載液組成對于卵白蛋白在非對稱流場流分離通道中膜吸附和聚集行為的影響
2018-05-28 07:36:58梁啟慧韓南銀
色譜 2018年5期
梁啟慧, 楊 奕, 邵 兵, 高 也, 宋 宇, 韓南銀*
(1, 北京大學(xué)藥學(xué)院, 北京 100191; 2, 北京疾病預(yù)防控制中心, 北京 100013)
非對稱場流分離技術(shù)(asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4)是目前可信賴的納米顆粒分離和表征方法,尤其適合表征多分散的顆粒尺寸分布,且條件溫和無損[1]。AF4和多種檢測器聯(lián)用,例如多角度激光散射檢測器、紫外/可見分光光度計(jì)、熒光檢測器等,可以在線監(jiān)測物質(zhì)尺寸和濃度信息。
圖 1 AF4儀器通道中分離過程示意圖Fig. 1 Schematic of the asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) channel showing processes during analysis
AF4技術(shù)全過程最重要的一步是分析物在通道中的分離。分離在一個(gè)薄的領(lǐng)帶形的通道中進(jìn)行,見圖1。進(jìn)入通道的載液流分成兩部分,一部分沿著通道自入口向出口方向移動(dòng)(inflow),另一部分垂直于主體載液的液流,叫作交叉流(cross flow)。交叉流穿過通道底部一定截留分子量的可滲透超濾膜,并產(chǎn)生力場使分析物向膜方向移動(dòng)[2,3]。在非對稱流場流分離系統(tǒng)中,松弛過程也叫作聚焦-松弛(focusing-relaxation)過程,從入口處和出口處進(jìn)入通道的載液會(huì)在通道入口附近進(jìn)行聚焦-松弛,這一位置也叫作聚焦點(diǎn)(focusing point),在此期間,樣品停止遷移;樣品受到擴(kuò)散作用(diffusion effect)和交叉流流場兩種作用力影響并在通道橫截面上某個(gè)位置達(dá)到平衡。顆粒距離積累壁的距離取決于顆粒的擴(kuò)散系數(shù)和自身的尺寸大小。尺寸較大的顆粒,擴(kuò)散系數(shù)較小,距離積累壁的距離較近,保留時(shí)間較長。
在AF4的應(yīng)用過程中,經(jīng)常遇到的問題是被分析蛋白質(zhì)的膜吸附和聚集作用。膜吸附作用使蛋白質(zhì)在通道中產(chǎn)生質(zhì)量損失,浪費(fèi)了珍貴的樣品,不利于定量。蛋白質(zhì)的聚集作用使不同蛋白質(zhì)之間的分離變得困難,不利于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地研究了不同pH、陰離子和陽離子的載液組成對目標(biāo)蛋白質(zhì)卵白蛋白在AF4分離過程中膜吸附和聚集行為的影響;分析蛋白質(zhì)在不同溶液環(huán)境下表面電荷、尺寸大小等因素的改變,比較不同載液條件下蛋白質(zhì)的行為。希望通過本實(shí)驗(yàn)可以找到AF4分析蛋白質(zhì)的最佳載液組成條件,最大限度地減少膜吸附和聚集行為,避免蛋白質(zhì)在通道中的損失。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器與試劑
非對稱流場流分離儀購自美國懷亞特(Wyatt)公司,型號為Eclipse AF4,和安捷倫1200系列四元泵、脫氣裝置和自動(dòng)進(jìn)樣器連接,在線聯(lián)用Agilent 1200 UV/Vis檢測器(美國安捷倫公司)。Zetasizer Nano儀器來自英國馬爾文公司,超純水系統(tǒng)來自美國Millipore公司。
卵白蛋白凍干粉購自德國Sigma-Aldrich公司,除非特別說明,蛋白質(zhì)樣品均溶解于超純水(18.2 MΩ5cm)中。NaCl、MgCl2、KCl、Na2HPO4512H2O、NaH2PO452H2O、HCl、NaOH、磷酸均為分析純,來自于美國Fisher Scientific公司。100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PB)的制備方法為:約29 g Na2HPO4512H2O和3 g NaH2PO452H2O溶解于1 L超純水中,用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.4,經(jīng)0.2 μm濾膜過濾備用。不同種類和濃度的鹽中加入10 mmol/L磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度,按照相應(yīng)配方使用超純水配制后,經(jīng)0.2 μm濾膜過濾備用。
1.2 實(shí)驗(yàn)條件
1.2.1AF4條件
AF4實(shí)驗(yàn)中設(shè)定紫外檢測器檢測波長為215 nm。通道的幾何參數(shù)為:長度153 mm,最大寬度為22 mm;使用350 μm墊片作為通道厚度,截止分子質(zhì)量30 kD再生纖維素膜作為積累壁膜。所有的樣品,除非特別指明,均使用表1的流速條件進(jìn)行洗脫。
表 1 AF4實(shí)驗(yàn)的洗脫條件
所有載液在使用前經(jīng)過0.2 μm膜過濾,當(dāng)天配制。載液組成變化如表2所示。選用10 mmol/L磷酸緩沖液作為空白對照,加入不同種類和濃度的鹽,考察載液組成的影響。在進(jìn)樣前,載液先沖洗、平衡通道至少30 min,確保通道的潔凈和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。儀器操作和數(shù)據(jù)處理均使用安捷倫Openlab軟件。
表 2 AF4中使用的不同載液(CF)組成
PB: phosphate buffer.
樣品溶液的進(jìn)樣量為20 μL,卵白蛋白水溶液的質(zhì)量濃度均為2 mg/mL,新鮮配制使用,并在4 ℃保存。
1.2.2zeta電位和水合半徑的測定
卵白蛋白凍干粉溶解于相應(yīng)的緩沖液中,質(zhì)量濃度為2 mg/mL。每次測定結(jié)果都是50次重復(fù)測試的平均值。
1.2.3吸附行為表征——相對回收率(RR)
樣品與通道中膜的相互作用使樣品保留在通道膜上,造成質(zhì)量損失。為了研究AF4分離過程中蛋白質(zhì)的膜吸附現(xiàn)象,改變載液的組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著膜使用時(shí)間的延長,膜老化加劇,相應(yīng)的樣品回收率逐漸下降。所以日間結(jié)果之間直接比較是不科學(xué)的。因此,每天先以10 mmol/L磷酸鹽緩沖液為載液進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn),紫外信號的峰面積定義為A*。同一天時(shí)間內(nèi),蛋白質(zhì)在其余的載液條件下進(jìn)樣,所得到的峰面積為A。以兩者的百分比計(jì)算相對回收率:
RR=A/A*×100%
(1)
其中,峰面積A、A*為3次連續(xù)進(jìn)樣所得峰面積的平均值。相對回收率避免了由于膜老化造成的日間回收率差異。
1.2.4聚集行為表征——多聚體占比(P)
如圖2所示,在高離子強(qiáng)度的條件下,紫外圖譜中雙峰的特征更加明顯。多聚體所占的比值由多聚體的峰面積占總峰面積的比值表示:
(2)
其中P1是單體峰面積,P2是聚合物峰面積。
圖 2 不同濃度磷酸鹽緩沖液時(shí)的卵白蛋白AF4-UV流出圖Fig. 2 AF4-UV fractograms of ovalbumin with various concentrations of phosphate buffer
2 結(jié)果與討論
2.1 不同載液條件對卵白蛋白吸附和聚集行為的影響
2.1.1pH的影響
因?yàn)樯锏鞍踪|(zhì)的生理最佳pH條件為7.4,為了保持蛋白質(zhì)的活性,在總離子濃度為10 mmol/L的PB中,于pH 7.4左右小范圍內(nèi)取兩個(gè)pH值6.2和8.2,研究pH對卵白蛋白AF4通道中行為的影響(見圖3)。在3種pH條件下,AF4的流出圖中蛋白質(zhì)的保留時(shí)間沒有明顯變化,說明卵白蛋白的尺寸和分子大小在3種pH條件下沒有太大改變。從相對回收率來看,載液pH為6.2時(shí)的卵白蛋白相對回收率明顯低于pH為7.4和8.2時(shí)的相對回收率。3種條件下均有聚集行為發(fā)生,多聚物占總蛋白質(zhì)的比例都高于35%。其中,pH 6.2時(shí),多聚物比例最高,接近45%。通過動(dòng)態(tài)光散射檢測到3種pH下蛋白質(zhì)的zeta電位都在-5 mV左右,zeta電位隨pH變化不大。
圖 3 不同載液pH時(shí)卵白蛋白的(a)相對回收率和多聚物比例及(b)zeta電位(n=3)Fig. 3 (a) Relative recovery (RR), aggregate proportion (P), and (b) the zeta potential plot of ovalbumin with various pH (n=3)
2.1.2陰離子類型和濃度的影響
圖 4 不同濃度的磷酸鹽緩沖液時(shí)卵白蛋白的(a)相對回收率和多聚物比例及(b)zeta電位(n=3)Fig. 4 (a) Relative recovery, aggregate proportion, and (b) the zeta potential plot of ovalbumin with various concentrations of phosphate buffer (n=3)
不同濃度的PB對通道中蛋白質(zhì)行為的影響見圖4。10、20、50 mmol/L的PB中離子強(qiáng)度依次升高,得到的蛋白質(zhì)RR依次降低,其中從10到20 mmol/L下降幅度最大,從100%直接降至約50%。計(jì)算得到的P與磷酸根離子強(qiáng)度成正比關(guān)系,從折線圖斜率來看,與相對回收率結(jié)果相似,濃度從10到20 mmol/L的增加導(dǎo)致多聚物占比大幅度增高。zeta電位絕對值的減小和離子強(qiáng)度的增加呈近似線性關(guān)系。
Cl-及其濃度對卵白蛋白行為的影響見圖5。NaCl濃度從0上升到10 mmol/L的過程中,卵白蛋白的RR和P的絕對值變化最大;而從50到100 mmol/L過程里,RR和P值幾乎不變。由動(dòng)態(tài)光散射測得不同濃度下的卵白蛋白zeta電位均在-6 mV左右,變化不大(變化幅度小于4 mV),電位絕對值整體呈下降趨勢。
圖 5 不同濃度的NaCl時(shí)卵白蛋白的(a)相對回收率、多聚物比例及(b)zeta電位(n=3)Fig. 5 (a) Relative recovery, aggregate proportion,and (b) the zeta potential plot of ovalbumin with various concentrations of NaCl (n=3)
圖 6 不同濃度的磷酸根和Cl-時(shí)卵白蛋白的(a)相對回收率、(b)多聚物比例及(c)zeta電位(n=3)Fig. 6 (a) Relative recovery, (b) aggregate proportion,(c) the zeta potential plot of ovalbumin with various phosphate and chloride concentrations (n=3)
圖 7 Na+、K+濃度不同時(shí)卵白蛋白的(a)相對回收率、(b)多聚物比例及(c)zeta電位(n=3)Fig. 7 (a) Relative recovery, (b) aggregates proportion,(c) the zeta potential plot of ovalbumin with various Na+ and K+ concentrations (n=3)
2.1.3陽離子類型和濃度的影響
10 mmol/L的PB中加入一價(jià)的Na+、K+,濃度分別為1、5、10 mmol/L,調(diào)節(jié)pH到7.4。由圖7中看出,RR的總體趨勢為:K+
2.2 蛋白質(zhì)在通道中的膜吸附行為
在非對稱流場流分離中,垂直于通道方向的交叉流把蛋白質(zhì)帶到靠近再生纖維素(regenerated cellulose, RC)膜的積累壁區(qū)域。蛋白質(zhì)分子的布朗運(yùn)動(dòng)引發(fā)顆粒之間和顆粒、膜之間的碰撞反應(yīng),增加了蛋白質(zhì)吸附在膜上的可能性[5]。
蛋白質(zhì)和膜的相互作用主要受到兩種力的影響:范德華力和靜電作用[6]。范德華力FvdW與R3/l2(2R+l)2呈正比,其中R是顆粒的半徑,l是顆粒表面到膜的距離[7]。依據(jù)文獻(xiàn)[8], RC膜因?yàn)轸然拇嬖?其pKa約為3.5。卵白蛋白的pI值為5.19,Mw為42 881。所以在本研究中使用載液pH 6.2、7.4、8.2的條件下,再生纖維素膜和卵白蛋白都帶負(fù)電,兩者之間存在著靜電排斥力Fel[9]:
(3)
其中k是波爾茲曼常數(shù),R和l與范德華力公式中的意義相同,T為溫度,ρ是介質(zhì)的密度,zi為離子價(jià)態(tài),e為單個(gè)電子的電位,δ為雙電子層的厚度,ζ為物質(zhì)的zeta電位。
pH的大小對膜表面zeta電位也有著重要影響,pH為6.8時(shí),膜的zeta電位最低[7],膜與物質(zhì)之間的排斥力變小,更易吸附,RR最低。
金屬陽離子的價(jià)態(tài)和形態(tài)大小影響蛋白質(zhì)分子的zeta電位和雙電子層的厚度,從而影響蛋白質(zhì)和膜之間的相互作用。一價(jià)陽離子Na+、K+的載液中,蛋白質(zhì)分子的zeta電位變化不大,蛋白質(zhì)吸附作用在K+載液條件下更明顯。在溶液中,金屬陽離子的水合半徑應(yīng)該Na+>K+,水合陽離子導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面雙電子層的Stern層厚度增加,結(jié)合公式(3),Fel增大,排斥力增大;同時(shí)增加的分子外圍電子層厚度使蛋白質(zhì)相對遠(yuǎn)離積累壁表面,范德華吸引力減少,因此吸附現(xiàn)象減弱。二價(jià)陽離子Mg2+條件下,更高的化學(xué)價(jià)對分子的擴(kuò)散雙電層產(chǎn)生更大的壓迫力。另外,Mg2+溶液引起的蛋白質(zhì)分子表面zeta電位的下降明顯[11],因此Fel變大,蛋白質(zhì)和膜的吸附作用增強(qiáng);此外,從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來看,Mg2+與蛋白質(zhì)中的羧基易結(jié)合形成沉淀,導(dǎo)致膜吸附加劇。
蛋白質(zhì)在溶液中的吸附行為是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程,取決于蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)硬性、穩(wěn)定性等諸多因素。所以,下一步應(yīng)該對蛋白質(zhì)在不同條件下的三維空間結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性進(jìn)行測試研究,對吸附行為進(jìn)行更深入的解釋。
2.3 蛋白質(zhì)在通道中的聚集行為
溶液對蛋白質(zhì)聚集行為的影響較一般納米顆粒更加復(fù)雜,涉及蛋白質(zhì)的分子大小、構(gòu)象、穩(wěn)定性和功能等各個(gè)方面[12,13]。如2.1節(jié)所述,在實(shí)驗(yàn)中的載液條件下,所有蛋白質(zhì)表面攜帶負(fù)電荷。由動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering, DLS)測量結(jié)果顯示,所有條件下,蛋白質(zhì)的zeta電位均大于-30 mV,理論上溶液體系不穩(wěn)定,易形成聚集體。當(dāng)離子強(qiáng)度增加時(shí),蛋白質(zhì)表面絕對zeta電位降低,蛋白質(zhì)之間的靜電排斥力減少,傾向于形成聚集物。由DLS測得在1、5、10、50、100 mmol/L NaCl條件下,卵白蛋白的蛋白質(zhì)樣品分布系數(shù)(polydispersity index, PDI)從0.658增加到0.849,證明樣品在高離子強(qiáng)度下有著更廣的聚集物尺寸分布,對應(yīng)的AF4流出圖里的峰更寬。必須指出的是,在動(dòng)態(tài)光散射中蛋白質(zhì)的聚集度檢測環(huán)境和AF4通道中溶液環(huán)境相比要溫和許多;在一次典型的AF4洗脫過程中,分析物的濃度會(huì)經(jīng)歷大幅度的改變,最終出口端濃度稀釋了2至4倍[14],在場流分離過程中分析物還會(huì)受到載液流剪切力的影響,因此動(dòng)態(tài)光散射得到的PDI的結(jié)果還不能完全反映AF4過程中蛋白質(zhì)的聚集行為,但可以提供一個(gè)參考的變化趨勢。
鹽離子與蛋白質(zhì)中的帶電氨基酸的特殊作用是導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的原因之一。例如,有文獻(xiàn)[15]報(bào)道二價(jià)金屬離子Ca2+可以與卵白蛋白的特異位點(diǎn)結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)中,含Mg2+溶液條件下得到的P(接近70%)高于含10 mmol/L Na+、K+載液條件下的P。在蛋白質(zhì)聚集行為研究中,二價(jià)Mg2+對蛋白質(zhì)的聚集有顯著的影響,為了得到均一單體的卵白蛋白,需要避免二價(jià)離子的加入;當(dāng)希望研究兩個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)在AF4中的結(jié)合行為時(shí),二價(jià)Mg2+創(chuàng)造了極佳的溶液環(huán)境。
3 結(jié)論
蛋白質(zhì)在非對稱流場流分離系統(tǒng)中的膜吸附和聚集行為極大地限制了AF4的應(yīng)用和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)以卵白蛋白作為特征分析物,研究了不同載液條件對AF4分離過程中蛋白質(zhì)的膜吸附和聚集行為的影響;引入RR和P作為分析參數(shù),研究如何避免場流分離中不必要的蛋白質(zhì)樣品損失。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,載液的離子強(qiáng)度對卵白蛋白的吸附和聚集行為影響最大;載液的pH主要通過改變再生纖維素膜表面的zeta電位來影響膜與分子之間的靜電排斥力;二價(jià)陽離子Mg2+由于自身的金屬離子特性,極大地提高了聚集物比例。蛋白質(zhì)在溶液中的吸附和聚集行為是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程,取決于蛋白質(zhì)的分子大小、構(gòu)象、穩(wěn)定性和功能等各個(gè)方面。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以從蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的角度，借助計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)更全面地理解蛋白質(zhì)在AF4通道中的行為。
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