?/h3>

圖5 miR-152 mimics與siRNA-Mirk/Dyrk1B均可降低卵巢癌干細胞球中Mirk/Dyrk1B的表達水平Fig.5 Upregulation of miR-152 or downregulation of Mirk/Dyrk1B could reduce the Mirk/Dyrk1B protein level

以紫杉醇處理的卵巢癌干細胞球中，miR-152組與siRNA-Mirk/Dyrk1B組細胞存活率明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） ，miR-152組與siRNA-Mirk/Dyrk1B組相比，差異無統(tǒng)計學意義（圖6） 。

2.5 miR-152與Mirk/Dyrk1B差異表達影響卵巢癌干細胞球中耐藥相關蛋白表達水平

Western blotting 結(jié)果 （圖7） 顯示， miR-152組與siRNA-Mirk/Dyrk1B 組 中 ABCG2、 β-tublinⅢ、 BRCA1的表達水平均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05） ，但miR-152組與siRNA-Mirk/Dyrk1B組間無統(tǒng)計學差異 （P ＞ 0.05） 。ERCC1蛋白水平在所有組中均無統(tǒng)計學差異 （P ＞ 0.05） 。

圖6 上調(diào)miR-152或下調(diào)Mirk/Dyrk1B均可提高卵巢癌干細胞球?qū)ψ仙即嫉拿舾行訤ig.6 Upregulation of miR-152 or downregulation of Mirk/Dyrk1B could enhance the sensitivity of ovarian cancer stem cells to paclitaxel

圖7 上調(diào)miR-152或下調(diào)Mirk/Dyrk1B對卵巢癌干細胞球中各耐藥相關蛋白表達的影響Fig.7 Upregulation of miR-152 or downregulation of Mirk/Dyrk1B could alter the drug resistance related protein levels

3 討論

1994年，LAPIDOT等［1］在急性白血病細胞中鑒定出一群髓性起源細胞，這些細胞表現(xiàn)出類似于干細胞的特征，具有分化、增殖及自我更新的潛力。之后，REYA等［2］正式提出了“腫瘤干細胞”這一概念。腫瘤干細胞能夠高表達多種耐藥蛋白以及抗凋亡蛋白，以逃脫傳統(tǒng)化療藥物的殺傷作用并導致凋亡逃逸，被認為是腫瘤化療耐藥的根源。

研究［3-6］表明，miRNAs的異常表達與惡性腫瘤的化療耐藥密切相關。miR-152位于染色體17q21.32，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。miR-152在卵巢癌組織與細胞系SKOV3、OVCAR3中低表達，過表達miR-152對卵巢癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為具有明顯的抑制作用［7-9］。上調(diào)miR-152能抑制卵巢癌干細胞球的增殖與克隆形成［8，10］。有研究［9，11］通過miRNA基因芯片方法在化療耐藥的卵巢癌患者組織中篩選出62個異常表達的miRNA并通過RT-PCR進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-152在化療耐藥組與化療敏感組患者中的表達具有顯著差異。還有研究［10，12］通過類似方法在卵巢癌患者血清中篩選出包括miR-152在內(nèi)的多個異常表達的miRNA，并通過生物信息學方法預測這些miRNA可 能 通 過 靶 向WNT、AKT/mTOR、TLR-4/MyD88等信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮作用。本研究由人卵巢癌細胞系OVCAR3中分離培養(yǎng)卵巢癌干細胞球，發(fā)現(xiàn)miR-152在卵巢癌干細胞球中的表達水平明顯低于貼壁細胞，上調(diào)miR-152能夠明顯增加卵巢癌干細胞球?qū)ψ仙即嫉拿舾行裕崾緈iR-152與卵巢癌干細胞球的化療敏感性相關，并可能通過這一機制影響卵巢癌患者的化療耐藥進程。

miRNA本身不編碼蛋白，它通過與靶基因的mRNA互補結(jié)合調(diào)控mRNA的翻譯環(huán)節(jié)，結(jié)合方式包括：與靶基因mRNA 3’-UTR序列結(jié)合，形成復合體，阻斷靶基因的翻譯；與靶基因mRNA互補結(jié)合，對靶基因mRNA產(chǎn)生切割效應，降低mRNA的穩(wěn)定性［11-14］。為了進一步探討miR-152在卵巢癌干細胞球中的作用機制，本研究通過生物信息學網(wǎng)站 （http：//microran.sanger.ac.uk，http：//www.targetscan.org/，http：//pictar.bio.nyu.edu） 預測Mirk/Dyrk1B可能是miR-152的靶基因，并進行了驗證。結(jié)果證實，miR-152能夠與Mirk/Dyrk1B 的3’-UTR 區(qū)域特異性結(jié)合，上調(diào)miR-152表達能夠降低Mirk/Dyrk1B的表達水平，提示Mirk/Dyrk1B是miR-152的下游靶基因，上調(diào)miR-152能夠抑制Mirk/Dyrk1B表達。同時，上調(diào)miR-152或直接下調(diào)Mirk/Dyrk1B表達均能增加卵巢癌干細胞球?qū)ψ仙即嫉拿舾行?，在這一過程中，卵巢癌干細胞球中的耐藥相關蛋白ABCG2、β-tublinⅢ、BRCA1表達水平下調(diào)，提示miR-152通過靶向Mirk/Dyrk1B影響卵巢干細胞化療耐藥。

Mirk/Dyrk1B基因定位于19q12-q13.11，在人類的睪丸組織中首次被發(fā)現(xiàn)［13-15］。Mirk/Dyrk1B只在人類的肌肉和腦組織中表達，其他正常組織中不表達，但在胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中高表達［15-18］。過表達Mirk/Dyrk1B可以下調(diào)細胞內(nèi)的活性氧簇 （reactive oxygen species，ROS） 水平，促進細胞存活。下調(diào)Mirk/Dyrk1B表達會使細胞內(nèi)的ROS水平升高，細胞在高ROS的作用下活性降低，增殖及克隆能力下降，進而死亡［18-21］。此外，Mirk/Dyrk1B能夠誘導腫瘤細胞進入靜止期，使其免受以分裂細胞群為靶點的化療藥物的殺傷作用［21-22］?；蛲ㄟ^激活mTOR/AKT信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮細胞毒性作用［23］。Mirk/Dyrk1B可能通過類似的機制影響卵巢癌干細胞的化療耐藥進程。

綜上，本研究證明miR-152可以靶向Mirk/Dyrk1B調(diào)控人卵巢癌干細胞球?qū)ψ仙即嫉拿舾行?。miR-152與Mirk/Dyrk1B可作為卵巢癌治療的潛在靶點，針對兩者設計有效的靶向治療藥物有望提高卵巢癌患者對紫杉醇的敏感性，進而提高卵巢癌患者的5年生存率，改善預后。

［1］ LAPIDOT T，SIRARD C，VORMOOR J，et al. A cell initiating human a-cute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice［ J］.Nature，1994，367（ 6464）：645-648. DOI：10.1038/367645a0.

［2］ REYA T，MORRISON SJ，CLARKE MF，et al. Stem cells，cancer，and cancer stem cells［ J］. Nature，2001，414（ 6859）：105-111. DOI：10.1038/35102167.

［3］ ZHANG YJ，LIU XC，DU J，et al. miR-152 regulates metastases of non-small cell lung cancer cells by targeting neuropilin-1［J］. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（ 11）：14235-14240.

［4］ ZHAI R，KAN X，WANG B，et al. miR-152 suppresses gastric cancer cell proliferation and motility by targeting CD151［J］. Tumour Biol，2014，35（ 11）：11367-11373. DOI：10.1007/s13277-014-2471-2.

［5］ THEODORE SC，DAVIS M，ZHAO F，et al. MicroRNA profiling of novel African American and Caucasian prostate cancer cell lines reveals a reciprocal regulatory relationship of miR-152 and DNA methyltranferase1［J］. Oncotarget，2014，5 （11）：3512-3525. DOI：10.18632/oncotarget.1953.

［6］ HUANG H，HU M，LI P，et al. miR-152 inhibits cell proliferation and colony formation of CD133 （+） liver cancer stem cells by targeting KIT ［J］. Tumour Biol，2015，36 （2）：921-928. DOI：10.1007/s13277-014-2719-x.

［7］ ZHOU X，ZHAO F，WANG ZN，et al. Altered expression of miR-152 and miR-148a in ovarian cancer is related to cell proliferation ［J］.Oncol Rep，2012，27 （2）：447-454. DOI：10.3892/or.2011.1482.

［8］ LI LW，XIAO HQ，MA R，et al. miR-152 is involved in the proliferation and metastasis of ovarian cancer through repression of ERBB3［J］. Int J Mol Med，2018，41 （3）：1529-1535. DOI：10.3892/ijmm.2017.3324.

［9］ QIN W，XIE W，HE Q，et al.MicroRNA-152 inhibits ovarian cancer cell proliferation and migration and may infer improved outcomes in ovarian cancer through targeting FOXP1［J］. Exp Ther Med，2018，15（2）：1672-1679. DOI：10.3892/etm.2017.5529.

［10］ HE J，YU JJ，XU Q，et al. ATG14 by EGR1-MIR152 sensitizes ovarian cancer cells to cisplatin-induced apoptosis by inhibiting cyto-protective autophagy ［J］. Autophagy，2015，11 （2）：373-384.DOI：10.1080/15548627.2015. 1009781.

［11］ LIU L，ZOU J，WANG Q，et al. Novel microRNAs expression of patients with chemotherapy drug-resistant and chemotherapy-sensitive epithelial ovarian cancer ［J］. Tumour Biol，2014，35 （8）：7713-7717.DOI：10.1007/s13277-014-1970-5.

［12］ REAM L，NORRIS L，SAADEH FA，et al. A novel serum micro-RNA panel to discriminate benign from malignant ovarian disease［J］. Cancer Lett，2015， （28） 356：628-636. DOI：10.1016/j.canlet.2014.10.010.

［13］ LEDER S，WEBER Y，ALTAFAJ X，et al. Cloning and characterization of Dyrk1B，a novel member of the DYRK family of protein kinases ［J］. Biochem Biophys Res Commun，1999 （2）：474-479. DOI：10.1006/ bbrc. 1998.9967.

［14］ BAGGA S，BRACHT J，HUNTER S，et al. Regulation by let -7 and lin-4 miRNAs results in target mRNA degradation ［J］. Cell，2005，122（ 4）：553-563. DOI：10.1016/ j.cell.2005.07.031.

［15］ XIANG Y，MA N，WANG D，et al. miR-152 and miR-185 co-contribute to ovarian cancer cells cisplatin sensitivity by targeting DNMT1 directly：a novel epigenetic therapy independent of decitabine［ J］. Oncogene，2014，33（ 3）：378-386. DOI：10.1038/onc.2012.575.

［16］ DENG X，EWTON DZ，LI S，et al. The kinase Mirk/Dyrk1B mediates cell survival in pancreatic ductal adenocarcinoma［ J］. Cancer Res，2006，66（ 8）：4149-4158. DOI：10.1158/0008-5472.CAN-05-3089.

［17］ GAO J，ZHENG Z，RAWAL B，et al. Mirk/Dyrk1B，a novel therapeutic target mediates cell survival in non-small cell lung cancer cells［ J］. Cancer Biol Ther，2009，8（ 17）：1671-1679. DOI：10.4161/cbt.8.17.9322.

［18］ KELLAND IR. Preclinical perspectives on platinum resistance［J］. Drug，2000，59（ 4）：1-8. DOI：10.2165/00003495-200059004-00001.

［19］ DENG X，F(xiàn)RIEDMAN E. Mirk kinase inhibition blocks the in vivo growth of pancreatic cancer cells［ J］. Genes Cancer，2014，5（ 9/10）：337-347. DOI：10.18632/ genesandcancer.29.

［20］ JING H，EILEEN F. Depleting Mirk/Dyrk1B kinase increases cisplatin toxicity in ovarian cancer cells［ J］. Genes Cancer，2010，1（ 8）：803-811. DOI：10. 1177/1947601910377644.

［21］ JING H，HOLLY D，F(xiàn)RIEDMAN EA. Ovarian cancer cells，not normal cells，are damaged by Mirk/Dyrk1B/ Dyrk1B kinase Inhibition［ J］. Int J Cancer，2013，132（ 10）：2258-2269. DOI：10.1002/ijc.27917.

［22］ TIBERIO P，CAVADINI E，ABOLAFIO G，et al. 4-oxo-N-（ 4-hydroxyphenyl） retinamide：two independent ways to kill cancer cells［ J］. PLoS One，2010，5（ 10）：e13362. DOI：10.1371/journal.pone.0013362.

［23］ SINGH R，DHANYAMRAJU PK，LAUTH M. DYRK1B blocks canonical and promotes non-canonical Hedgehog signaling through activation of the mTOR/AKT pathway［ J］. Oncotarget，2017，8（ 1）：833-845. DOI：10.18632/oncotarget. 13662.