安石榴苷和綠原酸對(duì)金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑制作用及機(jī)理研究

李光輝,郭衛(wèi)蕓,高雪麗,王永輝,孫思勝,夏效東

(1.許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南許昌 461000;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)為革蘭氏陽(yáng)性菌,呈球狀,是造成人類食物中毒的重要致病菌之一[1]。Staphyloccocusaureus易污染食品,在食品基質(zhì)中產(chǎn)生腸毒素(如SEA、SEB、SEC、SED、SEE)、溶血毒素、殺白細(xì)胞素、血漿凝固酶等外毒素,從而引起食物中毒[2]。近年來(lái)抗生素的濫用已導(dǎo)致了Staphyloccocusaureus“超耐藥”菌株(MRSA)的出現(xiàn),同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)速凍餃子、雞肉、豬肉、即食食品和原料牛奶等均攜帶有 MRSA 菌株[3],這就增加了多重耐藥的危險(xiǎn),使得疾病的預(yù)防和治療更加困難,并且易引發(fā)公共衛(wèi)生問(wèn)題,因而控制食品中Staphyloccocusaureus的污染對(duì)保障食品安全和消費(fèi)者身體健康至關(guān)重要。

目前主要采用化學(xué)防腐劑來(lái)控制食品中的致病菌。隨著對(duì)化學(xué)合成防腐劑安全性的質(zhì)疑以及人們對(duì)食品添加劑有天然、營(yíng)養(yǎng)和多功能的要求,天然食品防腐劑越來(lái)越受到人們的關(guān)注。安石榴苷是一種多羥基的酚類化合物,屬于水解性單寧,為石榴皮的主要活性成分,具有抗氧化、抗病毒、抗菌、護(hù)肝及減肥等作用[4-7]。綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸,是植物體在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物,在蘋果、金銀花等植物中廣泛存在,具有抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[8-10]。

前期研究證實(shí)安石榴苷、綠原酸分別對(duì)多種Staphyloccocusaureus具有抑制作用,其對(duì)StaphyloccocusaureusATCC25923的最小抑菌濃度(MIC)分別為250 μg/mL和2.5 mg/mL[11-12],但二者對(duì)Staphyloccocusaureus的協(xié)同抑制作用及機(jī)理未見報(bào)道。因此,本研究通過(guò)“棋盤法”確定安石榴苷和綠原酸聯(lián)合使用對(duì)Staphyloccocusaureus的抑制作用;同時(shí)通過(guò)生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞膜電勢(shì)、胞內(nèi)外pH差、細(xì)胞形態(tài)等方面闡明可能的協(xié)同抑菌機(jī)理。本研究為開發(fā)新型的食品防腐劑或者用于預(yù)防食源性致病菌(如Staphyloccocusaureus)的物質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

StaphyloccocusaureusATCC25923 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心;Luria-Bertan(LB)瓊脂培養(yǎng)基、Luria-Bertani(LB)肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;安石榴苷(純度≥98%) 成都曼思特生物科技有限公司;Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethineoxonol(簡(jiǎn)稱為DIBAC4(3)) 純度≥98%,美國(guó)Sigma公司;Carboxyfluoresceindiacetate,succinimidyl ester(簡(jiǎn)稱為CFDASE) 純度≥98%,美國(guó)Invitrogen Molecular Probes公司;尼日利亞菌素 純度≥98%,南京生利德生物科技有限公司;纈氨霉素 美國(guó)Sigma公司;HEPES 美國(guó)MP Biomedicals公司;其它試劑 均為分析純。

酶標(biāo)儀 美國(guó)BIO-RAD公司;多功能酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司;掃描電鏡 日本日立公司;離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液的制備 將-80 ℃保存的Staphyloccocusaureus接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上,在37 ℃培養(yǎng)12 h;然后,從平板上挑取1～3個(gè)菌落接種于LB肉湯中,37 ℃培養(yǎng)10 h。

1.2.2 MIC的測(cè)定 采用瓊脂稀釋法。LB固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50 ℃左右,然后分別向培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的安石榴苷或綠原酸;待凝固后,用移液槍在瓊脂表面滴加2 μL菌懸液(OD600 nm=0.5),待干燥后將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。以不加提取物的平板為對(duì)照。確定無(wú)菌生長(zhǎng)的最低稀釋濃度為MIC。

1.2.3 安石榴苷與綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus協(xié)同抑菌效應(yīng)的測(cè)定 采用棋盤法[13]。用LB肉湯分別將安石榴苷與綠原酸配制不同的濃度(0、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1MIC和2 MIC)。從低濃度到高濃度分別按行加入安石榴苷溶液50 μL,同行安石榴苷的濃度相等,每行加7孔,第1行作為不加安石榴苷的綠原酸對(duì)照組。從低濃度到高濃度分別按列加入綠原酸溶液50 μL,每列加7孔,同列綠原酸濃度相同,第1列作為不加綠原酸的安石榴苷對(duì)照組。各孔中分別加入菌懸液(OD600 nm=0.5)50 μL。將96孔板在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育12 h,采用比濁法進(jìn)行觀測(cè),記錄2種物質(zhì)聯(lián)用時(shí)的MIC。以抗菌藥物部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)作為藥物聯(lián)用效果的判斷依據(jù),計(jì)算公式為:FICI=甲藥聯(lián)合使用MIC/甲藥單獨(dú)使用MIC+乙藥聯(lián)合使用MIC/乙藥單獨(dú)使用MIC

結(jié)果判定:FICI<0.5為協(xié)同作用;0.5≤FICI≤1為相加作用;l2拮抗作用。

1.2.4 安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus生長(zhǎng)曲線的影響 用LB肉湯將菌液稀釋成OD600 nm=0.2,取100 μL菌懸液加入96孔板中;將安石榴苷溶液和綠原酸溶液分別取100 μL添加至含有菌懸液的96孔板中;各孔終濃度分別為1/16 MIC綠原酸、1/4 MIC安石榴苷、1/16 MIC綠原酸+1/4 MIC安石榴苷。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。混勻后于37 ℃培養(yǎng)。分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在600 nm的吸光度值。

1.2.5 安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus膜電勢(shì)的影響 取菌液20 mL離心5 min(13200 r/min、5 ℃),棄上清,然后用生理鹽水洗滌3次,最后用生理鹽水調(diào)至OD600 nm=0.5。取3 mL菌液,分別加入1 μL細(xì)胞膜電勢(shì)熒光探針DiBAC4(5 μmol/L)和不同濃度的安石榴苷和綠原酸溶液(終濃度分別為1/16 MIC綠原酸、1/4 MIC安石榴苷、1/16 MIC綠原酸+1/4 MIC安石榴苷),以加有熒光探針的生理鹽水溶液為對(duì)照,室溫孵育5 min;用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各處理組的熒光強(qiáng)度,其激發(fā)和散發(fā)波長(zhǎng)分別為492、515 nm[14]。

1.2.6 安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)StaphyloccocusaureuspHin的影響 加載熒光探針[14]:取菌液20 mL,離心(13200 r/min、5 ℃)5 min;用HEPES緩沖液(50 mmol/L,pH8,含5 mmol/L EDTA)洗滌2次,用10 mL HEPES懸浮。向懸浮液中加入1.0 mmol/L cFDASE(終濃度為1 μmol/L),并在37 ℃孵育10 min。用磷酸鉀緩沖液(pH7,含10 mmol/L MgCl2)洗滌2次并懸浮。為了除去沒有聚合的cFSE,向懸浮液中加入葡聚糖(終濃度為10 mmol/L),并在37 ℃孵育30 min,離心(13200 r/min、5 ℃)5 min,并用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)洗滌2次并懸浮,放在冰塊上待用。

cFSE的流出[14]:分別取上述的懸浮液1 mL,分別加入安石榴苷和綠原酸溶液(4 mL),終濃度分別為1/16 MIC綠原酸、1/4 MIC安石榴苷、1/16 MIC綠原酸+1/4 MIC安石榴苷。37 ℃培養(yǎng)5 min。取液體200 μL放入黑色酶標(biāo)板,并用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)和散發(fā)波長(zhǎng)分別為490和520 nm)。

校正曲線[14]:分別用NaOH或者HCl將緩沖母液調(diào)至pH分別為4、5、6、7、8、9、10;然后,取載入熒光探針的菌液1 mL并加入3.8 mL的緩沖液體;同時(shí),加入100 μL的纈氨霉素(終濃度為1 μmol/liter)和100 μL尼日利亞菌素(終濃度為1 μmol/liter)平衡胞內(nèi)外pH;然后用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度,其激發(fā)和散發(fā)波長(zhǎng)分別為490、520 nm。

1.2.7 安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus細(xì)胞形態(tài)的影響 采用掃描電鏡法觀察菌體形態(tài)。取菌液20 mL,13200 r/min、5 ℃離心5 min;用生理鹽水洗滌3次,并用生理鹽水調(diào)節(jié)菌體至吸光度OD600 nm=0.5(約為108CFU/mL)。分別取5 mL菌懸液,加入不同濃度的安石榴苷和綠原酸混合溶液,各處理組終濃度分別為1/16 MIC綠原酸、1/4 MIC安石榴苷、1/16 MIC綠原酸+1/4 MIC安石榴苷;37 ℃孵育1 h。將不同處理組的菌液離心(13200 r/min、5 ℃、5 min),棄上清,收集菌體;用2.5% 戊二醛固定菌體;12 h后涂片,并將標(biāo)本置于通風(fēng)櫥內(nèi)自然風(fēng)干;噴金鍍膜,用掃描電鏡觀察不同處理組細(xì)胞的形態(tài),并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示;用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異性分析,p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 安石榴苷和綠原酸對(duì)Staphyloccocus aureus的MIC

通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)安石榴苷與綠原酸對(duì)StaphyloccocusaureusATCC25923均有抑制作用,且二者對(duì)Staphyloccocusaureus的MIC分別為250 μg/mL與2.5 mg/mL,與文獻(xiàn)一致[11-12]。

2.2 安石榴苷和綠原酸對(duì)Staphyloccocus aureus的協(xié)同抑制作用

由表1可知,安石榴苷在亞抑制濃度下,隨著安石榴苷濃度的增加,綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus的MIC快速降低;當(dāng)安石榴苷濃度為62.5 μg/mL(1/4 MIC)時(shí),綠原酸的MIC協(xié)減小到其單獨(dú)作用時(shí)的1/16。綠原酸在亞抑濃度下,隨著綠原酸濃度的增加,安石榴苷對(duì)Staphyloccocusaureus的MIC快速降低,當(dāng)綠原酸濃度為0.625 mg/mL(1/4MIC)時(shí),安石榴苷的MIC協(xié)減小到其單獨(dú)作用時(shí)的1/8?？梢?安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用時(shí)的抗菌活性要強(qiáng)于它們單獨(dú)作用時(shí)的抗菌活性。FICI的最小值為0.3125,進(jìn)一步表明安石榴苷和綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus存在強(qiáng)烈的協(xié)同抑菌作用。安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus的MIC協(xié)為:安石榴苷62.5 μg/mL、綠原酸0.1563 mg/mL。

表1 安石榴苷和綠原酸對(duì)Staphyloccocus aureus的協(xié)同抑制作用

2.3 安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocus aureus生長(zhǎng)曲線的影響

由圖1可知,與對(duì)照組相比,安石榴苷和綠原酸在MIC協(xié)濃度下能夠完全抑制Staphyloccocusaureus的生長(zhǎng);1/4 MIC安石榴苷或1/16 MIC綠原酸單獨(dú)作用時(shí),Staphyloccocusaureus的生長(zhǎng)曲線受到抑制。

圖1 安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocus aureus生長(zhǎng)曲線的影響

2.4 安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocus aureus細(xì)胞膜完整性的影響

2.4.1 膜電勢(shì) 由圖2可知,對(duì)照組的相對(duì)熒光強(qiáng)度為-5237;安石榴苷和綠原酸分別作用后,相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為-3895和-1776.3,分別與對(duì)照組有極顯著差異(p<0.01);安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后,相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為-2783,與對(duì)照有極顯著差異(p<0.01);與對(duì)照相比,安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用組的熒光強(qiáng)度是增加的。說(shuō)明,安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后,Staphyloccocusaureus細(xì)胞膜發(fā)生去極化現(xiàn)象。

圖2 安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocus aureus膜電勢(shì)的影響

2.4.2 pHin-pHout由圖3可知,對(duì)照組胞內(nèi)外pH差(pHin-pHout)為0.914,安石榴苷和綠原酸分別處理及聯(lián)合作用后,Staphyloccocusaureus胞內(nèi)外pH差分別為0.717、-0.012和-0.199;安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后Staphyloccocusaureus胞內(nèi)外pH差變化最大,與對(duì)照組有極顯著差異(p<0.01)。說(shuō)明安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用能夠改變Staphyloccocusaureus正常生長(zhǎng)的內(nèi)環(huán)境。

圖3 安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocus aureus胞內(nèi)外pH差的影響

2.4.3 安石榴苷和綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus形態(tài)的影響 由圖4可知,對(duì)照組Staphyloccocusaureus的菌體呈球狀,形態(tài)完整,胞體飽滿;安石榴苷作用后,Staphyloccocusaureus菌體出現(xiàn)縊縮,表面出現(xiàn)褶痕,菌體細(xì)胞變形;綠原酸作用后,Staphyloccocusaureus菌體出現(xiàn)皺縮、凹陷,菌體表面變化明顯;安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后,菌體破碎,膜破裂,菌體形態(tài)變化最為嚴(yán)重。說(shuō)明安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后,菌體細(xì)胞膜的通透性的改變最大,對(duì)Staphyloccocusaureus的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

圖4 安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocus aureus形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

目前,食品中常用化學(xué)防腐劑來(lái)抑制微生物的生長(zhǎng),從而延長(zhǎng)食品的貨架期。隨著對(duì)化學(xué)合成防腐劑安全性的質(zhì)疑以及人們對(duì)食品添加劑有天然、營(yíng)養(yǎng)和多功能的要求,天然食品防腐劑越來(lái)越受到人們的關(guān)注。因此,從植物中提取抑菌活性物質(zhì)并制成食品防腐劑成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。安石榴苷和綠原酸是植物的次生代謝產(chǎn)物,具有多種生理活性。本文研究了安石榴苷和綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus的協(xié)同抑制作用及其對(duì)菌體細(xì)胞膜的影響,結(jié)果為安石榴苷和綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus的抑制具有協(xié)同作用;聯(lián)合作用后,菌體細(xì)胞膜發(fā)生去極化現(xiàn)象,胞內(nèi)外pH差發(fā)生變化,細(xì)胞正常生長(zhǎng)的內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化;另外,聯(lián)合作用后,Staphyloccocusaureus菌體表面破損、內(nèi)容物溶出,導(dǎo)致菌體死亡。

不同的植物提取物能通過(guò)多種途徑發(fā)揮其抑菌的功效。許多植物源性的天然抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜有破壞作用,細(xì)胞膜的通透性改變能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外流,從而胞外離子如鉀離子及一些酶類等含量升高;同時(shí)膜完整性的改變可能引起膜電勢(shì)及胞內(nèi)外pH差改變及DNA、RNA等紫外吸收物質(zhì)的滲出;膜改變也能引起能量代謝的變化,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外 ATP 的含量發(fā)生變化;抗菌物質(zhì)還可以通過(guò)影響某些重要蛋白質(zhì)的合成從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15-18]。除抑制細(xì)菌自身細(xì)胞的生長(zhǎng)外,植物源的天然抗菌物質(zhì)還被發(fā)現(xiàn)能抑制細(xì)菌毒素的分泌從而降低細(xì)菌的致病性。本文研究了安石榴苷協(xié)同綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus細(xì)胞膜的影響。聯(lián)合作用下,Staphyloccocusaureus細(xì)胞膜電勢(shì)發(fā)生去極化現(xiàn)象,與綠原酸使Staphyloccocusaureus細(xì)胞膜電勢(shì)發(fā)生超極化現(xiàn)象[12]結(jié)論不一致,這可能與綠原酸/安石榴苷的作用濃度及協(xié)同抑制時(shí)作用靶點(diǎn)有關(guān);但是,去極化和超極化都反映出細(xì)菌細(xì)胞膜遭到了破壞。pHin對(duì)于細(xì)菌胞內(nèi)DNA的轉(zhuǎn)錄與合成、酶活及蛋白合成等非常重要。不同的細(xì)菌,其胞內(nèi)pHin值不同,其范圍為5.6～9.0[20];一旦胞內(nèi)pHin值改變,就暗示出細(xì)菌胞內(nèi)某個(gè)器官發(fā)生了改變[21]。另外,pHin還控制著細(xì)胞膜,pHin發(fā)生變化意味著細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了改變[21]。本研究證實(shí)安石榴苷協(xié)同綠原酸引起StaphyloccocusaureuspHin降低。表明安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用于Staphyloccocusaureus細(xì)胞膜,使胞內(nèi)外正常的pH發(fā)生變化。

4 結(jié)論

安石榴苷和綠原酸對(duì)Staphyloccocusaureus具有協(xié)同抑制作用,其MIC協(xié)為安石榴苷62.5 μg/mL、綠原酸0.1563 mg/mL。

安石榴苷和綠原酸聯(lián)合作用后,Staphyloccocusaureus細(xì)胞膜發(fā)生去極化現(xiàn)象,胞內(nèi)外pH差發(fā)生改變;Staphyloccocusaureus菌體表面破損、內(nèi)容物溶出,導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡。

[1]張冠楠. 茴香醛抗金黃色葡萄球菌的活性及機(jī)制研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2016.

[2]王璇,王娉,葛毅強(qiáng),等. 食品中金黃色葡萄球菌致病性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2017,33(6):553-558.

[3]張偉松. 食源性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥性及生物膜形成能力的研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2014.

[4]Aqil F,Munagala R,Vadhanam MV,et al. Anti-proliferative activity and protection against oxidative DNA damage by punicalagin isolated from pomegranate husk[J]. Food Research International,2012,49(1):345-353.

[5]Adaramoye O,Erguen B,Nitzsche B,et al. Punicalagin,a polyphenol from pomegranate fruit,induces growth inhibition and apoptosis in human PC-3 and LNCaP cells[J]. Chemico-Biological Interactions,2017,274:100-106.

[6]Sun YQ,Tao X,Men XM,et al.Invitroandinvivoantioxidant activities of three major polyphenolic compounds in pomegranate peel:Ellagic acid,punicalin,and punicalagin[J]. Journal of Integrative Agriculture,2017,16(0):1-7.

[7]Lin CC,Hsu YF,Lin TC,et al. Antioxidant and hepatoprotective effects of punicalagin and punicalin on acetaminophen-induced liver damage in rats[J]. Phytother Res,2001,15(3):206-212.

[8]Sung WS,Lee DG,Bai FW,et al. Antifungal action of chlorogenic acid against pathogenic fungi,mediated by membrane disruption[J]. Pure and Applied Chemistry,2013,82(1):219-226.

[9]王文龍,文超越,郭秋平,等. 綠原酸的生物活性及其作用機(jī)制[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2017,29(7):2220-2227.

[10]嚴(yán)永旺,肖蘭,周旭,等. 綠原酸的藥理作用及藥用研發(fā)對(duì)策[J]. 中國(guó)藥房,2017,28(19):2729-2732.

[11]徐云鳳,李光輝,封雨晴,等. 安石榴苷的純化及對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(22):110-113.

[12]Li GH,Wang X,Xu YF,et al. Antimicrobial effect and mode of action of chlorogenic acid onStaphylococcusaureus[J]. European Food Research & Technology,2014,238(4):589-596.

[13]劉喚明,張文滔,吳燕燕,等. 脂肽和茶多酚對(duì)副溶血弧菌的協(xié)同抑菌效應(yīng)和機(jī)理[J]. 食品科學(xué),2017,38(13):14-19.

[14]Li GH,Xu YF,Wang X,et al. Tannin-rich fraction from pomegranate rind damages membrane ofListeriamonocytogenes[J]. Foodborne Pathogens & Disease,2014,11(4):313-319.

[15]楊英鐸,陸大洪,楊冬梅,等. 香樟精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性及抑菌機(jī)理研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥,2017,19(3):372-376.

[16]劉旺景,敖長(zhǎng)金,薩茹麗,等. 植物提取物抑菌活性及作用機(jī)理[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,28(8):2344-2352.

[17]張赟彬,劉笑宇,姜萍萍,等. 肉桂醛對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用及抑菌機(jī)理研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2015,31(5):31-35,11.

[18]董璐,代增英,韓晴,等. 茶多酚對(duì)大腸桿菌抑菌機(jī)理的研究[J]. 生物學(xué)雜志,2015,32(1):72-75.

[19]Li GH,Qiao MY,Guo Y,et al. Effect of subinhibitory concentrations of chlorogenic acid on reducing the virulence factor production byStaphylococcusaureus[J]. Foodborne Pathogens & Disease,2014,11(9):677.

[20]Breeuwer P,Drocourt J,Rombouts FM,et al. A novel method for continuous determination of the intracellular pH in bacteria with the internally conjugated fluorescent probe 5(and 6-)-carboxyfluorescein succinimidyl ester[J]. Applied and Environmental Microbiology,1996,62(1):178-183.

[21]Turgis M,Han J,Caillet S,et al. Antimicrobial activity of mustard essential oil againstEscherichiacoliO157∶H7 andSalmonellatyphi[J]. Food Control,2009,20(12):1073-1079.