轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在牧草抗逆基因挖掘方面的應(yīng)用前景

朱 昊 ，張 博 ，張薈薈 ，王玉祥 ，柯 梅 ，李學(xué)森 *

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院草業(yè)研究所，烏魯木齊 830011）

我國(guó)的牧草種質(zhì)資源極為豐富，目前的研究主要集中在以全球變化與農(nóng)業(yè)多樣性、農(nóng)業(yè)系統(tǒng)固碳減排、草地農(nóng)業(yè)決策系統(tǒng)及林草生態(tài)等宏觀(guān)方面[1]；同時(shí)以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的微觀(guān)方面也有許多研究，主要包括DNA水平上的遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面[2-3]。利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行牧草種質(zhì)資源創(chuàng)新及抗逆基因挖掘方面的研究相對(duì)較少[4]。

1 RNA-seq技術(shù)原理

RNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)?？死锟耍‵rancis Harry Compton Crick,1916-2004）于1958年提出“中心法則”，并于1970年在Nature上的一篇文章中進(jìn)行了重申。中心法則指出遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程。依據(jù)中心法則，隨著二代測(cè)序技術(shù)的興起和成熟，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究得到了蓬勃發(fā)展。簡(jiǎn)而言之，轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）就是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況，是一門(mén)在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）廣義上指某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA及Non-coding RNA；狹義上指所有mRNA的集合。 RNA-seq，就是把mRNA、small RNA及Noncoding RNA等或者其中一些用高通量測(cè)序技術(shù)把它們的序列測(cè)出來(lái)。反映出它們的表達(dá)水平。不管物種有無(wú)基因序列信息，該技術(shù)都能夠全面檢測(cè)其所有基因的表達(dá)，具有通量高、成本低、定量準(zhǔn)、靈敏度高、重復(fù)性好以及檢測(cè)范圍廣等特點(diǎn)。

2 RNA-seq一般流程

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析技術(shù)的流程如下（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及后續(xù)生物信息學(xué)分析流程圖

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序需要注意的事項(xiàng)：（1）取樣，每個(gè)處理至少得有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，這個(gè)對(duì)于無(wú)參考基因組序列更為重要；（2）RNA的抽提檢測(cè)，理想的RNA樣品是試驗(yàn)取得成功的一切的前提；（3）測(cè)序得到Uigene序列后的生物信息學(xué)分析是關(guān)鍵，結(jié)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘。

3 植物應(yīng)答環(huán)境脅迫方面的RNA-seq研究

植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答是通過(guò)細(xì)胞分子水平修飾、自身的生理生化改變來(lái)順應(yīng)不利的生存環(huán)境?；虮磉_(dá)具有時(shí)空性，抗逆基因的表達(dá)尤其明顯。對(duì)植物的不同組織器官、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、不同環(huán)境脅迫因子響應(yīng)時(shí)的差異表達(dá)的基因進(jìn)行分析篩選，挖掘關(guān)鍵基因和抗性之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，將有助于從轉(zhuǎn)錄水平上了解脅迫因子的傷害機(jī)理及植物適應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制。

3.1 溫度脅迫

溫度是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中十分重要的環(huán)境影響因子。溫度脅迫引起植物生理上的變化主要體現(xiàn)在光合作用、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)等方面。吳月燕等［5］以杜鵑為研究材料，人工模擬低溫脅迫，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以探索杜鵑抗寒的分子機(jī)制。從頭測(cè)序組裝得到Unigenes序列122 654個(gè)，有大量的Unigenes注釋到同源數(shù)據(jù)庫(kù)中，部分Unigenes未得到數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋信息，這可能是杜鵑的特有的基因序列。其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，差異表達(dá)的基因共有10 829個(gè)，這些差異基因?yàn)榻沂径霹N抗寒機(jī)理，提供了大量可靠的轉(zhuǎn)錄組水平的基本研究數(shù)據(jù)，還有待后續(xù)研究的進(jìn)一步挖掘分析。顏朗等［6］通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，初步揭示了低溫處理下皇竹草的抗寒分子機(jī)制。篩選出冬夏兩季皇竹草差異表達(dá)基因11 443個(gè)，挖掘到在冬季低溫條件下高度表達(dá)的耐寒基因112個(gè)，且17個(gè)耐寒基因在冬季低溫材料中特意表達(dá)。韓超等［7］研究了梭梭對(duì)高溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)情況，分析了差異表達(dá)基因的功能和蛋白代謝通路，結(jié)果表明，梭梭的同化枝在應(yīng)答高溫單一環(huán)境因子脅迫時(shí)，多個(gè)基因、多個(gè)生物過(guò)程協(xié)同調(diào)控。因此，溫度這個(gè)單一的環(huán)境因子變化引起梭梭啟動(dòng)多基因表達(dá)系統(tǒng)來(lái)應(yīng)答。

3.2 干旱脅迫

水是生命之源。在干旱脅迫下，植物體通過(guò)改變自身組織器官的生理生化狀態(tài)來(lái)適應(yīng)不利的生存環(huán)境[8]。植物對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制通常是通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、以不同代謝通路上的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯來(lái)調(diào)控應(yīng)答。周炎等[9]分析了烤煙品系LY1360在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組，通過(guò)GO和KEGG分析比較干旱脅迫下供試材料的基因和代謝通路差異，結(jié)果表明激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因在干旱脅迫下表達(dá)量均顯著上調(diào)。張春榮等[10]對(duì)干旱脅迫下的甘草根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)適度干旱促進(jìn)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)和甘草根有效成分積累。GO富集分析顯示天冬酰胺酰內(nèi)肽酶、β-木糖苷酶、GDP-L-巖藻糖合酶基因下調(diào)并顯著富集，這表明干旱脅迫可能抑制干草根初生壁的降解與程序性細(xì)胞死亡。孫愛(ài)清等［11］對(duì)花生干旱處理前后轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜變化進(jìn)行了分析比較，篩選出935個(gè)差異表達(dá)基因，其中323個(gè)基因涉及次生代謝、大分子代謝、能量代謝等代謝途徑。在干旱脅迫條件下參與類(lèi)黃酮代謝途徑的9個(gè)基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，推斷花生在干旱脅迫下類(lèi)黃酮對(duì)抵御干旱起到十分重要的作用。

3.3 鹽脅迫

鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的威脅是干旱之外的第二大環(huán)境因子脅迫。有關(guān)農(nóng)作物及鹽生植物對(duì)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組研究相對(duì)比較深入，現(xiàn)已鑒定出部分相關(guān)耐鹽基因，涉及到多個(gè)代謝途徑。吉福桑等［12］研究了巴西蕉葉片在中性單鹽NaCl脅迫下的轉(zhuǎn)錄組情況，結(jié)果表明脅迫12 h差異基因的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)數(shù)均高于脅迫24 h。KEGG分析表明差異基因主要涉及類(lèi)酮類(lèi)和丙酮素生物合成途徑以及光合作用等代謝通徑。qRT-PCR驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠可信，為香蕉耐鹽機(jī)理分析提供了科學(xué)參考依據(jù)。彭振等［13］以耐鹽和敏鹽的陸地棉為研究材料，分別研究2個(gè)材料在NaCl鹽脅迫下幼苗葉片的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。通過(guò)差異基因篩選，鑒定出26個(gè)與耐鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族，高表達(dá)的11個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因與陸地棉的耐鹽密切相關(guān)。張麗麗［14］以荒漠鹽堿地常見(jiàn)的鹽生植物鹽穗木為研究材料，分別對(duì)在低鹽和高鹽下脅迫3 h的同化枝進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。篩選出高鹽和低鹽脅迫下共差異基因1 254個(gè)，有關(guān)滲透調(diào)節(jié)和活性氧清除的基因大多表現(xiàn)為上調(diào)基因，說(shuō)明鹽穗木在短期鹽脅迫下以增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)和活性氧清除為應(yīng)答策略。

4 RNA-seq在牧草抗逆基因挖掘中的研究現(xiàn)狀

張純（2017）[15]梳理了許多植物在逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答的研究報(bào)告，發(fā)現(xiàn)主要集中在水稻、棉花、玉米、大豆、馬鈴薯、丹參、黃瓜、牡丹等這些作物和藥用植物及花卉植物方面；有關(guān)牧草植物的研究相對(duì)少，僅見(jiàn)星星草、高羊茅及紫羊茅等物種。郭云（2016）[16]基于RNA-seq技術(shù)研究了苜蓿根蘗性狀發(fā)生的下調(diào)基因情況。齊曉（2017）[17]對(duì)低溫脅迫下苜蓿轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和表達(dá)進(jìn)行了分析。Zhipeng Liu（2013）[18]在國(guó)外報(bào)到了同源四倍體紫花苜蓿“金皇后”從種子萌發(fā)到開(kāi)花生長(zhǎng)發(fā)育的階段的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況，基于此轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了紫花苜蓿的EST-SSR分子標(biāo)記引物。此外，冷暖（2017）[19]研究報(bào)到了草地早熟禾在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答。通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知，目前國(guó)內(nèi)有關(guān)牧草的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究相對(duì)滯后，即使作為牧草之王的紫花苜蓿在轉(zhuǎn)錄組方面的研究也很少。

5 展 望

牧草種質(zhì)資源的挖掘大多集中于優(yōu)良抗性種質(zhì)篩選方面，相對(duì)作物來(lái)講，有關(guān)基因資源分子水平的研究起步晚、研究相對(duì)比較淺，有關(guān)抗性基因的分析很少。隨著二代測(cè)序成本的進(jìn)一步下降及三代測(cè)序的興起，通過(guò)RNA-seq技術(shù)在牧草優(yōu)良種質(zhì)資源基因挖掘方面的應(yīng)用前景十分廣闊。

此外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以結(jié)合代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)一起來(lái)研究，多組學(xué)的關(guān)聯(lián)可為牧草種質(zhì)資源挖掘和優(yōu)良基因克隆及抗逆機(jī)制等方面提供分子水平研究的大數(shù)據(jù)平臺(tái)。

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