不同干燥方式對金線蓮黃酮體外活性影響的研究

劉 露，孫連立，裴運林，聶艷峰，張黎興，龍京洲

（廣東丸美生物技術(shù)股份有限公司，廣東 廣州 510663）

黃酮類化合物已被證實具有抗自由基［7］、抗氧化［8］、抑制絡(luò)氨酸酶活性［9］、抗病毒、抗腫瘤［10］、抗心律失調(diào)、肝保護、鎮(zhèn)痛等功效。近年來，國內(nèi)外對金線蓮黃酮的研究主要集中于黃酮的提取工藝［11］、黃酮苷元成分的檢測［12］以及不同品種［13］、種植方式［14］對黃酮含量的影響等方面，雖也有研究不同來源方式對金線蓮黃酮含量及其體外抗氧化的影響［15］，而有關(guān)不同干燥方式對金線蓮黃酮體外抑制黑色素合成和酪氨酸酶活性的研究較少。因此，探討不同干燥方式金線蓮黃酮體外抗氧化及對人黑色素瘤A375細胞酪氨酸酶活性、黑色素合成的影響對于指導(dǎo)其進一步開發(fā)利用具有重要意義。

目前關(guān)于不同干燥方式對中草藥色澤、質(zhì)構(gòu)和營養(yǎng)成分的影響研究報道較多，而關(guān)于干燥對其生物活性的影響研究較少。不同的干燥方式因溫度、時間等干燥條件的不同，對黃酮的結(jié)構(gòu)和活性的影響會有差異。李曉麗等［16］研究表明真空冷凍干燥后的無核紫葡萄比自然曬干、熱風干燥和蔭干的總黃酮含量高，抗氧化活性強。為此，本研究采用真空冷凍（FD）、和恒溫鼓風干燥（AD）兩種方式干燥金線蓮后提取黃酮，對比鮮樣，分析不同干燥方式對金線蓮黃酮體外抗氧化及抑制黑色素合成、酪氨酸酶活性的影響，旨在為金線蓮應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試金線蓮購于福建漳州市溢綠農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；蘆丁標準品，購自美國Sigma 公司，95%乙醇，甲醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、磷酸、磷酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵等均為分析純。

主要儀器：UV-2600紫外可見分光光度計，日本島津有限公司；FDU-2110真空冷凍干燥儀，日本東京理化株式會社；binder FD115熱泵干燥箱，賓德環(huán)境試驗設(shè)備（上海）有限公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司（IKA 中國）; 九陽JYL-C022E料理機，九陽股份有限公司；MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO；HWS-24電熱恒溫水浴箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；SPARK 10M多功能酶標儀，瑞士TECAN。

1.2 試驗方法

1.2.1 金線蓮干燥工藝 冷凍干燥工藝：鮮金線蓮→清洗→料理機粉碎→冷凍干燥72 h粉→碎過孔徑0.250 mm篩→ 金線蓮冷凍干燥樣品。

熱泵干燥工藝：鮮金線蓮→清洗→干凈→熱泵干燥72 h→粉碎過孔徑0.25 mm篩→金線蓮熱泵干燥樣品（水分含量8.75%）。

鮮樣：鮮金線蓮→清洗→粉碎→ 金線蓮鮮樣（水分含量94.96%）。

通過對國內(nèi)外相關(guān)研究的梳理和研究動態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)研究可以分成以下3個方面：1) 關(guān)于多模態(tài)語料庫創(chuàng)建和應(yīng)用研究；2) 關(guān)于翻譯工作坊研究；3) 關(guān)于教學(xué)與實訓(xùn)平臺創(chuàng)建研究.

1.2.2 金線蓮總黃酮的提取及測定 稱取一定量的2種干燥金線蓮樣品和鮮金線蓮樣品，在料液比1∶100，提取時間60 min，提取溫度70℃，乙醇濃度為80%的條件下提取3次，合并濾液，濃縮干燥得金線蓮黃酮。將冷凍干燥金線蓮黃酮記為FDAF，熱泵干燥金線蓮黃酮記為ADAF，鮮金線蓮黃酮記為FAF。金線蓮總黃酮含量測定采用比色法［17］。

1.2.3 不同干燥方式金線蓮黃酮的體外抗氧化活性 不同干燥方式金線蓮黃酮的DPPH自由基清除能力：稱取一定量金線蓮黃酮樣品配制成一定濃度溶液，在2 mL樣品溶液中加入2 mL用乙醇配制的0.8 mmol/mL DPPH溶液，混勻后置暗室中靜置30 min，于波長517 nm 處測定吸光度。計算DPPH 清除率：

式中，Ax為加入樣品溶液后的吸光度，Ax0為樣品溶液本底的吸光度，A0為空白對照液的吸光度。

不同干燥方式金線蓮黃酮的還原力：稱取一定量金線蓮黃酮樣品配制成一定濃度溶液，在2 mL樣品溶液中加入0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混合均勻，混合液50℃保溫20 min 后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻，3000 r/min 離心10 min。取上清液5 mL，加5 mL 蒸餾水和1 mL 0.1%FeCl3，混合均勻，10 min后于波長700 nm 處測定吸光度。

不同干燥方式金線蓮黃酮的總抗氧化力：FRAP 法測定金線蓮黃酮的抗氧化活性［18］。

1.2.4 不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞酪氨酸酶活性以及黑色素合成的影響［19］不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞生長活性的影響：取對數(shù)生長期細胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL（含1×104個細胞），置于37℃，5% CO2溫箱中培養(yǎng)。24 h后，待細胞貼壁為 80%左右，給藥組加入含有不同稀釋濃度的待測樣品（1 mg/mL金線蓮黃酮），每種細胞設(shè)多個劑量（10倍稀釋）處理，每個處理至少設(shè)3個平行孔?？瞻讓φ占尤肱c給藥處理等體積的溶劑。置于37℃，5% CO2溫箱中培養(yǎng)。作用24 h后，棄培養(yǎng)液，換新鮮無血清培養(yǎng)基100 μL，每孔加入10 μL WST-8溶

液，37℃孵育2 h，在檢測波長450 nm條件下測定光密度值（OD），根據(jù)以下公式計算人黑色素瘤A375細胞生長率：

不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞酪氨酸酶活性的影響：（1）選擇對數(shù)生長期A375細胞，將細胞濃度調(diào)整為 1×105cells/mL，加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL；（2） 次日，待細胞貼壁后，加入上述實驗得到的對人黑色素瘤A375細胞最低抑制濃度的金線蓮黃酮，空白對照加入無樣品培養(yǎng)基；（3） 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用 PBS 洗 2 遍，每孔加入1%Triton×100溶液100 μL，迅速置-80℃凍存 30 min；（4）隨后室溫融化使細胞完全裂解，37℃預(yù)溫后加入10 g/L多巴溶液 100 μL，37℃反應(yīng)0. 5 h；（5） 490 nm處測定吸光度值。每個濃度處理設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞黑色素合成的影響：（1）選擇對數(shù)生長期A375細胞，將細胞濃度調(diào)整為5×103個，加入24 孔細胞培養(yǎng)板，每孔1 mL；（2）待細胞貼壁后加入上述實驗得到的對人黑色素瘤A375細胞最低抑制濃度的金線蓮黃酮的培養(yǎng)液，每孔1 mL ，空白對照加入無樣品培養(yǎng)基；（3）培養(yǎng)4 d后，0.25%胰蛋白酶消化，將細胞收集入離心管離心 10 min （1000 r/min） ，傾去上清液；（4）再用PBS洗2次后，加入1 mol/L氫氧化鈉0.5 mL，在37℃作用48 h，充分裂解細胞和溶解黑色素顆粒，離心取上清；（5）每孔加入100 μL上面液體，在405 nm處測定吸光度值。每個濃度處理設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析運用SPSS18.0軟件，采用ANOVA進行統(tǒng)計分析，各處理間的差異比較用LSD法，運用Microsoft Excel 2010軟件繪制統(tǒng)計圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式對金線蓮黃酮含量的影響

不同干燥方式對金線蓮黃酮含量的影響如圖1所示，與FAF對比，不同干燥方式對金線蓮黃酮含量存在顯著影響，F(xiàn)DAF中黃酮含量24.55（±0.28）mg/g顯著高于ADAF（114.39±0.09 mg/g），ADAF黃酮含量比FDAF低70.56%。真空冷凍干燥具有保持原有生物活性、外觀色澤及形態(tài)，殘余水分低等特點，其提取得率接近于鮮樣提取，是獲得高品質(zhì)生物制品的優(yōu)良干燥方法。ADAF處理方式可能破壞掉部分黃酮分子結(jié)構(gòu)，使其含量降低。

2.2 不同干燥方式金線蓮黃酮的體外抗氧化活性

不同干燥方式金線蓮黃酮對DPPH自由基清除率、還原力和總抗氧化能力如表1所示。DPPH 自由基是反映抗氧化活性的重要指標，與FAF相比，干燥方式制得金線蓮黃酮提取物對DPPH 自由基均有一定的清除作用，且呈劑量依賴性，對DPPH自由基清除能力大小依次為：FAF＞FDAF＞ADAF，且不同干燥方式之間存在顯著差異。ADAF清除自由基能力平均比FDAF（33.80%）低27.25%，F(xiàn)AF與FDAF對DPPH清除能力無顯著差異。

在0.5～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，金線蓮黃酮的還原能力和總抗氧化能力與物質(zhì)濃度呈正比例關(guān)系，F(xiàn)DAF的還原力和總抗氧化能力均顯著強于ADAF。

在0.2～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，金線蓮黃酮的總抗氧化能力隨物質(zhì)濃度的增加不斷增加。其中FAF和FDAF的總抗氧化能力無顯著差異，ADAF的總抗氧化能力最弱，且與FAF、FDAF差異顯著。

圖1 不同干燥方式對金線蓮黃酮含量的影響

表1 不同干燥方式金線蓮黃酮的DPPH清除率、還原力和總抗氧化能力

2.3 不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞酪氨酸酶活性以及黑色素合成的影響

2.3.1 不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞生長活性的影響 不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞生長活性的影響如表2所示，由表2可知，金線蓮黃酮在一定濃度范圍內(nèi)對人黑色素瘤A375細胞具有較強的抑制生長作用，表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。其中FDAF、ADAF、FAF均在10 μg/mL時對人黑色素瘤A375細胞毒性最弱，分別為0.45%、3.75%和1.56%，有微弱的促生長作用。本實驗主要探討金線蓮黃酮體外抑制酪氨酸酶及黑色素合成活性的影響，因此選擇此濃度為考察不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞酪氨酸酶活性及黑色素合成影響的濃度。

2.3.2 不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞酪氨酸酶活性的影響 不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞酪氨酸酶活性的影響如圖2所示，與對照比較，F(xiàn)AF、ADAF和FDAF均對人黑色素瘤A375細胞酪氨酸酶活性有抑制作用，其抑制強度依次為AFA＞FDAF＞ADAF。其中FDAF比ADAF對人黑色素瘤A375細胞酪氨酸酶活性抑制作用高11.28%。

表2 不同濃度不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞增殖率的影響（%）

圖2 不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375 細胞酪氨酸酶活性的影響

2.3.3 不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞黑色素合成的影響 不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375細胞黑色素合成的影響如圖3所示，與對照比較，F(xiàn)AF、ADAF和FDAF均對人黑色素瘤A375細胞黑色素合成有抑制作用，抑制活性均顯著高于對照。其中ADAF抑制作用最強，高于FDAF 70.70%，這可能與ADAF中所含不同黃酮單體有關(guān)［20］。FAF與FDAF的抑制作用無顯著差異。

圖3 不同干燥方式金線蓮黃酮對人黑色素瘤A375 細胞黑色素合成的影響

3 結(jié)論與討論

通過不同干燥方式對金線蓮黃酮含量的影響研究發(fā)現(xiàn)，真空冷凍干燥制的金線蓮黃酮含量（24.55±0.28 mg/g）與鮮樣（25.25±0.68 mg/g）無顯著差異，且顯著高于恒溫鼓風干燥（14.39±0.09 mg/g）。真空冷凍干燥溫度低，利于黃酮類化合物的保存，而恒溫鼓風干燥則會在一定程度上破壞黃酮的分子結(jié)構(gòu)以致其含量降低，提取率下降。此結(jié)果與孫紅艷等和李翠麗等的研究結(jié)果［21-22］一致，冷凍干燥對比與恒溫鼓風干燥或熱風干燥有利于黃酮含量和功效成分的保留。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，不同干燥方式金線蓮黃酮體外均具有一定抗氧化活性，且呈劑量依賴型，F(xiàn)DAF活性顯著強于ADAF，且與FAF無顯著性差異。這與劉慧娟等的研究結(jié)果［23］一致，其在研究不同干制加工方式對荷葉茶黃酮類物質(zhì)含量及其抗氧化活性的影響時發(fā)現(xiàn)，荷葉總黃酮含量與FRAP和DPPH均為極顯著相關(guān)。另也有研究表明植物提取物抗氧化活性與其總黃酮含量具有相關(guān)性［24］。

真空冷凍干燥方式金線蓮黃酮對酪氨酸酶活性的抑制率顯著高于恒溫鼓風干燥，而抑制黑色素合成的活性顯著低于ADAF。這可能與ADAF中所含黃酮單體結(jié)構(gòu)有關(guān)。宋燁威［25］研究表明，從昆侖雪菊黃酮中分離出的3種活性單體化合物的體外抗氧化活性和抑制酪氨酸酶活性均不同。不同的干燥方式對金線蓮黃酮的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進而影響其活性，但是其內(nèi)在機理尚需進一步研究。

綜上所述，對比鮮樣，本實驗中真空冷凍干燥方式得到的金線蓮黃酮體外抗氧化及抑制酪氨酸酶和黑色素合成的活性最高，這與吳瓊等的研究結(jié)果［26］一致。由此可將冷凍干燥金線蓮黃酮作為研究其高價值應(yīng)用的手段之一。

參考文獻：

［1］ 中國科學(xué)院中國植物志編委會. 中國植物志［M］. 北京：科學(xué)出版社，2000：204．

［2］ 劉知遠，沈廷明，吳仲玉. RP-HPLC法同時測定福建產(chǎn)金線蓮中槲皮素、山柰素、異鼠李素的量［J］. 中草藥，2015，46（3）：432-434.

［3］ 尹澤楠，徐柯心，樊嬌嬌，等. 中國蘭科開唇蘭屬植物化學(xué)成分研究進展［J］. 環(huán)球中醫(yī)藥，2016，9（9）：1153-1160.

［4］ Zeng B Y，Su M H，Chen Q X，et al. Antioxidant and hepatoprotective activities of polysaccharides fromAnoectochilus roxburghii［J］. Carbohydrate Polymers，2016，153：391-398.

［5］ Zha ng J G，L iu Q，L iu Z L，et a l.Antihyperglycemic activity ofAnoectochilus roxburghiipolysaccharose in diabetic mice induced by high-fat diet and streptozotocin［J］. J Ethnopharmacol，2015，164：180-185.

［6］ 王建棟，王紅珍，張愛蓮，等. 金線蓮苷研究進展［J］. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（19）：1795-1798，1802.

［7］ Feng R Z，Wang Q，Tong W Z，et al. Extraction and antioxidant activity of flavonoids of Morus nigra［J］. International Journal of Clinical and Experimental Medicine，2015，8（12）：22328-22336.

［8］ William H，Narayanan N. Comparative evaluation of antioxidant activity of substituted flavones［J］. Asian Journal of Pharmaceutical & Clinical Research，2017，10（11）：288.

［9］ Kudo M，Kobayashinakamura K，Tsujinaito K. Bifunctional effects of O-methylated flavones from Scutellaria baicalensis Georgi on melanocytes：Inhibition of melanin production and intracellular melanosome transport［J］. Plos One，2017，12（2）：e0171513.

［10］ Kasala E R，Bodduluru L N，Barua C C，et al.Chemopreventive effect of chrysin，a dietary flavone against benzo（a）pyrene induced lung carcinogenesis in Swiss albino mice［J］.Pharmacological Reports Pr，2016，68（2）：310-318.

［11］ 李增富，張君誠，張杭穎，等. 超聲波輔助溶劑法提取金線蓮總黃酮工藝優(yōu)化［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2017，33（33）：148-158.

［12］ 張藏蔓，盧敬光，謝啟師，等. 基于UHPLCTOF-MS技術(shù)建立金線蓮的指紋圖譜及金線蓮苷的含量測定方法［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2018（1）：31-37.

［13］ 林波，張國芳，毛碧增，等. 5個金線蓮品種林下栽培性狀及品質(zhì)比較［J］. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58（9）：1584-1585.

［14］ 陳美香，武禮賓，曹立，等. 光質(zhì)對金線蓮組培苗生長和主要化學(xué)成分的影響［J］. 照明工程學(xué)報，2016，27（2）：112-117.

［15］ 吳巖斌，張超，張秀才，等. 不同來源金線蓮總黃酮含量及其體外抗氧化、降血糖活性研究［J］. 藥學(xué)服務(wù)與研究，2017，17（3）：206-209.

［16］ 李曉麗，王成，陶永霞，等. 干燥方式對無核紫葡萄品質(zhì)及抗氧化活性的影響［J］. 食品與機械，2017（11）：143-146，211.

［17］ Gao Q H，Wu C S，Wang M，et al. Effect of drying of jujubes（Ziziphus jujubaMill.） on the contents of sugars，organic acids，alpha-tocopherol，betacarotene and phenolic compounds［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60：9642-9648.

［18］ 周萌，馬玉榮，黃惠華. 不同品種大豆中的生物活性成分及其抗氧化活性的比較分析［J］. 現(xiàn)代食品科技，2015（4）：137-143.

［19］ Qamar Abbas，Hussain Raza，Mubashir Hassan，et al. Acetazolamide Inhibits the Level of Tyrosinase and Melanin：An Enzyme Kinetic，In Vitro，In Vivo，and In Silico Studies［J］.Chemistry & Biodiversity，2017，14（9）：1-13.

［20］ 劉慶慶，張薇娜，劉琴. 不同方法比較黃酮類化合物抗氧化性及其構(gòu)效關(guān)系分析［J］. 食品工業(yè)科技，2016，37（23）：109-114，175.

［21］ 孫紅艷，戚曉陽，王國輝，等. 不同處理對刺梨黃酮含量及其抑菌活性的影響［J］. 食品研究與開發(fā)，2016，37（5）：1-4.

［22］ 李翠麗，冀曉龍，許芳溢，等. 干燥方式對梨棗粉品質(zhì)特性的影響［J］. 中國食品學(xué)報，2014，14（12）：121-127.

［23］ 劉慧娟，鄭云展，陳燕霞，等. 微波真空干制加工對荷葉茶酚類物質(zhì)含量及其抗氧化活性的影響［J］. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2016，34（3）：40-45.

［24］ Hossain M A，Mizanur R S M. Total phenolics，flavonoids and antioxidant activity of tropical fruit pineapple［J］. Food Research Intermational，2011. 44（3）：672-676.

［25］ 宋燁威. 昆侖雪菊中美白活性物質(zhì)研究［D］. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：24-26.

［26］ 吳瓊，劉奕，吳慶園，等. 不同干燥方式對葛根全粉抗氧化性能和香氣成分的影響［J］. 食品科學(xué)，2017，38（6）：202-208.