星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化枳雀內(nèi)果皮檸檬苦素提取工藝

孫小雯,彭 穎,何婉鶯,李小燕,潘思軼

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070)

枳雀是陜西省南部的一個(gè)天然品種,果皮較厚，有光滑和粗糙兩種類型,果實(shí)近球形,中心柱充實(shí)果基微凹,果頂圓且有印圈[1],其抗寒性強(qiáng),可做耐寒砧木[2],果實(shí)味苦,當(dāng)?shù)厝顺⑿」L(fēng)干后磨成粉末或曬干青果作藥用。由于味苦,使枳雀成為苦味物質(zhì)和功能成分研究中的重要材料[1-2]。

有研究表明,柑橘類產(chǎn)生苦味的主要原因之一是其含有類檸檬苦素質(zhì)[3-4]。檸檬苦素具有抗癌、抗炎、抗瘧疾、抗 HIV 活性等生理活性,具有降低膽固醇、清除肺部充血性粘膜等功能[5-11]。

目前,提取檸檬苦素類的方法主要有傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法[4,12-15],特點(diǎn)是提取率高,操作簡(jiǎn)便,但也存在溶劑殘留、污染環(huán)境等問題[14-15],常用有機(jī)溶劑有丙酮、甲醇、乙醇等。異丙苯磺酸鈉具有特定的親水-親油雙親結(jié)構(gòu),可降低細(xì)胞膜與水溶液間的界面張力,增加細(xì)胞內(nèi)外濃度差,提高細(xì)胞內(nèi)部系統(tǒng)含水量,是可提高物質(zhì)的溶解能力的表面活性劑[16-19]。有報(bào)道稱,水溶助劑的助溶作用變化規(guī)律為:當(dāng)水溶助劑濃度在最小助溶濃度之上時(shí),其助溶作用幾乎呈指數(shù)上升,但水溶助劑到達(dá)一定濃度之后,其助溶作用不會(huì)再升高,且當(dāng)用水溶助劑溶液被稀釋至其最小助溶濃度以下時(shí),可回收析出的目標(biāo)提取物[18-19]。劉君[17]、曾玉聰[20]等曾用水溶助劑法提取柑橘種子中的檸檬苦素,但用水溶助劑法提取枳雀中檸檬苦素的工藝研究卻鮮有報(bào)道。

本文用異丙苯磺酸鈉為水溶助劑,代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機(jī)溶劑,以異丙苯磺酸鈉濃度、用量、浸提時(shí)間3個(gè)因素為響應(yīng)因子,以檸檬苦素得率(mg/g)為響應(yīng)值,優(yōu)化枳雀內(nèi)果皮中檸檬苦素的提取工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枳雀 產(chǎn)地陜西;檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司;乙醇、異丙苯磺酸鈉、醋酸、高氯酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;對(duì)二甲氨基苯甲醛 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

QE-100克高速萬能粉碎機(jī) 浙江屹立工貿(mào)有限公司;LGJ-18S冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;AX124ZH電子天平 奧豪斯儀器有限公司;WE-1水浴恒溫振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;752E紫外分光光度計(jì) 天津冠澤科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 指示劑的制備:按冰醋酸∶高氯酸(V∶V)為5∶4的比例制得酸母液備用,按每30 mL酸母液加入1.11 g對(duì)二甲氨基苯甲醛的比例制得指示劑,指示劑現(xiàn)用現(xiàn)配[17,20]。

準(zhǔn)確吸取0.2 mg/mL的檸檬苦素對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL,分別置于4 mL容量瓶中,用2 mol/L的異丙苯磺酸鈉溶液定容至4.0 mL,在40 ℃靜置6 h,分別取各濃度標(biāo)準(zhǔn)液2.0 mL,快速加入顯色劑和酸母液各3.0 mL,搖勻,靜置30 min,以第一試管做空白,在最大吸收波長(zhǎng)470 nm處測(cè)定吸光度[17]。以吸光度(y)為縱坐標(biāo),檸檬苦素(x)濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.809x+0.002,R2=0.9990。

1.2.2 樣品中檸檬苦素含量測(cè)定 枳雀內(nèi)果皮在-40 ℃,真空度4 Pa條件下凍干30 h并粉碎后,過40目篩,干燥保存,備用。精密稱取2.0 g枳雀內(nèi)果皮粉末,在不同條件下用水溶助劑溶液提取,所得提取液定容于100 mL容量瓶中,取2.0 mL按照1.2.1所示方法進(jìn)行操作,將所測(cè)樣品吸光度值帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,求得提取液中的檸檬苦素濃度(mg/mL),進(jìn)而計(jì)算出樣品中檸檬苦素得率(mg/g)。

檸檬苦素得率(mg/g)=樣品溶液中檸檬苦素濃度×樣品溶液體積/樣品質(zhì)量

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 精密稱取2.0 g枳雀內(nèi)果皮粉末,固定溫度為40 ℃,水溶助劑濃度2.0 mol/L,水溶助劑用量30 mL/g,提取時(shí)間6 h,分別考察不同水溶助劑濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L)、水溶助劑用量(15、20、25、30、35 mL/g)、提取時(shí)間(3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 h)對(duì)檸檬苦素提取量的影響,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,以確定各因素的恰當(dāng)范圍。

1.2.4 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取水溶助劑用量(X1)、水溶助劑濃度(X2)、提取時(shí)間(X3)3個(gè)因素做自變量,利用Design-Expert 8.0軟件,按星點(diǎn)設(shè)計(jì)方法設(shè)定因素水平表[21],見表1,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平

以效應(yīng)值為縱坐標(biāo),固定3個(gè)自變量之一為中值,其他兩個(gè)自變量為橫坐標(biāo),利用Design-Expert 8.0軟件繪制三維效應(yīng)面圖及等高線圖。由圖中的效應(yīng)值選取最佳自變量值范圍,分析得出回歸模型最大值,并用效應(yīng)面法得出的最佳工藝條件提取枳雀內(nèi)果皮中檸檬苦素,經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),最終得到優(yōu)化的提取工藝條件。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 水溶助劑用量對(duì)檸檬苦素得率的影響 由圖1可知,隨著水溶助劑用量增加,枳雀內(nèi)果皮粉末與提取液的接觸面的濃度變大,水溶助劑溶液用量的增加有助于檸檬苦素的浸出,但當(dāng)溶劑用量到30 mL/g之后,檸檬苦素得率穩(wěn)定,說明當(dāng)水溶助劑用量為30 mL/g時(shí),檸檬苦素已基本提取完全,此時(shí)繼續(xù)增加溶劑用量,不僅會(huì)造成單位提取液中檸檬苦素含量降低,而且浪費(fèi)溶劑和能源,也給后續(xù)的濃縮提純工作帶來困難[17,20],故30 mL/g為提取檸檬苦素的適宜用量。

圖1 水溶助劑用量對(duì)枳雀內(nèi)果皮中檬苦素得率的影響

2.1.2 水溶助劑濃度對(duì)檸檬苦素得率的影響 由圖2可知,隨著水溶助劑濃度的增加,檸檬苦素得率先增加后略有減少,可能是水溶助劑濃度升高,提取物中非目標(biāo)成分增加,可能會(huì)影響檸檬苦素純度[17],因此選擇水溶助劑2.0 mol/L為提取檸檬苦素的適宜用濃度。

圖2 水溶助劑濃度對(duì)枳雀內(nèi)果皮中檸檬苦素得率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)檸檬苦素得率的影響 由圖3可知,隨著提取時(shí)間增長(zhǎng),檸檬苦素提取量增加,但7.5 h以后檸檬苦素提取量穩(wěn)定,提取時(shí)間延長(zhǎng)不會(huì)引起檸檬苦素提取量的變化,故選擇7.5 h為適宜提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)枳雀內(nèi)果皮中檸檬苦素得率的影響

2.2 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素范圍,星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析 以水溶助劑用量(X1)、水溶助劑濃度(X2)、提取時(shí)間(X3)為自變量,檸檬苦素得率(mg/g)為因變量,采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合。

Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2的星點(diǎn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方差分析如表3所示。由表3可知:二項(xiàng)方程的R2=0.9526,且p<0.01,說明二項(xiàng)式模型的擬合度好,預(yù)測(cè)可靠性更佳。對(duì)上述二項(xiàng)式模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(見表3),p值大小可判斷各因素對(duì)檸檬苦素得率的影響,B對(duì)檸檬苦素的提取影響顯著(p<0.05)。同時(shí),A2、B2、C2對(duì)檸檬苦素得率的影響極顯著(p<0.01),A、C一次項(xiàng)都不顯著(p>0.05),說明具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)效應(yīng)值得影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。因此,宜采用二項(xiàng)式模型進(jìn)行擬合。結(jié)果顯示各因素對(duì)檸檬苦素得率的影響次序?yàn)?水溶助劑濃度>水溶助劑用量>提取時(shí)間。

表3 擬合二項(xiàng)式方差分析結(jié)果

2.2.3 效應(yīng)面分析 根據(jù)二項(xiàng)式方程,以效應(yīng)值為縱坐標(biāo),固定3個(gè)自變量之一為中值,其他兩個(gè)自變量為橫坐標(biāo),應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件繪制三維效應(yīng)面圖,結(jié)果見圖4～圖6。

圖4 水溶助劑用量與濃度對(duì)檸檬苦素得率影響的效應(yīng)面圖

圖5 水溶助劑用量與提取時(shí)間對(duì)檸檬苦素得率影響的效應(yīng)面圖

圖6 水溶助劑濃度與提取時(shí)間對(duì)檸檬苦素得率影響的效應(yīng)面圖

由圖4～圖6可以直觀的看出各因素交互作用對(duì)枳雀內(nèi)果皮檸檬苦素提取量的影響,若曲線越陡峭,表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)矫舾?此因素的交互作用對(duì)提取檸檬苦素的影響越大;反之曲面坡度越平緩,操作條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響越小。AB、BC、AC的交互作用對(duì)枳雀內(nèi)果皮檸檬苦素提取量不具有顯著性影響。

通過軟件分析,得出回歸模型的最大值點(diǎn),即枳雀內(nèi)果皮檸檬苦素的最佳提取工藝條件為:異丙苯磺酸鈉溶液濃度2.26 mol/L,用量27.72 mL/g,浸提7.2 h,枳雀內(nèi)果皮檸檬苦素預(yù)測(cè)得率為4.37 mg/g。

2.2.4 最佳工藝條件的驗(yàn)證 但考慮到實(shí)際操作及工業(yè)生產(chǎn)的局限性,對(duì)最佳工藝條件做如下修正:在2.3 mol/L的異丙苯磺酸鈉溶液,用量27.7 mL/g,浸提7.0 h。依此工藝條件進(jìn)行五組重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,枳雀內(nèi)果皮中檸檬苦素平均提取量為4.32 mg/g,與擬合方程預(yù)測(cè)值4.37 mg/g偏差較小。說明用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠,所選工藝條件重復(fù)性好,工藝優(yōu)化條件可行。

依照孫崇德[22]提取方法提取了枳雀內(nèi)果皮檸檬苦素,五次平行,在最佳工藝條件下,檸檬苦素平均提取量為2.54 mg/g。與之相比,本研究所得檸檬苦素提取量為4.32 mg/g,提取量大,無有機(jī)溶劑殘留,水溶助劑沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)可回收利用[21],此法更加適用于枳雀內(nèi)果皮檸檬苦素的提取。

3 結(jié)論

本研究采用水溶助劑提取法從枳雀內(nèi)果皮中提取檸檬苦素,應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化了枳雀內(nèi)果皮中檸檬苦素的提取工藝。通過回歸分析和驗(yàn)證,枳雀內(nèi)果皮檸檬苦素的最佳提取條件為:水溶助劑異丙苯磺酸鈉濃度2.3 mol/L,用量27.7 mL/g,提取時(shí)間7.0 h。在此條件下,枳雀內(nèi)果皮檸檬苦素的實(shí)際提取量為4.32 mg/g與理論預(yù)測(cè)值4.37 mg/g較為接近,表明采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化枳雀內(nèi)果皮檸檬苦素提取工藝的方法準(zhǔn)確可行。整個(gè)工藝流程簡(jiǎn)單,操作方便,研究結(jié)果將為枳雀資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

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