微核胞質分裂阻滯細胞(CB-MNT)方法學探討和比較

畢潔 王如剛

外周淋巴細胞微核胞質分裂阻滯細胞(CB-MNT)是一種微核實驗法[1]，反映細胞遺傳學毒性的最敏感指標，作為職業(yè)性放射性作業(yè)接觸輻射損傷評價非常有意義的指標。微核胞質分裂阻滯細胞法微核實驗已在放射，毒理學領域應用[2]。據(jù)報道, 采用CB-MNT實驗法檢測外周血的淋巴細胞自發(fā)微核率(MNF)較比常規(guī)法敏感，檢測染色體斷片與落后的準確率更高[3]，更快速、簡便。對此于2016年 4 月對微核檢測的(CB-MNT)方法學做進一步研究探討，并比較兩種方法檢測的放射人員的淋巴細胞自發(fā)微核率(MNF)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 選取參加北京市疾病預防控制中心(CDC)職業(yè)健康體檢的85名從事放射線作業(yè)的在崗人員，且血、尿、肝腎功能正常者。其中男52名，女43名，18～55歲，平均年齡(37.30±9.25)歲，平均放射工齡為(9.22±10.57)年。分別采用常規(guī)培養(yǎng)法(C-MNT)和微核胞質分裂阻滯的2種培養(yǎng)方法檢測微核淋巴細胞。

1.2方法

1.2.1儀器： LRH恒溫培養(yǎng)箱，凈化工作臺、冷凍離心機、顯微鏡系統(tǒng)

1.2.2試劑： 微核培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基)、甲醇、冰醋酸、KCl低滲液、細胞松弛素B、二甲基亞GIemsa染液、二甲基亞砜(DMSO)。

1.2.3Cyt-B配制： 將Cyt-B用二甲基亞砜(DMSO)配成2 mg/mL的儲存液，-20 ℃保存，用時融化后，生理鹽水稀釋(10∶1)，加入培養(yǎng)基中。

1.2.4細胞培養(yǎng)： 取800 μL靜脈血接種于4 mL RPMI1640中混勻，置于(37±0.5)℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱，常規(guī)法組直接培養(yǎng)72 h收獲；CB法組在細胞培養(yǎng)至40 h在凈化工作臺中加入Cyt-B松胞素，繼續(xù)培養(yǎng)至68～72 h收獲。

1.2.5制片與染色： 收獲細胞后，以1 500 r/min離心5 min，棄掉培養(yǎng)上清；加入37 ℃預溫的0.075 mol/L KCl 5 mL,充分混勻后，立即加入1 mL新鮮配制的甲醇：冰醋酸(3∶1)混勻，低滲預固定，1 500 r/min離心5 min，棄上清液；加5 mL固定液固定20 min，經1 500 r離心，固定20 min，可重復一次后，離心棄上清液，留沉渣懸液0.5 mL垂直滴片，干燥后進行Giemsa染色。制備成完整的淋巴細胞微核片。

1.3鏡檢指標 (1)常規(guī)法觀察轉化的單核淋巴細胞[4]；(2)CB法觀察轉化雙核淋巴細胞：此時胞體較大，細胞漿豐富清晰，雙核是經第一次有絲分裂所致，形成位于同一個細胞內兩個獨立且核膜完整的細胞核[5]，兩核之間有很細的物質相連，不寬于主核直徑的1/4，兩個核的大小接近，染色深淺相同；(3)微核的判斷標準：微核位于已經轉化的完整細胞胞漿中，呈圓形或橢圓形，，游離于胞質中，或與主核相切，直徑小于主核的1/16～1/3，染色深淺與主核相同或略淺，無折光性；(4)觀察細胞：高倍鏡40 x計數(shù)CB法計數(shù)500個雙核淋巴細胞；常規(guī)法計數(shù)1 000個轉化的淋巴細胞，以千分率表示。

1.4統(tǒng)計學方法 資料數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件分析，數(shù)據(jù)用計算每組平均值和標準差(x±s)表示，采用配對樣本t檢驗，顯著性界值P<0.05。

2 結果

2.1常規(guī)法和CB法制片細胞形態(tài)比較 常規(guī)法的淋巴細胞易破裂，細胞之間界限不清,易堆積；CB法的雙核細胞胞膜完整，邊界清晰，分散均勻，胞質豐富，雙核微核淋巴細胞胞體膨大，均被染成紫紅色，微核染色略淺，易于辨認，圖2 中A圖雙核細胞中可見2個微核，B、C、D圖中可見 1個微核(圖1和2)。

圖1 常規(guī)法制片：單核淋巴細胞微核

注：外周血淋巴細胞微核(Giemsa染色,×40)圖2 CB法制片：雙核淋巴細胞微核

2.2CB-MNT組 與C-MNT組 培養(yǎng)外周淋巴細胞微核比較兩組的微核自發(fā)率 MNF具有明顯差異(t=-6.17P<0.01,表1)。

表1 CB-MNT 與C-MNT放射人員微核細胞自發(fā)率比較

注：MNF 微核細胞自發(fā)率(‰), CB-MNT法=微核數(shù)/500個CB雙核細胞,C-MNT法=微核數(shù)/1 000個單核淋巴細胞。

3 討論

3.1微核制片直接影響微核分析結果，與微核實驗制片質量有關，如何去除紅細胞而又保證淋巴細胞膜的完整性是制片關鍵。實驗室的低滲溫度選擇25～30 ℃，加入低滲液混勻即刻加入固定液，無需放置一段時間，這樣可破壞大多數(shù)紅細胞。采用(3∶1)固定液預固定使淋巴細胞得到適當膨脹并穩(wěn)定,克服了常規(guī)法低滲程度不穩(wěn)定，細胞有易破碎、形態(tài)不完整和成堆傾向。低滲操作時混勻要輕柔，避免把膨脹的淋巴細胞弄碎。各步離心后，應留存0.5 mL上清，先混勻，再加入各種液體，避免混勻時間過長。

3.2獲得較多數(shù)量的雙核細胞用于分析，是CB-MN法的關鍵。實驗室培養(yǎng)40 h，加入Cyt-B濃度為6 g/mL，68 h收獲。獲得了多量(45.0%～64.0%) 雙核細胞，此時獲得雙核細胞比例最高，和SURASERANIVONGSE等[6]研究結果一致。研究推薦誘發(fā)雙核細胞的Cyt-B最適濃度為6 g/mL[7]，適宜的濃度可以抑制細胞運動和胞質分裂，刺激胞核分裂，影響雙核細胞的產量。過高或過低可引起雙核細胞減少或核膜破裂，致無法識別雙核細胞。且研究顯示Cyt-B本身是一種霉菌Hdd的代謝產物，溶于二甲基亞砜(DMSO)中，低溫保存(-40～-70 ℃)。Cyt-B在細胞的有絲分裂中可阻止胞質分裂而不影響核分裂，它不是誘變劑，并不會誘發(fā)微核和染色體畸變[8]，微核主要來源于細胞分裂后期滯后的染色體斷片。實驗證實使用Cyt-B是安全的[9]，對外周微核自發(fā)率無明顯影響。

3.3加入Cyt-B必須準確，應用度量精確的微量加樣器。Cyt-B的配制、儲存與實驗過程中要注意避光，否則容易效價下降，影響雙核細胞的數(shù)量和完整性。微核胞質分裂阻滯細胞(CB-MNT)方法是檢測微核染色體斷裂或總體染色體丟失的生物學標志物的方法[10]。 目前外周淋巴細胞微核測定法多采用常規(guī)法和CB法，通過表1常規(guī)法和CB法比較顯示，CB法的微核自發(fā)率明顯高于常規(guī)法，這與相關報道一致[11]。

3.4因絕大多數(shù)淋巴細胞完成第1次有絲分裂需要48 h，此時細胞處于有絲分裂高潮。但常規(guī)法是72 h培養(yǎng)，大部分細胞已完成2次或以上有絲分裂，此時有絲分裂次數(shù)多，微核已經丟失；而CB法在培養(yǎng)40～44 h之間加入試劑松弛素B阻滯胞質分裂，松胞素使大部分淋巴細胞停留在第1次有絲分裂階段，微核不易丟失；常規(guī)法因只能判斷淋巴細胞是否轉化，不能識別第1次有絲分裂細胞而欠準確，而胞質分裂阻斷法克服了這一不足，獲得大量雙核CB細胞，較常規(guī)法對毒性物質更靈敏，大大提高了微核分析結果準確率。

通過研究，可見CB法觀察細胞僅為常規(guī)法的50%，每個標本只需計數(shù)500個雙核淋巴細胞，且雙核淋巴細胞胞體膨大，比轉化的單淋巴細胞容易識別，這樣節(jié)約閱片時間，提高工作效率。實驗表明微核胞質分裂阻滯細胞CB-MNT法操作簡便，易于觀察，效率更高，具有良好的可靠性和重復性，其敏感性及準確性均優(yōu)于常規(guī)法。CB-MNT已成為一項標準細則細胞遺傳學檢測實驗方法，作為接觸放射作業(yè)人員的必檢項目[12]，在職業(yè)輻射有害環(huán)境對人體遺傳毒性效應的評價中，建議實驗室可作為優(yōu)先選擇的實驗方法。

參考文獻

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