火龍果不同部位發(fā)酵后活性成分含量和抗氧化活性

盧冬梅,曾靖雅,潘進權(quán),藺紅蘋,蔣 邊

(嶺南師范學院生命科學與技術(shù)學院,廣東湛江 524048)

火龍果(Hylocereusundatus)為仙人掌科(Cactaceae)植物,別名有仙蜜果、情人果、紅龍果等[1-2]。因火龍果果實呈橄欖狀果形,外表又有像蛟龍外麟的肉質(zhì)鱗片,所以得名火龍果[3-4]。火龍果可分為3類,分別是紅色皮紅色肉、紅色皮白色肉、黃色皮白色肉[5]。火龍果營養(yǎng)豐富、功能獨特,含有一般植物少有的植物性白蛋白以及花青素,豐富的維生素和水溶性膳食纖維[6-7]。經(jīng)常食用火龍果有助提高人體免疫力,不僅有降血壓、抗氧化、抗癌和預防心血管疾病等作用,還具有養(yǎng)膚減重、明目、護胃等作用[8-9]。

關(guān)于火龍果的研究,主要集中在火龍果不同部位營養(yǎng)成分的測定和評價[10-11],以及果皮天然食用色素[12]、果膠[13]、種子油[14]和黃酮化合物[15]的提取開發(fā)等,并且采用超聲波提取法[16]、微波輔助提取法[13]和亞臨界水提取法[17]等方法提取活性物質(zhì),但是火龍果發(fā)酵方面國內(nèi)外研究少見報道。由于火龍果富含營養(yǎng)物質(zhì),經(jīng)過微生物發(fā)酵后富含各種酶和酶促產(chǎn)物及各種營養(yǎng)物質(zhì),含有火龍果本身以及酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的雙重營養(yǎng)價值,具有很好的營養(yǎng)保健功能。目前火龍果發(fā)酵大部分研究是酵素產(chǎn)品研發(fā)[18]、果酒[19-23]、復合果酒[24-25]、復合米酒[26]、果醋[27]、低糖果脯[28]和凝固型酸奶[29]等食品發(fā)酵工藝研究,采用的主要菌種為酵母菌,但是火龍果發(fā)酵代謝產(chǎn)生的生物活性成分及其抗氧化活性研究比較少。董銀卯等[18]進行火龍果果實經(jīng)酵母菌發(fā)酵后的產(chǎn)物初步研究;烏日娜等[20]研究4種不同酵母發(fā)酵的火龍果酒在發(fā)酵過程中總酚、甜菜苷、抗氧化活性和顏色的變化規(guī)律;袁星星等[23]研究了紅肉火龍果果酒發(fā)酵期間品質(zhì)變化。但少有酵母菌發(fā)酵不同種類和部位火龍果的抗氧化活性及其相關(guān)性的研究。

本文分析酵母菌發(fā)酵不同種類和部位火龍果的總酚、總黃酮含量及抗氧化活性(總抗氧化能力、還原能力和羥自由基清除能力)的影響及討論酚類、黃酮類物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性,為火龍果的綜合利用以及深加工提供理論依據(jù)。特別火龍果皮都作為廢棄物丟棄,造成了極大的浪費,變廢為寶,具有一定社會價值和實用意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮火龍果 廣東省湛江市市場;白砂糖 市售,為食用級;安琪葡萄酒高活性干酵母RV171 購自安琪酵母股份公司;沒食子酸(gallate acid,GA) 廣東翁江化學試劑有限公司,99%;蘆丁 美國sigma公司,98%;維生素C(VC) 廣東西隴化工有限公司,98%;鄰二氮菲和鐵氰化鉀等其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

LG16-W型離心機 北京京立離心機有限公司;UV-3000PC型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;VIS-722(N.S)型可見光分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;DZKW-C型儀表恒溫不銹鋼水浴鍋 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;YXQ.SG41.280電熱手提壓力蒸汽消毒器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 選擇成熟度高、無霉爛變質(zhì)及無病蟲害的新鮮火龍果,洗凈晾干后把表面的鱗片剪去。將不同種類的火龍果的不同部位(紅心火龍果果肉,red flesh,RF;白心火龍果果肉,white flesh,WF;紅心火龍果果皮,red peel,RP;白心火龍果果皮,white peel,WP)分離并切粒、打漿;通過添加25%白砂糖,10%酵母菌RV171,采用前期預實驗溫度為30 ℃下發(fā)酵4 h;發(fā)酵完成后用6層細紗布進行過濾,將過濾所得的濾汁經(jīng)離心機10000 r/min離心10 min,制成火龍果不同種類和部位的發(fā)酵液,用于體外抗氧化活性測定。

1.2.2 總酚(total phenolic contents,TPC)含量的測定 采用福林酚(Folin-Ciocalteu)法來測定火龍果發(fā)酵液的TPC含量[30]。1 mL樣品與1 mL福林酚試劑混勻,5 min后加3 mL質(zhì)量分數(shù)20% Na2CO3溶液和5.0 mL蒸餾水充分混勻,并避光反應(yīng)1.5 h,于波長765 nm處測吸光度。以GA為標準品(200～1200 mg/L)繪制標準曲線,回歸方程為y=0.0083x+0.0594,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9935。總酚含量(mg/L)=(OD765-0.0594)×稀釋倍數(shù)/0.0083。

1.2.3 總黃酮(total flavonoid contents,TFC)含量的測定 采用Al(NO3)3-NaOH-NaNO2法測定樣品中TFC的含量[31]。0.4 mL樣品與0.3 mL質(zhì)量分數(shù)5% NaNO2溶液室溫反應(yīng)6 min后,加入0.3 mL質(zhì)量分數(shù)10% Al(NO3)3溶液混勻后反應(yīng)6 min,加入4.0 mL質(zhì)量分數(shù)4% NaOH溶液和5.0 mL蒸餾水充分混勻,反應(yīng)15 min后,于波長510 nm處測吸光度。以蘆丁為標準品(100～500 mg/L)繪制標準曲線,回歸方程為y=0.0015x-0.0013,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9979?？傸S酮含量(mg/L)=(OD510+0.0013)×稀釋倍數(shù)/0.0015。

1.2.4 體外抗氧化活性的測定

1.2.4.1 總抗氧化能力的測定 采用磷鉬絡(luò)合法[32]測定樣品的總抗氧化能力。試管中依次加入3 mol/L H2SO4溶液2 mL、0.14 mol/L Na3PO4溶液2 mL和0.02 mol/L鉬酸銨溶液2 mL。再加入2 mL樣品,用蒸餾水定容至10 mL,混合均勻。加塞于95 ℃水浴中加熱90 min,取出冷卻后用空白(蒸餾水代替樣品)調(diào)零在695 nm波長下測量。VC作為標準品,以吸光度(A695)為縱坐標,VC的濃度(40～120 mg/L)為橫坐標繪制標準曲線,回歸方程為y=0.0079x-0.1493,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9941。總抗氧化能力以等量VC(mg/L)表示?？偪寡趸芰?等量VC濃度mg/L)=(OD695+0.1493)×稀釋倍數(shù)/0.0079。

制備不同濃度的樣品,測定其總黃酮質(zhì)量濃度和總抗氧化能力,研究不同總黃酮質(zhì)量濃度對總抗氧化能力的影響。

1.2.4.2 還原能力的測定 采用普魯士藍法[33]測定樣品的還原能力。取2.5 mL不同濃度的樣品,加入0.2 mol/mL磷酸鹽緩沖液(pH6.6)2.5 mL和1% 鐵氰化鉀2.5 mL,混合均勻,于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min后急速冷卻;取出再加入10% 三氯乙酸2.5 mL。而后于3000 r/min下離心10 min,取上清液2.5 mL加入蒸餾水2.5 mL,加1 mg/L三氯化鐵0.5 mL,混勻后用分光光度計于700 nm波長處測定吸光值。以VC為標準品,繪制標準曲線。還原能力以等量VC(mg/L)表示。

取不同濃度的樣品,測定其總黃酮質(zhì)量濃度和還原能力,研究不同總黃酮質(zhì)量濃度對還原能力的影響。

1.2.4.3 羥基自由基清除能力的測定 參照Fenton方法[34]的方法測定樣品對羥基自由基的清除能力。精密量取2.0 mL磷酸鹽緩沖液(PBS,0.4 mol/L,pH=7.4),4.0 mL蒸餾水于試管中,作為空白參比管;精密量取2.0 mL PBS、1.0 mL鄰二氮菲(1.5 mmol/L)、1.0 mL FeSO4(1.5 mmol/L)和2.0 mL蒸餾水,作為未損傷管;精密量取2.0 mL PBS、1.0 mL鄰二氮菲(1.5 mmol/L)、1.0 mL FeSO4(1.5 mmol/L)、1.0 mL H2O2(0.02%)和1.0 mL蒸餾水,作為損傷管;精密量取2.0 mL PBS、3.0 mL蒸餾水和1.0 mL樣品作為樣品參比管;精密量取2.0 mL PBS、1.0 mL鄰二氮菲(1.5 mmol/L)、1.0 mL FeSO4(1.5 mmol/L)、1.0 mL H2O2(0.02%)和1.0 mL樣品作為樣品管。

將上述各管置恒溫水浴鍋中,37 ℃保溫60 min,在536 nm處測定吸光值。按下式計算清除率:

羥自由基清除率(%)=[(Α樣品-Α樣參)-(Α損傷-Α空參)]/(Α未損-Α損傷)×100

式中:A樣品為樣品管的吸光度;A樣參為樣品參比管的吸光度;A空參為空白參比管的吸光度;A未損為未損傷管的吸光度;A損傷為損傷管的吸光度。

取不同濃度的樣品,測定其總黃酮質(zhì)量濃度和羥基自由基清除能力,研究不同總黃酮質(zhì)量濃度對羥基自由基清除能力的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚和總黃酮含量分析

如圖1所示,不同種類和部位火龍果發(fā)酵液總黃酮含量的變化范圍為386.64～452.42 mg/L,和白心火龍果相比,紅心火龍果具有較高的總黃酮含量,分別RP為452.42 mg/L和RF為418.87 mg/L;果皮總黃酮含量大于果肉。不同種類和部位火龍果發(fā)酵液總酚含量的變化趨勢為RP>WP>RF>WF,與WF相比，具有顯著性差異,RP發(fā)酵液中的總酚含量最高,為636.63 mg/L。與其他發(fā)酵產(chǎn)品相比[35],自然發(fā)酵的葡萄、桃和蘋果中,總黃酮含量分別為478.10、188.19和147.60 mg/L,總酚含量分別為710.47、323.50和217.57 mg/L?；瘕埞l(fā)酵后的總黃酮和總酚含量低于葡萄,明顯高于桃和蘋果。

圖1 不同種類和部位火龍果發(fā)酵液中總酚和總黃酮含量

烏日娜等[20]研究發(fā)現(xiàn),酵母 RC212發(fā)酵的火龍果酒的多酚含量最高為272.5 mg/L,遠遠低于本文火龍果發(fā)酵液中的多酚含量,這可能是由于發(fā)酵條件的不同、火龍果的品種和種植環(huán)境等一系列條件的不同造成的。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 總抗氧化能力 如圖2所示,火龍果發(fā)酵液具有較強的總抗氧化能力,且不同種類和部位發(fā)酵液對總抗氧化能力不同。和白心火龍果相比,相同部位紅心火龍果具有較高的總抗氧化能力,其中RP發(fā)酵液總抗氧化能力最強,總黃酮含量為113.00 mg/L時,等量VC濃度169.32 mg/L,但是白心火龍果果皮總抗氧化能力強于紅心火龍果果肉,WP發(fā)酵液的總黃酮含量為97.00 mg/L時,等量VC濃度135.90 mg/L;果皮總抗氧化能力強于果肉。沈佩儀[33]研究發(fā)現(xiàn),菠蘿皮1 g提取物相當于0.037 g VC,小于火龍果發(fā)酵液的總抗氧化能力,說明在抗氧化活性物質(zhì)方面,火龍果要優(yōu)于菠蘿。

圖2 不同總黃酮質(zhì)量濃度的總抗氧化能力

2.2.2 還原能力 如圖3所示,不同種類和部位火龍果發(fā)酵液的還原能力具有極顯著性差異(p<0.01)。和白心火龍果相比,相同部位紅心火龍果具有較高的還原能力,其中RP發(fā)酵液還原能力最強,總黃酮含量為113.00 mg/L時,還原能力為等量VC濃度140.29 mg/L,但是白心火龍果果皮還原能力強于紅心火龍果果肉,WP發(fā)酵液的總黃酮含量為97.00 mg/L時,還原能力為等量VC濃度122.02 mg/L;果皮還原能力強于果肉。烏日娜等[20]研究發(fā)現(xiàn),酵母R2發(fā)酵的火龍果酒的總還原力 IC50為28.52%,遠小于RP發(fā)酵液。可能與火龍果本身所含黃酮類、酚類物質(zhì),及發(fā)酵液中酵母菌及其代謝產(chǎn)物相關(guān)。

圖3 不同總黃酮質(zhì)量濃度的還原能力

2.2.3 羥自由基清除能力 在氧自由基中,羥基自由基的毒性最大。醫(yī)學研究表明,羥基自由基性質(zhì)十分活躍且對機體生物膜有極強的破壞力。受外界環(huán)境中諸多不良因子的影響,生物體內(nèi)往往會產(chǎn)生過量的羥自由基,導致機體發(fā)生病理變化,從而引發(fā)多種疾病。如圖4所示,和白心火龍果相比,相同部位紅心火龍果具有較高的還原能力,其中RP發(fā)酵液和WP發(fā)酵液對羥自由基清除能力無顯著性差異(p>0.05),RP發(fā)酵液總黃酮含量為90.40 mg/L時清除率為96.65%,WP發(fā)酵液總黃酮含量為97.00 mg/L時清除率為95.87%;果皮羥基自由基能力清除強于果肉,RF和WF發(fā)酵液對羥自由基清除能力分別為88.98%和86.29%,與WF相比具有顯著性差異(p<0.05)。馬若影等[17]亞臨界水提取紅心火龍果莖多糖,其羥自由基清除率可達95.15%,從比較結(jié)果可以看出亞臨界水提取和酵母菌發(fā)酵效果相當,RP發(fā)酵液具有相當強的羥自由基清除率。

圖4 不同總黃酮質(zhì)量濃度對羥自由基的清除作用

董銀卯等[18]進行火龍果果實酵母菌發(fā)酵后,當濃度在50%時,清除率為47.5%;烏日娜等[20]研究發(fā)現(xiàn),酵母R2發(fā)酵的火龍果酒的羥自由基清除率IC50為 8.84%,遠小于RP發(fā)酵液。

表1結(jié)果表明,RP發(fā)酵液具有較高的羥自由基清除能力,說明經(jīng)酵母菌發(fā)酵可提高火龍果對羥自由基的清除作用,可能與火龍果發(fā)酵液中多酚類物質(zhì),及酵母菌的抗氧化成分和氧化還原調(diào)控系統(tǒng)等有關(guān)[36]。

表1 發(fā)酵前后多酚、總黃酮含量及抗氧化活性測定(以RP發(fā)酵液為例)

2.2.4 不同火龍果發(fā)酵液的體外抗氧化活性相關(guān)性分析 越來越多的研究顯示抗氧化的重要性,植物抗氧化活性已成為研究熱點。如圖2～圖4所示,在一定范圍內(nèi),隨著不同火龍果發(fā)酵液的增加,體外抗氧化活性也增加。進一步相關(guān)性分析見表2,RF發(fā)酵液與總抗氧化能力和還原能力之間呈顯著正相關(guān),與羥自由基清除能力呈不顯著正相關(guān);WF、RP和WP發(fā)酵液與還原能力之間呈極顯著正相關(guān);RP和WP發(fā)酵液與總抗氧化能力之間呈極顯著正相關(guān),與羥自由基清除能力之間呈顯著正相關(guān);WF發(fā)酵液與羥自由基清除能力之間呈極顯著正相關(guān),與總抗氧化能力之間呈顯著正相關(guān)。

表2 不同火龍果發(fā)酵液的體外抗氧化活性相關(guān)性分析

2.3 總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

目前很多研究表明,植物活性成分的含量、比例與抗氧化性之間存在良好的相關(guān)性。如表3所示,多酚含量與還原能力之間呈顯著正相關(guān)(r=0.967),與羥自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)(r=0.967),與總抗氧化能力呈不顯著正相關(guān),總黃酮含量與總抗氧化能力、還原能力和羥自由基清除能力呈不顯著正相關(guān)。相關(guān)性分析顯示,酚類物質(zhì)是火龍果發(fā)酵液中主要的抗氧化成分,但黃酮不是火龍果發(fā)酵液中主要的抗氧化成分,可能是其他酚類物質(zhì)如甜菜苷、鞣質(zhì)等。

表3 總黃酮、總酚含量與體外抗氧化活性相關(guān)性分析

3 結(jié)論

不同種類和部位火龍果發(fā)酵液中,總黃酮含量、總酚含量和抗氧化活性不同,但都表現(xiàn)出濃度依賴性,隨著樣品濃度的增加而升高。其中不同發(fā)酵液中總黃酮含量變化范圍為386.64～452.42 mg/L;總酚含量為534.08～636.63 mg/L;總抗氧化能力、還原能力和羥自由基清除能力分別為104.47～169.32、67.97～140.29 mg/L和86.29%～96.65%。從火龍果不同種類發(fā)酵液來看,總黃酮含量無顯著性差異;總酚含量,紅心火龍果肉>白心火龍果肉(p<0.05);抗氧化活性,紅心火龍果>白心火龍果。從火龍果不同部位發(fā)酵液來看,總黃酮含量無顯著性差異;總酚含量:果皮>果肉;抗氧化活性:果皮>果肉。RP和WP發(fā)酵液總抗氧化能力具有極顯著性差異(p<0.01);RP、WP、RF和WF發(fā)酵液的還原能力具有極顯著性差異(p<0.01);RF和WF發(fā)酵液對羥自由基清除能力具有顯著性差異(p<0.05)。

綜上所述,紅心火龍果RP發(fā)酵液的總黃酮和總酚含量最高,總抗氧化能力、還原能力和羥自由基清除能力最強。相關(guān)性分析顯示,多酚類物質(zhì)是火龍果中主要的抗氧化成分,黃酮不是火龍果發(fā)酵液中主要的抗氧化成分,但具體的火龍果發(fā)酵液中酚類物質(zhì)組成和含量及其與抗氧化能力間的關(guān)系仍待進一步的研究。

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