納地青霉發(fā)酵鴨血食用品質(zhì)的變化

孫永才,孫京新,*,王寶維,黃 明,徐幸蓮,于 冰

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心,江蘇南京 210095)

鴨血具有高蛋白、低脂肪、低糖、微量元素豐富等特點(diǎn),且鴨血蛋白中富含八種人體必需氨基酸,特別是賴(lài)氨酸[1]，但是也存在血腥味大,血紅蛋白等大分子不易被人體消化吸收等弊端。目前,畜禽血液的加工程度低,大多數(shù)被加工為血豆腐[2-3]、血粉[4]等初級(jí)加工產(chǎn)物,產(chǎn)品附加值很低[5]。已經(jīng)有學(xué)者研究了提取鴨血中的血紅素[6]、營(yíng)養(yǎng)肽[7-8]、抗氧化肽[9]等來(lái)提高鴨血的附加值。利用霉菌發(fā)酵血液,提高血液水解度,應(yīng)用到飼料中已有較多研究,馬小元[10]、Zheng等[11]研究了黑曲霉發(fā)酵豬血的工藝參數(shù)優(yōu)化,為水解血粉飼料的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。范遠(yuǎn)景等[12]優(yōu)化了枯草芽孢桿菌發(fā)酵豬血粉懸液制備豬血多肽的最佳工藝參數(shù),為微生物發(fā)酵豬血粉制備高營(yíng)養(yǎng)的動(dòng)物蛋白飼料和提取功能性多肽提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

霉菌在傳統(tǒng)的發(fā)酵食品中起著舉足輕重的作用,已經(jīng)有7個(gè)青霉屬(包括納地青霉)被認(rèn)為是對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)有益的[13]。霉菌酶系發(fā)達(dá)、代謝能力強(qiáng),通過(guò)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中脂肪和蛋白的分解產(chǎn)生特有的外觀和特異的“霉菌香味”[14],一些青霉還具有抑抑細(xì)菌、抗氧化的作用而被用于干腌肉制品的發(fā)酵[15]。在法國(guó)、意大利等歐洲國(guó)家,干腌香腸中有60%以上是霉菌發(fā)酵香腸,納地青霉是主要的霉菌發(fā)酵劑之一,對(duì)促進(jìn)產(chǎn)品后熟過(guò)程中風(fēng)味的形成具有重要的作用[16-18]。Castro等[19]利用納地青霉發(fā)酵意大利香腸,并對(duì)香腸的風(fēng)味物質(zhì)、脂肪酸等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明納地青霉能顯著提高意大利香腸的品質(zhì)。Jacobsen等[20]研究了納地青霉在葡萄糖、蛋白胨、脂肪酸和豬肉提取物培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況,分離出醇類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)多種風(fēng)味物質(zhì),認(rèn)為納地青霉產(chǎn)生的特殊風(fēng)味主要來(lái)自對(duì)脂肪酸的分解,與培養(yǎng)基成分無(wú)關(guān)。Nal?ovy干酪在發(fā)酵過(guò)程中納地青霉附著在干酪表面生長(zhǎng),顏色從潔白逐漸變?yōu)榉奂t色甚至紅色,干酪胚也成熟為典型的橙黃色[21]。Mrázek等[22]研究了8株納地青霉對(duì)干酪的影響并與卡門(mén)伯特青霉作對(duì)比,發(fā)現(xiàn)納地青霉均能促進(jìn)干酪蛋白的成熟,增加蛋白水解度,并有納地青霉成熟后特有的外觀顏色,感官評(píng)分也顯著提高。

目前,對(duì)于血液發(fā)酵制品的研究多應(yīng)用于動(dòng)物飼料的生產(chǎn),在深加工食品領(lǐng)域的應(yīng)用相對(duì)較少,而納地青霉目前多用于發(fā)酵干腌香腸、干酪等,關(guān)于采用納地青霉發(fā)酵鴨血的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本文以高溫滅菌的熟制鴨血為原料、納地青霉為發(fā)酵劑,進(jìn)行純菌種發(fā)酵,為獲得具有特定質(zhì)地、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)成分的發(fā)酵鴨血制品提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鴨血 青島市大潤(rùn)發(fā)流通事業(yè)股份有限公司;納地青霉(AS3.4357) 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;察氏瓊脂培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;牛血清蛋白(純度97%)、考馬斯亮藍(lán)G-250 北京索萊寶科技有限公司;三氟乙酸、乙腈、磺基水楊酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、HCl 均為國(guó)產(chǎn)色譜純。

DPX-916恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);TA-XT.Plus型物性分析儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司;UV-2000型分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;H-1650臺(tái)式高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;日立L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司;5975B/6890N氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 美國(guó)Agilent公司;DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭(50 μm) 美國(guó)supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納地青霉菌株活化及發(fā)酵劑的制備 將納地青霉菌株接入察氏培養(yǎng)基斜面,置(27±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d,然后再?gòu)男泵嫔咸羧【尤肓硪粋€(gè)斜面上,重復(fù)以上的操作,連續(xù)轉(zhuǎn)接3次,即獲得活化菌株。將活化好的斜面菌株,用適量無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗吹打菌落,將孢子和菌絲移入滅菌的50 mL三角瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置數(shù)粒玻璃珠),充分振搖后用6層無(wú)菌紗布進(jìn)行過(guò)濾,并沖洗濾渣2～3次,最后使濾液體積達(dá)到10 mL,即為孢子懸浮液。將孢子懸浮液進(jìn)行梯度稀釋,采用血球板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù),選擇106CFU/mL左右濃度的梯度稀釋液作為發(fā)酵劑[23]。

1.2.2 鴨血預(yù)處理及接種 將鴨血于平底容器中90 ℃水浴加熱30 min,凝固成塊后,用手術(shù)刀切成3 cm×3 cm×3 cm的小塊,取三塊于平皿(Φ10 cm)中。在121 ℃條件下滅菌20 min,取制備好的發(fā)酵劑0.5 mL無(wú)菌操作下均勻涂抹在鴨血表面,以涂抹無(wú)菌生理鹽水組作為空白對(duì)照組,27 ℃條件下發(fā)酵5 d,得到待測(cè)樣品。

1.2.3 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定 用手術(shù)刀取塊型完整、均勻一致的待測(cè)樣品,采用TPA二次下壓法,利用物性分析儀(TA-XT. plus)測(cè)定。具體參數(shù):探頭型號(hào)為P/0.5R,測(cè)試前速度2.0 mm/s,測(cè)試速度1.0 mm/s,測(cè)試后速度1.0 mm/s,下壓距離10 mm。從TPA特征曲線計(jì)算出硬度(g)、彈性、黏著性(g·s)。每組樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 可溶性蛋白含量 采用考納斯亮藍(lán)法[24]測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:先準(zhǔn)確配制1 mg/mL牛血清蛋白(BSA)母液,再往母液中加0.1 mol/L的PBS(pH=7.2)配制一組濃度分別為0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL的BSA溶液。取不同濃度的1 mL BSA溶液加入到試管中,再依次加入4 mL考馬斯亮藍(lán)溶液反應(yīng)10 min,用分光光度計(jì)測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處的吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y=6.757x-0.002,R2=0.9997。

樣品蛋白溶液的制備:準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0000 g鴨血樣品于研缽中加入9 mL PBS(pH=7.2)充分研磨,全部轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中,8000 r/min離心10 min,取上清液1 mL加入到試管中,再依次加入4 mL考馬斯亮藍(lán)溶液反應(yīng)10 min,用分光光度計(jì)測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處的吸光度,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中可溶性蛋白含量。

1.2.5 游離氨基酸測(cè)定 將真空冷凍干燥后的發(fā)酵、未發(fā)酵鴨血樣品研成粉末,準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5000 g,加入6.0 mL去離子水混勻,超聲(80 Hz,室溫)提取20 min,用去離子水定容至10.0 mL,混勻。準(zhǔn)確量取提取液2.0 mL加入2.0 mL 10%的磺基水楊酸,于10 mL離心管振蕩混勻,靜置2 h,4000 r/min離心15 min,準(zhǔn)確取上清液2.0 mL,加入1 mL 1% EDTA-Na2溶液和1.0 mL 0.06 mol/L HCl溶液混合,振蕩5 min,高速離心(15000 r/min,25 ℃,10 min),取上清液1.0 mL,采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定。

1.2.6 揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè) 采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定,將待測(cè)樣品切碎黃豆粒大小,取10 g(精確至0.0001)于固相微萃取瓶中,固相微萃取頭在氣相色譜儀進(jìn)樣口老化60 min(280 ℃)后插入瓶中頂空部分,在60 ℃條件下萃取60 min,吸附結(jié)束后,拔出萃取頭,再于氣相色譜儀進(jìn)樣口250 ℃下解吸2 min。

色譜條件:采用TR-5-MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min至200 ℃,再以10 ℃/min至240 ℃,保留10 min,運(yùn)行總時(shí)間45 min;檢測(cè)溫度240 ℃;載氣為He;流速 1.6 mL/min;恒壓13.02 kPa;離子源溫度240 ℃;電子能量70 ev。

質(zhì)譜定量分析:化合物經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NIST Library、Wiley Library、Mainlib數(shù)據(jù)庫(kù)匹配。匹配度和反匹配度大于600(最大值1000)的作為定性結(jié)果。采用相對(duì)百分含量按峰面積歸一化法處理,進(jìn)行風(fēng)味成分的定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 18.0的ANOVA軟件進(jìn)行方差分析,并用Duncan’s多重比較,差異顯著性水平p<0.05，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)構(gòu)分析

由表1可知,發(fā)酵后鴨血的硬度顯著低于未發(fā)酵鴨血(p<0.05),但其粘性卻顯著增大(p<0.05),這可能是由于納地青霉在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中分泌的蛋白酶作用于鴨血蛋白質(zhì)肽鍵兩側(cè)的氨基酸殘基,致使肽鍵斷裂,蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞,從而破壞了鴨血蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),造成鴨血硬度減小。與此同時(shí),蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的多肽和氨基酸以及納地青霉自身分泌的多糖等小分子物質(zhì)的出現(xiàn)也會(huì)導(dǎo)致鴨血表面粘性增加;與未發(fā)酵鴨血相比,發(fā)酵后鴨血的彈性有所增大,但是不顯著(p>0.05)。這可能是因?yàn)槊咕谏L(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)消耗一定的水分,鴨血的水分活度下降,從而導(dǎo)致彈性的略微增大[25]。

表1 鴨血樣質(zhì)構(gòu)的變化

2.2 可溶性蛋白含量的比較分析

由圖1可知,與未發(fā)酵鴨血相比,發(fā)酵鴨血的可溶性蛋白含量顯著增加(p<0.05),由4.823 mg/g增加到8.443 mg/g。崔莎莎[26]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)經(jīng)水解后,其表面疏水性會(huì)降低,溶解度隨水解程度的增大而增大?？扇苄缘鞍缀吭黾涌赡苁羌{地青霉的蛋白酶作用于鴨血后,鴨血中的部分大分子蛋白質(zhì)分解為小分子蛋白和多肽類(lèi)物質(zhì)所致。Mora等[27]研究了干腌肉制品中多肽的水解途徑,認(rèn)為微生物在增加多肽和游離氨基酸含量方面具有非常大的作用,而且新增加的二肽、三肽主要是微生物分泌的二肽酶、三肽酶、氨肽酶和羧肽酶的作用結(jié)果。劉成梅等[7]認(rèn)為鴨血中的血漿蛋白經(jīng)酶解后產(chǎn)生小分子肽和氨基酸,但是中等程度的水解也會(huì)產(chǎn)生苦味肽,苦味肽可進(jìn)一步被水解為無(wú)苦味小肽。鴨血中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小肽物質(zhì)具有良好的溶解性、抗氧化性、可以直接被人體利用,提高了鴨血中大分子蛋白在人體中的利用率增加了鴨血的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[28]。

圖1 未發(fā)酵鴨血與發(fā)酵鴨血可溶性蛋白含量變化

2.3 游離氨基酸的比較分析

由表2可知,在鴨血中共檢測(cè)出17種氨基酸,發(fā)酵鴨血與未發(fā)酵鴨血相比,除精氨酸含量變化不顯著(p>0.05)外,其他游離氨基酸的含量均顯著增加(p<0.05);其中,經(jīng)過(guò)發(fā)酵,鴨血中谷氨酸含量變化最大,增加了0.583%,其次是苯丙氨酸、亮氨酸和丙氨酸,分別增加了0.560%、0.520%、0.360%。納地青霉分泌多種蛋白酶,首先由內(nèi)切蛋白酶將鴨血蛋白水解為長(zhǎng)鏈肽,然后由外切蛋白酶進(jìn)一步水解為小分子肽和氨基酸,消除苦味肽,增加風(fēng)味肽[29]。發(fā)酵后鴨血中游離氨基酸的總量是發(fā)酵前的20.58倍,該結(jié)果與Mrázek等[22]的研究結(jié)果一致。

表2 鴨血樣中游離氨基酸的含量(%)

2.4 揮發(fā)性物質(zhì)的比較分析

由圖2、圖3及表3可知，與未發(fā)酵鴨血中各揮發(fā)性物質(zhì)的含量相比,發(fā)酵鴨血樣品中酯類(lèi)、醛類(lèi)和酰胺類(lèi)物質(zhì)的含量和種類(lèi)顯著增加(p<0.05),酯類(lèi)物質(zhì)主要來(lái)源于納地青霉對(duì)鴨血中蛋白質(zhì)分解形成羥基和脂肪分解產(chǎn)生的羧基相結(jié)合產(chǎn)生,醛類(lèi)則是由醇羥基氧化產(chǎn)生的[30]。三甲胺是產(chǎn)生魚(yú)腥味的主要物質(zhì),2,6-壬二烯醛也屬于風(fēng)味閾值低、有異味的物質(zhì)[31]。在發(fā)酵鴨血中,另外2,6-壬二烯醛顯著低于未發(fā)酵鴨血(p<0.05)。另外,三甲胺、苯甲醛(堅(jiān)果香)、4-丁基苯酚(中藥氣味)、正辛醇(刺激性氣味)、癸酮(油膩的脂肪氣味)在發(fā)酵鴨血中均未檢出,有可能是在發(fā)酵過(guò)程中參與其他反應(yīng)或者揮發(fā)盡了。鴨血在發(fā)酵過(guò)程中在納地青霉的作用下發(fā)生明顯的水解作用,同時(shí)也發(fā)生復(fù)雜的氧化還原反應(yīng)、美拉德反應(yīng),最終使發(fā)酵鴨血的揮發(fā)性成分復(fù)雜多樣,變化顯著(p<0.05)。酯類(lèi)物質(zhì)多帶有水果味,某些酯類(lèi)(乙酸乙酯、壬酸乙酯等)還帶有輕微的酯香味。因此,以納地青霉發(fā)酵鴨血,不僅能夠有效較少鴨血的腥味,還可產(chǎn)生多種新的芳香類(lèi)物質(zhì),對(duì)發(fā)酵鴨血起到增香增味的作用。

圖2 未發(fā)酵鴨血揮發(fā)性物質(zhì)總離子流色譜圖

圖3 發(fā)酵鴨血揮發(fā)性物質(zhì)總離子流色譜圖

表3 GC-MS分析鴨血樣中主要揮發(fā)性物質(zhì)成分組成

3 結(jié)論

本研究以納地青霉為發(fā)酵劑,高溫高壓滅菌的鴨血為發(fā)酵底物進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后鴨血的硬度顯著降低(p<0.05),粘性顯著增大(p<0.05),而彈性變化不顯著(p>0.05)。相比于未發(fā)酵鴨血,發(fā)酵鴨血的可溶性蛋白、游離氨基酸的含量顯著增加(p<0.05),鴨血的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到提升。此外,發(fā)酵前后鴨血揮發(fā)性成分的種類(lèi)及含量也有較為明顯的變化。發(fā)酵鴨血中揮發(fā)性物質(zhì)主要為醛類(lèi)和酯類(lèi)物質(zhì),而鴨血中的腥味物質(zhì)如2,6-壬二烯醛顯著減少(p<0.05),三甲胺等未檢出，血腥味幾乎消失,這為鴨血的開(kāi)發(fā)利用提供了新的思路和方法。

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